GPER抑制星形胶质细胞活性减少OIR小鼠视网膜新生血管生成的机制研究

目的探究在氧诱导下的新生小鼠视网膜缺血模型(oxygen-induced retinopathy,OIR)中,G蛋白偶联雌激素受体(G proteincoupled estrogen receptor,GPER)减少OIR小鼠视网膜新生血管生成的机制。方法42只新生小鼠采用随机数字表法分为4组:常氧对照组(n=11)、OIR组(n=11)、G-1(GPER激动剂)组(n=10)和溶剂对照组(n=10)。出生后17 d(P17)时,眼球冰冻切片免疫荧光染色观察常氧对照组小鼠GPER在视网膜分布情况。G-1组和溶剂对照组在P12~P15时分别腹腔注射给予G-1[50μg/(kg·d)]或玉米油溶剂,P17时视网膜铺片免疫荧光染色观察视网膜血管标志物(IB4)、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(glia fibrilary acidic protein,GFAP)表达,蛋白免疫印迹法定量检测视网膜血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、GFAP、炎症因子TNF-α、IGF-1、IL1-β蛋白表达情况。结果GPER存在于小鼠视网膜全层,在视网膜神经节细胞层与星形胶质细胞标志物GFAP共染。与常氧对照组相比,OIR组小鼠视网膜出现新生血管与无血管区,且GPER、VEGFA和GFAP表达增多,差异具有统计学意义(P<0.05);与溶剂对照组相比,G-1组视网膜新生血管生成减少,VEGFA、GFAP、TNF-α、IGF-1、IL1-β蛋白表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论GPER能抑制星形胶质细胞活性,减少VEGFA、炎症因子释放,减少OIR小鼠视网膜新生血管生成。

三种方法对大鼠视网膜固定效果的比较研究

目的研究三种不同方法对大鼠视网膜石蜡切片的固定效果。方法根据离体眼球的不同固定方法,将9只SD大鼠随机分为A组(改良固定液固定,n=3)、B组(4%多聚甲醛固定,n=3)和C组(4%多聚甲醛心脏灌注法固定,n=3)。24 h后制作标本进行苏木精-伊红染色,分析比较固定效果。结果 A组固定的眼杯不变形,B组固定的有少许变形,C组固定的基本不变形。显微镜观察显示A组眼球视网膜各层组织结构完整,B组和C组视网膜均有断层、分离和脱片等现象。结论改良固定液固定眼球的方法优于单纯4%多聚甲醛和4%多聚甲醛心脏灌注固定的方法,适用于视网膜石蜡切片的后期研究。

Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型葡萄糖浓度和培养时间的筛选

目的筛选Wistar大鼠视网膜神经元高糖模型的葡萄糖浓度及培养时间。方法取出生1~3 d Wistar大鼠分离视网膜神经元进行传代培养,尼氏染色法鉴定细胞;实验分5组:A组培养液葡萄糖浓度为0 mmol·L^(-1)(正常对照组),B组浓度为10 mmol·L^(-1),C组浓度为15 mmol·L-1,D组浓度为25 mmol·L^(-1),E组浓度为35 mmol·L^(-1)。分别培养24 h、48 h、72 h后用MTT法检测各组细胞OD值,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。结果倒置显微镜观察分离培养细胞,大部分细胞于接种24 h后贴壁,少数细胞长出较短的突起,并有向中央聚集生长的现象。2~3 d后长出突起的神经元数目增多,突起长度增加,约为自身胞体长度的1倍。培养5~7 d后神经元突起进一步增多、变长。经尼氏染色后细胞质呈蓝紫色,尼氏小体颗粒状结构清晰。非神经元细胞胞质基本不着色,细胞核呈淡紫色、圆形,核仁清晰可辨,神经元率达91%。各实验组在培养24 h后OD值均低于正常对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。随培养时间延长OD值继续下降,48 h后各组OD值比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组OD值明显下降,与A组比较差异有统计学意义(P<0.05),E组下降更明显,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01)。72 h后各组OD值比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组及E组与A组比较差异有统计学意义(均为P<0.01)。各组在培养24 h后视网膜神经元凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。48 h后各组凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05);D组凋亡率明显升高,与A组比较差异有统计学意义(P<0.05);E组凋亡率升高更明显,与A组比较差异有统计学意义(P<0.01),且与D组比较亦有统计学意义(P<0.05)。72 h后各组凋亡率比较差异有统计学意义(P<0.01);其中B组及C组与A组比较差异无统计学意义(均为P>0.05),D组及E组与A组比较差异有统计学意义(均为P<0.01)。结论葡萄糖浓度为25 mmol·L^(-1)培养48 h是视网膜神经元高糖模型最佳葡萄糖浓度及干预时间。

重组腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对SD大鼠视网膜神经细胞及血管内皮细胞的影响

目的:研究腺伴随病毒载体介导Kringle5基因对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUC)及视网膜神经细胞影响作用。方法:亚克隆构建pSNAV-Kringle5-gfp载体,腺伴随病毒包装形成rAAV-Kringle5-gfp;HUC培养及SD大鼠视网膜神经细胞培养;按设计分为试验组、阴性对照组和空白对照组;聚合酶链反应(PCR),MTT法对各组进行细胞活力测定;荧光显微镜照相。结果:腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对HUC有抑制作用,实验组与对照组比较P<0.01,实验组与空白对照组比较P>0.05;腺伴随病毒载体介导Kringle5基因产生Kringle5物质对SD大鼠视网膜神经细胞实验组和空白对照组没有影响,实验组与对照组及实验组与空白对照组比较P>0.05。结论:腺伴随病毒载体介导Kringle5基因能够对新生血管有抑制作用而对视网膜神经细胞无不良影响作用。

枸杞多糖对糖尿病大鼠视网膜E-selectin及ET表达的实验研究

目的探讨枸杞多糖对糖尿病大鼠视网膜E-选择素及内皮素表达作用的影响。方法将清洁级SD大鼠30只造模,随机分为模型对照组、高剂量组、低剂量组,用药2周后处死,用免疫组化法检测视网膜中E-选择素及内皮素。结果 3组造模前后,血糖持续性增高差异有统计学意义(P<0.05);内皮素各组对比,用药组ET表达均降低,但低剂量组与模型组间差异无统计学意义(P>0.05),高剂量与模型组间差异有统计学意义(P<0.05);E-selectin比较,3组差异无统计学意义(P<0.05)。结论枸杞多糖对糖尿病大鼠的降糖效果较为明显,特别是大剂量组更为明显,考虑为LBP的抗氧化作用对内皮细胞的保护所致。

急进高原大鼠视网膜功能变化及白藜芦醇干预效应研究

目的建立大鼠急性低压缺氧模型,探讨急进高原大鼠视网膜形态学变化及白藜芦醇对大鼠视网膜低氧损伤的保护作用及机制。方法将54只健康SD大鼠随机分成3组:常氧对照组、低氧模型组、低氧+白藜芦醇干预组。常氧对照组大鼠在常氧环境下正常喂养(西宁,海拔2260 m),低氧模型组及低氧+白藜芦醇干预组大鼠置于低压氧舱内(模拟5000 m的海拔高度),每日持续24 h。白藜芦醇干预组每日腹腔注射白藜芦醇(30 mg/kg,每日1次)。7 d后剥离视网膜。HE染色,光镜下观察大鼠视网膜组织形态;酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定大鼠视网膜组织中过氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)的活性。RT-PCR方法检测低氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)mRNA表达。结果与常氧对照组相比,光镜下低氧模型组大鼠视网膜形态发生明显变化;低氧模型组大鼠视网膜组织中GSH-PX活性显著下降(P<0.05),SOD活性有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05),HIF mRNA表达量显著增加(P<0.01);低氧+白藜芦醇干预组GSH-PX、SOD活性有所下降,HIF mRNA表达量轻度减少,差异无统计学意义(P>0.05)。与低氧模型组相比,低氧+白藜芦醇干预组GSH-PX活性增强(P<0.05),SOD活性升高,但差异无统计学意义(P>0.05);HIF mRNA表达量明显减少(P<0.01)。结论急性低压缺氧环境影响大鼠的视网膜功能,而白藜芦醇对此损伤有干预作用,可能与其增强SOD与GSH-PX的酶活性,增强对自由基的清除以及调节HIF的表达有关。

表皮生长因子及其受体和erb-B在鼠视网膜的表达

用免疫组织化学方法,对鼠视网膜的表皮生长因子(EGF)及其受体(EGF-R),和erb-B的表达,作了研究.结果表明:①EGF,EGF-R和erb-B分别在视网膜各层有不同表达;②EGF免疫反应着色不强,但有特异性地均匀分布在节细胞层(GCL)、内核层(INL)、外核层(ONL)和视网膜色素上皮层(RPE);③EGF-R免疫反应着色以GCL和INL的细胞明显,分布于细胞浆和细胞核,以细胞核更明显;④erb-B的分布类似EGF.但在ONL内出现一条较明显的着色带.对以上结果的可能意义进行了讨论.

氧诱导新生小鼠视网膜病变中血管新生和氧应激相关基因表达的变化

目的建立氧诱导新生小鼠视网膜病变(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型,观察视网膜血管新生情况,检测OIR病变过程中调控血管新生和氧应激相关基因表达的变化。方法新生小鼠出生后d 7,置75.5%高氧环境中饲养5 d,再返回正常氧环境继续饲养5 d,建立OIR模型。运用视网膜免疫荧光染色检测OIR小鼠视网膜中血管新生情况;运用Real-time PCR技术检测基因表达情况。结果视网膜免疫荧光染色结果显示,OIR小鼠视网膜在高氧诱导视网膜微血管消退的基础上,相对缺氧状态诱导出现明显的新生血管。Real-time PCR结果显示OIR模型小鼠视网膜中:血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受体(VEGFR)家族中:VEGFA、VEGFD、VEGFR1、VEGFR2的基因表达分别上调1.73、1.71、1.48、1.80倍;血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)及其受体(PDGFR)家族中:PDGFA、PDGFB、PDGFRa、PDGFRb的基因表达分别上调1.29、1.71、1.42、1.42倍;基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)中的MMP2基因表达上调1.48倍;参与调控氧化应激的核转录因子Nrf2[nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2]及受其调控的下游基因包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶(glutamatecysteine ligase,GCL)的催化(GCLC)和调节(GCLM)亚单位的基因表达均下调,表达量分别为正常的0.28、0.76、0.49。结论 OIR小鼠视网膜病变过程中,视网膜中促进血管新生相关基因表达上调,而抗氧化相关基因表达下调。

山茱萸多糖对衰老小鼠视网膜相关因子表达的影响

目的观察山茱萸多糖对D-半乳糖致衰老小鼠视网膜组织相关因子表达的影响。方法昆明小鼠90只,随机分为3组,每组30只,其中给药组:100mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖45d后,按照0.4g·kg-1体质量经胃给予山茱萸多糖,连续给药30d;衰老组:100mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖45d后,经胃给予相当于给药组药量体积的温开水连续30d;对照组:每日上午侧腹部皮下注射生理盐水,剂量参照衰老组D-半乳糖给药量,45d后经胃给予相当于给药组药量体积的温开水连续30d。于末次给药后次日处死小鼠,测定小鼠视网膜组织超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)含量及总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC),RT-PCR法测定小鼠视网膜组织SIRT1、p53mRNA的表达。结果对照组视网膜组织中的T-SOD和T-AOC分别为(341.27±10.22)U·mgprot-1和(287.40±10.70)U·mgprot-1,明显高于衰老组的(66.92±22·74)U·mgprot-1和(104.36±6.76)U·mgprot-1及给药组的(78.61±27.70)U·mgprot-1和(209.44±11.11)U·mgprot-1(均为P<0.05),而给药组与衰老组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与对照组小鼠视网膜组织中SIRT1、p53mRNA相对表达量(0.64±0.10、0.12±0.03)相比,衰老组及给药组的SIRT1mRNA表达下降,相对表达量分别为0.13±0·05、0.24±0.07,p53mRNA的表达上升,相对表达量分别为0.82±0.06、0.54±0.16,给药组与衰老组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论随着机体的衰老,SIRT1在视网膜组织中的表达减少,p53在视网膜组织中的表达增多;山茱萸多糖尚不能有效地提高D-半乳糖致衰老小鼠视网膜组织中SIRT1基因的表达。

黄芪对大鼠视网膜缺血再灌注损伤中HIF-1α和VEGF表达的影响

目的:研究中药黄芪对不同时间段大鼠视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)实验过程中缺氧诱导因子1-α(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:将78只SD大鼠分为正常组、黄芪组和缺血再灌注组,前房加压法造模,黄芪组及缺血再灌注组分为6h、12h、24h、48h、3d和7d以上6各时间段处死大鼠,取材,行免疫组织化学法测定大鼠视网膜缺血再灌注损伤后大鼠视网膜中HIF-1α和VEGF表达的变化。结果:正常组大鼠视网膜中均未观察到HIF-1α和VEGF的表达,缺血再灌注组6只中均可检测到HIF-1α的表达,缺血再灌注6h即可检测到HIF-1α表达,24h达到相对高峰,黄芪组各时间段表达低于缺血再灌注组,差异均有统计学意义(P<0.05)。缺血再灌注后12h后缺血再灌注组和黄芪组开始出现VEGF的表达,48h达到高峰。各时间点黄芪组VEGF表达水平明显低于缺血再灌注组视网膜中VEGF表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:中药黄芪能改善对视网膜缺血再灌注损伤所致的相关缺血缺氧损害,可能通过抑制RIRI后视网膜中HIF-1α与VEGF的表达为主要机制,缺氧诱导因子-1α与内皮生长因子的表达率均随着RIRI时间的推移而表达升高,HIF-1α可能通过上调VEGF的蛋白表达,它们共同参与了损伤视网膜缺血再灌注的发生以及发展。

中药单体葛根素对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子、蛋白激酶的影响

目的通过观察糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)、蛋白激酶(PKC)的表达,探讨中药单体葛根素对于抑制糖尿病大鼠视网膜病变的作用机制。方法建立糖尿病大鼠模型,随机分为正常组(正常SD大鼠)、模型组、葛根素组、血塞通组。正常组给予正常饲养20 d;模型组给予注射等量生理盐水,10mg/kg,1次/d;葛根素组给予腹腔内注射葛根素10 mg/kg,1次/d;血塞通组给予腹腔内注射血塞通10 mg/kg,1次/d,后3组每组连续注射20 d。在第20 d过量麻醉后处死上述大鼠,轻摘眼球,进行免疫组织化学染色,检测视网膜组织中VEGF、PKC的表达,并对其进行观察比较。结果模型组PKC蛋白表达及VEGF表达均增加,葛根素组、血塞通组大鼠视网膜组织中PKC蛋白表达及VEGF表达均降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01),葛根素、血塞通两组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论中药单体对糖尿病大鼠视网膜血管内皮生长因子(VEGF)、蛋白激酶(PKC)有明显的抑制作用。

化合物M-286对AGE诱导大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡的影响

目的观察化合物M-286对糖基化终产物(advanced glycosylation end product,AGE)诱导视网膜血管内皮细胞(retinal microvascular endothelial cell,RMEC)凋亡的影响。方法体外培养RMEC,以不同浓度的化合物M-286培养液作用于AGE处理的RMEC,MTT法检测RMEC存活率,流式细胞术检测凋亡细胞比例及细胞内ROS含量。结果不同浓度的化合物M-286可在不同程度上保护AGE处理后的RMEC,与AGE组比较,能够明显提高细胞存活率(P<0.05)。与空白对照组比较,AGE处理24 h后RMEC凋亡比例明显升高;不同浓度的化合物M-286处理后细胞凋亡比例均有所下降,与AGE组比较,差异具有统计学意义(P<0.05);AGE处理24 h后,ROS水平明显升高,化合物M-286可降低AGE处理后细胞内ROS水平,与AGEs组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论化合物M-286可通过抑制AGE诱导RMEC中ROS的产生,减少RMEC凋亡。

miR-218在高浓度葡萄糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞凋亡中的作用

目的探讨miR-218在高浓度葡萄糖诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞(rat retinal microvascular endothelial cells,rRMECs)凋亡中的作用及其相关机制。方法将rRMECs分为对照组、高糖组、miR-218阴性抑制组和miR-218抑制组。对照组细胞用DMEM低糖培养基培养;高糖组在培养基中添加D-葡萄糖,终浓度为25 mmol·L^(-1);miR-218抑制组及miR-218阴性抑制组是在高糖组培养基的基础上,按照说明书操作,利用Lipo2000将miR-218抑制剂和阴性抑制剂转染rRMECs,共同孵育24 h。提取各组rRMECs总RNA并分析miR-218含量,检测细胞活力,计算细胞凋亡率以及采用Western blot检测各组rRMECs Caspase-3蛋白表达,利用SPSS 19.0统计学软件对实验数据进行单因素方差分析并进行两两比较。结果对照组、高糖组、miR-218阴性抑制组、miR-218抑制组miR-218相对表达量分别为1.00±0.08、1.48±0.12、1.46±0.14、1.03±0.08;细胞活力分别为100.0%、(72.3±7.5)%、(70.7±9.3)%及(98.4±9.4)%;与对照组相比,高糖组和miR-218阴性抑制组的miR-218相对表达量明显升高(均为P<0.05),miR-218抑制组的miR-218相对表达量较对照组变化不显著(P>0.05);高糖组和miR-218阴性抑制组rRMECs细胞活力与对照组相比均明显降低(均为P<0.05),miR-218抑制组与对照组相比细胞活力未见明显变化(P>0.05)。对照组、高糖组、miR-218阴性抑制组、miR-218抑制组rRMECs细胞凋亡率分别为(2.3±0.0)%、(20.3±3.1)%、(23.1±3.2)%及(2.9±0.1)%;高糖组和miR-218阴性抑制组的细胞凋亡率均显著高于对照组(均为P<0.05);而miR-218抑制组与对照组相比,细胞凋亡率变化不明显,差异无统计学意义(P>0.05)。对照组rRMECs Caspase-3蛋白相对表达量为(18.6±2.3)%、高糖组为(43.3±4.5)%、miR-218阴性抑制组为(41.6±3.9)%、miR-218抑制组为(20.0±2.8)%。与对照组相比,高糖组和miR-218阴性抑制组的Caspase-3蛋白相对表达量明显增加(均为P<0.05),miR-218抑制组Caspase-3蛋白相对表达量变化不明显(P>0.05)。结论高浓度葡萄糖能促使rRMECs miR-218相对表达量增高;当miR-218相对表达量增高时,细胞凋亡明显,细胞活力显著下降,细胞内Caspase-3蛋白的相对表达量明显上调。

衰老小鼠视网膜中FOXO1的表达及山茱萸多糖的干预作用

目的:通过山茱萸多糖对D-半乳糖致衰老小鼠视网膜中FOXO1基因表达的影响,探讨其在改善视网膜衰老变化方面的作用及可能机制。方法:实验动物随机分为3组,衰老模型组:100mg.kg-1.d-1皮下注射D-半乳糖45d后,经胃给予相当于给药组药量体积的温开水连续30d;对照组:每日侧腹部皮下注射生理盐水,剂量参照衰老模型组D-半乳糖给药量,45d后经胃给予相当于给药组药量体积的温开水连续30d;山茱萸多糖给药组:衰老造模(按衰老模型组给药)成功后,按照0.4g.kg-1体质量经胃给药,连续给药30d。RT-PCR和Western blotting法测定小鼠视网膜组织FOXO1、P53mRNA与蛋白的表达,以观察山茱萸多糖对衰老模型小鼠上述指标的影响。结果:各组视网膜组织的FOXO1、P53mRNA和蛋白与对照组相比D-半乳糖致衰老模型小鼠视网膜组织中FOXO1mRNA及蛋白的表达上升,分别为0.541±0.04、0.566±0.04,P53mRNA及蛋白的表达上升,分别为0.822±0.06、0.866±0.07,给药组FOXO1、P53mRNA及蛋白的表达与D-半乳糖致衰老模型组无差异(P>0.05)。结论:随着机体的衰老变化FOXO1,P53在视网膜组织中表达增多;山茱萸多糖不能有效地影响视网膜组织中FOXO1的表达。

Lazaroid对早期糖尿病大鼠视网膜的保护作用

目的探讨Lazaroid对早期糖尿病大鼠视网膜的保护作用。方法20只SD大鼠采用链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病动物模型,10只于成模2周后经尾静脉注射Lazaroid进行干预(糖尿病Lazaroid干预组),其余10只不予干预(糖尿病不干预组)。另设立不建模且不干预的空白对照组(n=10)。分别于实验前后进行视网膜电流图检查,对视网膜组织切片进行透射电子显微镜观察。结果糖尿病Lazaroid干预组和空白对照组在实验前后的暗适应最大电反应b波、振荡电位(OPs)振幅值差异无统计意义(P>0.05)。糖尿病不干预组实验前后的暗适应最大电反应b波、OPs振幅值明显下降(P<0.05);与空白对照组比较,成模4周后的糖尿病不干预组大鼠的神经节细胞内出现线粒体的改变;而同期糖尿病Lazaroid干预组大鼠视网膜未出现明显神经节细胞的改变。结论糖尿病动物模型在建立的早期已经出现视觉电生理的变化,并且有神经细胞超微结构的改变;全身使用Lazaroid对早期糖尿病大鼠模型视网膜神经元具有保护作用。

积雪草酸对原代大鼠视网膜神经节细胞低氧损伤的保护作用研究

目的研究积雪草酸(AA)在体外大鼠视网膜神经节细胞(RGC)低氧损伤中的保护作用,并探讨其作用机制。方法选取出生1~3 d的新生SD大鼠,解剖游离出视网膜,利用Thy1.1抗体包被法纯化获取RGC,定量聚合酶链反应(q PCR)鉴定RGC的纯度。体外给予原代RGC不同时长(0、12、24、48 h)的低氧(1%O2)损伤刺激,TUNEL检测RGC的凋亡情况。预先给予原代RGC不同浓度(0、5、10、20、50μmol/L)的AA干预后,再以1%O_2培养48 h,通过TUNEL凋亡检测、CCK-8细胞增殖检测研究AA在RGC凋亡中的作用。利用Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统对凋亡相关蛋白c-Abl进行检测。结果低氧条件下(1%O2),RGC的TUNEL凋亡阳性细胞数随着低氧刺激时间的递增呈梯度增加。低氧环境下(1%O2),给予不同浓度的AA干预,TUNEL结果显示10μmol/L和20μmol/L AA处理后,RGC凋亡细胞数显著减少(P值均<0.01)。同时CCK-8结果显示10μmol/L和20μmol/L AA干预后,RGC的增殖活力明显升高(分别为P<0.05,P<0.01)。Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统结果表明,AA在原代RGC低氧损伤中可以明显抑制c-Abl的磷酸化水平。结论体外低氧刺激时,AA可以减少RGC的凋亡,对原代RGC的低氧损伤有一定的保护作用,其作用机制与抑制c-Abl的磷酸化激活相关。

活体情况下评价载脂蛋白A1对小鼠视网膜血管生成的影响

【目的】用眼底照相及荧光造影探讨载脂蛋白A1(apoA1)正常生理状态下及缺氧状态下对小鼠视网膜血管生长情况的影响。【方法】在正常生理条件(常氧)下,通过apoA1^(+/+)鼠、apoA1^(-/-)鼠与C57/BL6J小鼠对比,分别在第17天末(幼年期)、8周龄(成年期)、20周龄(中老年期),进行体内实验:①小鼠眼底照相(观察血管形态)及②荧光造影(FFA)(观察血管渗漏情况,分析视网膜平均血管密度、孔隙率及连接点个数);并分别制备它们缺氧条件下的氧诱导的视网膜病变(OIR)模型进行实验:①眼底照相;②荧光眼底血管造影。【结果】常氧下,①眼底照相示3种小鼠不同时期视网膜血管形态相似;②FFA提示3种小鼠不同时期毛细血管分布均匀,无明显无灌注区及荧光渗漏等表现。组间无统计学差异(P_(血管密度)=0.59>0.05,P_(孔隙率)=0.52>0.05);缺氧状态下,①眼底照相示:视网膜主要血管明显迂曲扩张;②FFA示3组均有静脉串珠样改变,毛细血管分布不均,见无灌注区及荧光渗漏等表现。对血管密度、孔隙率和连接点个数进行分析,组间有显著差异(P_(血管密度)=0.0016<0.01,P_(孔隙率)=0.0019<0.01,P_(连接点个数)=0.0013<0.01)。【结论】通过小鼠视网膜成像系统在活体情况下发现在生理条件下,apoA1基因表达量的多少对小鼠正常视网膜血管生长无影响。缺氧状态下,apoA1表达量增高可使小鼠视网膜无灌注区面积减少,荧光渗漏减少。

人参皂苷提取物对大鼠视网膜Müller细胞的影响

目的研究人参皂苷对体外纯化培养大鼠视网膜Müller细胞的影响,为人参治疗糖尿病性视网膜病变(DR)的物质基础研究筛选合适的浓度。方法用不同浓度的人参皂苷提取物及人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1对照品分别干预体外纯化培养的大鼠视网膜Müller细胞48 h,MTT法检测细胞增殖抑制率。结果测得人参皂苷提取物及人参皂苷Re、Rg1、Rb1对照品的IC50分别为0.618,0.489,0.653,0.553 mg/ml,给药浓度为1 mg/ml时,测得最高细胞增殖抑制率分别为56.8%,71.0%,59.4%,68.0%。结论人参皂苷提取物及人参皂苷Re、Rg1、Rb1对照品对大鼠视网膜Müller细胞均有一定抑制作用,且具有剂量依赖性,所测IC50值为进一步研究人参皂苷提取物治疗DR作用机制的有效浓度提供依据。

心脏灌流固定在大鼠视网膜石蜡切片中的应用

【摘要】目的评价心脏灌流固定视网膜在大鼠视网膜石蜡切片中的可靠性，优化大鼠视网膜石蜡切片的固定方法。方法实验研究。于2013年6—12月在山东中医药大学眼科研究所，根据固定方法的不同分为A组和B组，A组为常规固定方法，B组为心脏灌流固定。24h后制作标本进行苏木精一伊红染色，分析比较固定效果。结果A组均有眼球收缩变形，视网膜脱离。B组经心脏灌流固定的大鼠眼球外形无明显变形及收缩，视网膜未见明显脱离，显微镜下视网膜组织结构清晰，各层细胞排列紧密，无明显裂隙。结论多聚甲醛心脏灌流固定大鼠视网膜可保持视网膜无脱离、结构完整，是用于动物实验固定大鼠视网膜的一种有效稳定的方法。

N-乙酰-5-羟色胺对视网膜缺血再灌注损伤大鼠视网膜中肿瘤坏死因子-α表达的影响

目的观察N-乙酰-5-羟色胺(NAS)对视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)大鼠视网膜中肿瘤坏死因子(TNF)-α蛋白表达的影响,探讨其可能机制。方法采用随机数字表法将90只健康雄性Sprague-Dawley大鼠分为假手术组(10只)、RIRI组(40只)、NAS组(40只)。以右眼为实验眼。RIRI组、NAS组大鼠采用前房高眼压法建立RIRI模型。NAS组大鼠分别于建模前及建模后30 min腹腔注射10 mg/kg NAS。建模后6、12、24、72 h,苏木精-伊红染色观察各组大鼠视网膜组织病理变化,计数视网膜神经节细胞(RGC);免疫组织化学染色、蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各组大鼠视网膜中TNF-α、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白相对表达量。组间差异采用单因素方差分析。采用一般线性回归法分析NAS干预后TNF-α蛋白相对表达量变化与Nrf2、HO-1蛋白相对表达量变化的相关性。结果光学显微镜观察发现,建模后6、12、24 h,RIRI组大鼠视网膜水肿;NAS组大鼠视网膜厚度显著薄于RIRI组,差异有统计学意义(F=9.645、477.150、2.432,P<0.01)。建模后6、12、24、72 h,NAS组大鼠视网膜RGC计数显著高于RIRI组,差异有统计学意义(F=12.225、12.848、117.655、306.394,P<0.05)。免疫组织化学染色、Western blot检测结果显示,建模后6 h,RIRI组大鼠视网膜中TNF-α蛋白相对表达量较假手术组显著增加,12 h达较高水平,24、72 h下降,但均显著高于假手术组,差异有统计学意义(免疫组织化学染色:F=105.893、1356.076、434.026、337.351,P<0.01;Western blot:F=92.906、534.948、327.600、385.324,P<0.01);建模后不同时间点,NAS组大鼠视网膜中TNF-α蛋白相对表达量显著低于RIRI组(免疫组织化学染色:F=15.408、570.482、21.070、13.767,P<0.05;Western blot:F=12.618、115.735、13.176、111.108,P<0.05),但仍高于假手术组(免疫组织化学染色:F=40.709、151.032、156.321、216.035,P<0.01;Western blot:F=33.943、79.729、74.057、64.488,P<0.01),差异均有统计学意义;建模后12 h,NAS组大鼠视网膜中Nrf2(免疫组织化学染色:F=51.122,P<0.05;Western blot:F=33.972,P<0.05)、HO-1(免疫组织化学染色:F=30.750,P<0.05;Western blot:F=18.283,P<0.05)蛋白相对表达量显著高于RIRI组,差异均有统计学意义。一般线性回归分析结果显示,RIRI组、NAS组大鼠视网膜TNF-α^(+)细胞数差值与Nrf2^(+)、HO-1^(+)细胞数差值均呈负相关(r^(2)=0.923、0.936,P<0.01)。结论NAS可抑制RIRI大鼠视网膜中TNF-α蛋白表达,减轻RIRI,其机制可能与Nrf2/HO-1通路有关。