广东省实验小鼠自然感染鼠诺如病毒的调查

目的了解广东省实验小鼠自然感染小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的情况。方法随机抽取广东省7个繁育设施的小鼠206只,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测其感染MNV的情况。结果共检测小鼠盲肠内容物206份,阳性样本为77份,阳性率为37.38%。3个设施的小鼠感染MNV,各品系小鼠易感性差异无显著。结论证实广东省小鼠存在MNV感染,部分设施小鼠MNV感染率很高,需加强动物的饲养管理。RT-PCR方法可以应用于MNV感染检测。

不同途径感染小鼠诺如病毒对小鼠抗体水平和病毒复制的影响

目的探讨小鼠诺如病毒(MNV)不同接种途径对小鼠血清抗体水平和病毒复制的影响。方法 MNV(4×104拷贝/μL)分别以静脉、腹腔联合注射(iv+ip)、饮水(dw)、灌胃(ig)3种不同途径接种ICR小鼠,各组于感染前(0 d)、感染后3 d、6 d、14 d、25 d、34 d、51 d随机剖检2~3只小鼠,收集血清和心、肝、脾、肺、肾、脑、胃肠内容物,利用酶联免疫吸附法(ELISA)和实时定光定量(q RT-PCR)方法分别检测血清抗体和病毒载量。结果所有感染小鼠均无明显临床症状。3种途径接种的小鼠在感染后25 d均可检测到特异性抗体。抗体产生初期以ig接种组抗体水平最高,随后iv+ip接种组抗体水平上升幅度最大并在51 d高于其它接种组。小鼠接种MNV 3 d可在3组接种鼠的胃肠道、脾、脑中检测到病毒核酸,各组的组织脏器病毒载量有差异,其中iv+ip接种组盲肠内容物(3~51 d)、脾(6 d)和肝(14 d)病毒载量高于其它两组。结论不同接种途径对MNV在小鼠抗体水平和病毒载量影响较大。iv+ip感染效果较好,可作为MNV病毒感染模型的有效接种方式。血清抗体ELISA检测结合盲肠内容物核酸检测有利于MNV早期监测。

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。

鼠诺如病毒在新生小鼠坏死性小肠结肠炎模型中的保护作用

目的探讨鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)在新生小鼠坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)模型中的作用,并分析其可能的作用机制。方法将75只新生1 d的C57BL/6J小鼠按随机数字表法分为3组(n=25):正常对照组、给予PBS的NEC模型组(PBS+NEC组)和给予MNV干预的NEC模型组(MNV+NEC组)。正常对照组与母鼠同笼,不予任何处理;其余两组进行NEC动物模型构建。新生小鼠于生后1 d给予联合抗生素,连续灌胃10 d模拟无菌后,行NEC建模3 d,建模前后固定时间点称量体质量,第14天处死小鼠,HE染色观察回盲部肠组织病理学变化;qPCR法检测TLR-3、MDA-5、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-22基因表达水平;流式细胞仪检测3型天然淋巴样细胞(type 3 innate lymphoid cells,ILC3)数量;ELISA法检测肠组织匀浆IL-10水平。结果与正常对照组相比,PBS+NEC组、MNV+NEC组小鼠体质量明显降低(P<0.01),肠道损伤明显。与PBS+NEC组相比,MNV+NEC组体质量下降较少(P<0.05),肠上皮损伤也较轻;而在mRNA表达水平上,TLR-3(0.73±0.26 vs 0.62±0.40,P>0.05)、MDA-5(0.98±0.35 vs 0.67±0.39,P>0.05)、IL-10(1.22±0.36 vs 0.60±0.31,P<0.01)、IL-22(1.20±0.38 vs 0.65±0.22,P<0.05)基因表达增高,IL-6(0.75±0.33 vs 1.22±0.34,P<0.05)、IL-1β(0.39±0.2 vs 1.25±0.59,P<0.01)炎症因子基因表达降低;IL-10水平显著升高[(165.55±53.51)pg/mL vs(129.59±26.22)pg/mL,P<0.05],ILC3数量差异无统计学意义[(12.88±1.45)%vs(12.80±0.76)%,P>0.05],但其分泌的IL-22表达升高。结论 MNV在新生小鼠NEC模型肠道损伤中起保护作用,可能与MNV下调炎症因子IL-6、IL-1β,上调抑炎因子IL-10及分泌IL-22的ILC3的功能有关。

RT-PCR检测实验小鼠自然和实验感染鼠诺如病毒

为了解小鼠自然感染鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的情况,采集80只实验小鼠的粪便样本,应用RT-PCR方法扩增粪便样本的MNV ORF2特异性基因(187bp,MNV nt 5473-5659)片段。对PCR检测为阳性的粪便样本经10倍体积的PBS稀释后灌胃到4只ICR小鼠体内,1周后,将3只ICR小鼠与灌胃的小鼠同居饲养,观察小鼠是否出现异常症状,定期采集粪便做RT-PCR检测,研究小鼠实验感染MNV的情况。1个月后,处死小鼠,采集粪便、盲肠、十二指肠、脾、肝、大脑、肾、肺、心脏、胸腺、子宫、卵巢和唾液腺等器官做RT-PCR检测,研究MNV的主要感染部位。结果表明,自然感染的阳性率为13.75%(11/80);实验感染的小鼠外表健康、活泼、没有腹泻现象,阳性率为100%;主要的感染部位为小鼠的消化系统。本研究是首次在上海地区实验小鼠粪便中检测到MNV。

葡萄柚精油协同紫外线灭活果蔬表面诺如病毒和大肠杆菌的研究

【目的】果蔬中大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)和诺如病毒(norovirus)常导致食源性疾病暴发。紫外照射(UV-C)是灭活病原微生物的常用手段,但由于果蔬表面的特殊构造,UV-C对微生物的灭活效果受到一定的限制,同时也影响食品的颜色、质地和组织稳定性。葡萄柚精油(GEO)具有较强的抗菌和抗病毒活性且使用安全,但单独使用成本太高。试验旨在探究GEO协同UV-C作用对果蔬表面病原微生物的灭活效果,为提升食源性疾病暴发的防控技术提供科学依据。【方法】使用特定浓度的大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)(6.07×108 CFU/mL),鼠诺如病毒(MNV-1)(5.29×105 PFU/mL)和杜兰病毒(TV)(5.67×105 PFU/mL)在无菌环境下人工污染樱桃番茄、生菜和蓝莓表面,利用不同质量浓度GEO(1.0,4.0,8.0,16.0,32.0,64.0 mg/mL)和不同照射剂量UV-C(20,40,60,80,100,200 mJ/cm^(2))协同处理樱桃番茄、生菜和蓝莓表面的病原体,分析GEO与UV-C对病原体的协同灭活功效及其机理,并评估该灭活方法对果蔬组织损伤的影响。【结果】观察到UV-C的照射剂量80,100,200 mJ/cm^(2)对3种病原体均具有显著的灭活作用,GEO的抗病原作用具有剂量和时间相关性。在8 mg/mL GEO处理12 min后再与UV-C(100 mJ/cm^(2))协同作用下3种病原体的含量显著减少(2.42 log10~3.22 log10,P=0.017~0.029)。采用同样的协同方式处理樱桃番茄、生菜和蓝莓表面的病原体,发现同样具有显著的灭活效果(1.9 log10~3.68 log10,P=0.012~0.035)。透射电子显微镜结果表明,GEO引起病毒衣壳蛋白变性,这解释了GEO的抗病原作用及其在紫外线照射下的增强作用。最后,果蔬质构分析和感官评价表明,GEO的添加对测试食品的味道和品质影响较小。【结论】GEO协同UV-C处理是一种高效灭活果蔬表面病原体的方法,同时对测试产品的品质影响较小,将为食源性疾病防控提供新的技术支持。

四种杯状病毒调控宿主免疫类细胞因子表达的研究进展

杯状病毒科(Caliciviridae)为无囊膜的单股正链RNA病毒,包含许多对人类和动物健康带来严重威胁的病毒成员。由于该病毒科的大部分成员均不能在体外进行有效增殖,导致杯状病毒的研究相对滞后,虽然已取得了一些重要的进展,但还存在诸多问题亟待解决。基于此,本文综述了目前已证实的人诺如病毒(HuNoV)、鼠诺如病毒(MNV)、猫杯状病毒(FCV)和兔出血症病毒(RHDV)四种常见杯状病毒感染机体后干扰素、白介素、肿瘤坏死因子等免疫类细胞因子的表达水平及其作用机制,以了解免疫类细胞因子与杯状病毒感染的关系。为探讨病毒与宿主免疫系统之间的相互作用机制提供新思路。

鼠诺如病毒特性、免疫学及检测方法研究进展

鼠诺如病毒（routine norovirus，MNV）是唯一可在体外有效扩增的诺如病毒，其病毒株的分离及在鼠巨噬细胞RAW264．7细胞的增殖成功为诺如病毒分子机制的研究奠定了基础，也为人类诺如病毒（HuNoVs）致病机制的研究和疫苗的制备提供了帮助。MNV是小鼠中传播最广泛的感染因子之一，具嗜免疫细胞性，对免疫缺陷小鼠可产生致死性，加强该病毒感染的控制具有重要意义。

重庆地区小鼠诺如病毒的感染及其对免疫功能影响的初步研究

目的:建立实时荧光定量RT-PCR检测方法,普查重庆市实验小鼠诺如病毒(murine Norovirus,MNV)的感染情况及其对BABL/c-nu小鼠免疫功能影响的初步研究。方法:(1)根据GenBank中收录的MNV全基因组序列,设计MNV特异性引物,检测其特异性、灵敏度、重复性和稳定性,并和两个实验动物质量检测单位对123份小鼠临床样本开展比对检测,以最终构建荧光定量RT-PCR检测方法。(2)应用该方法比较小鼠不同肠道排泄物(盲肠内容物、新鲜粪便和排出体外24 h粪便)中MNV的检出情况。(3)应用该方法普查重庆市实验小鼠感染MNV的情况。(4)6~8周的BABL/c-nu小鼠被随机分为3组(n=3):正常对照组、MNV感染30 d组、MNV感染60 d组,收集各组小鼠血清及肝、肺、脾、结肠,HE染色观察各脏器的病理变化;酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清、脾和结肠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)及干扰素-γ(interferon gamma,IFN-γ)的含量。结果:(1)建立的荧光定量RT-PCR方法特异性强,与同种属其他病毒均不发生交叉反应,方法的灵敏度、重复性和稳定性良好,与另外两个实验动物质检单位的检测结果吻合度高达98%。(2)新鲜粪便与盲肠内容物中MNV的检出结果完全一致;24 h的陈旧粪便也能准确反映出该笼小鼠MNV的感染情况。(3)重庆市实验小鼠存在较高的MNV感染率,且封闭群和近交系小鼠MNV感染率无品系特异性(68.3%vs.70.6%,χ^2=0.116,P=0.733),但基因修饰小鼠比普通小鼠更易感染MNV(78%vs.64%,χ^2=6.434,P=0.011)。(4)与正常对照组小鼠相比,BABL/c-nu小鼠自然感染MNV后肝、肺、脾和结肠均出现不同程度的炎症细胞浸润和明显的组织病理变化,且结肠组织的TNF-α、IFN-γ水平明显升高(F=21.682,P=0.002;F=77.223,P=0.000)。结论:本研究建立的实时荧光定量PCR方法可靠,且可通过小鼠粪便样本,日常监测MNV的感染情况等;重庆市实验小鼠有较高的MNV感染率,且BABL/c-nu小鼠感染MNV会对动物实验结果造成干扰。因此,各实验动物单位应该重视MNV的传播和防控,加强实验动物的饲养管理,降低实验动物感染MNV的风险。

鼠诺如病毒MNV—CW1感染C57BL／6小鼠的特点

目的 探讨鼠诺如病毒（Murinenoroviurs，MNV）感染C57BL／6小鼠后临床及生物学特征，了解MNV的感染特点。方法将MNV—CWI毒株以高剂量（10^4PFU／只）和低剂量（102PFU／只）分别灌胃到C57BL／6小鼠体内，建立MNV感染小鼠模型。对感染小鼠进行体征观察和体温检测，检测粪便和血液排毒情况、组织中病毒的分布情况以及十二指肠病理切片检查。结果感染的小鼠没有明显的体表变化，没有腹泻、发热等临床症状和病理改变。粪便检测感染后1～2d排毒。在感染后第3天部分血液中检测到MNVRNA。主要感染部位为消化系统和脾脏。结论本研究建立的MNV—CW1感染C57BL／6小鼠模型为MNV感染小鼠致病机制进一步研究提供实验信息和技术支撑。

鼠诺如病毒感染RAW264.7细胞中干扰素和干扰素激活基因转录水平研究

诺如病毒（Norovirus,NoV）是全球急性胃肠炎散发病例和暴发疫情的主要致病原。鼠诺如病毒（Murine norovirus,MNV）是研究诺如病毒的理想研究模型。本研究通过实时定量荧光PCR检测急性感染毒株MNV-CW1和持续性感染毒株MNV-SH1603感染Balb/c小鼠后的排毒情况以及感染RAW264.7细胞后不同时间点病毒RNA扩增、干扰素（Interferon,IFN）和干扰素激活基因（Interferon-stimulated gene,ISG）转录水平,以探讨不同的MNV毒株感染诱导IFNs和ISGs基因表达的特征。研究显示MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染Balb/c小鼠后排毒时间不同。MNV-CW1和MNV-SH1603病毒感染RAW264.7细胞后,6h后出现明显扩增,48h达到病毒复制高峰,随后复制速度减慢。MNV-SH1603增殖比MNV-CW1快。两种病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54转录水平。MNV-CW1感染后,诱导IFN-β,IFN-λ2和ISG15基因表达上调,而ISG54在感染24h后转录水平下降。MNV-SH1603感染初期IFN-β,IFN-λ2,ISG15和ISG54基因转录水平持续增高,感染24h后IFN-β和ISG54的转录水平明显降低,IFN-λ2和ISG15转录水平峰值在感染后72h。研究揭示MNV病毒感染RAW264.7细胞后能上调IFN和ISG基因表达,但是MNV-CW1和MNV-SH1603诱导的基因表达特征有异同。

实验小鼠感染鼠诺如病毒的检测

目的了解实验小鼠鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)的携带情况及其基因特征。方法在广州某实验动物中心抽取两个种系的实验小鼠,采集其粪便标本,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测粪便标本的MNVORF2特异性基因(547bp,MNVnt5104～5650)。对阳性PCR产物进行测序并以测序结果构建基因进化树分析。结果共采集实验小鼠粪便标本20份,粪便来源的小鼠外表健康、活泼、进食正常,没有腹泻现象。MNV的阳性率为30.0%(6/20),阳性实验小鼠种类包括昆明小鼠(3/13)和NIH小鼠(3/7)。本研究检测的6个MNVs在进化树上独立一小分支,与参考株MNV2、3、4最为相近;核酸序列比较发现6个MNVs核酸序列的同源性最高,为98.3%～99.8%。结论该实验动物中心的小鼠存在较高的MNV携带状况,并可能在饲养设施内传播,有必要进一步探讨实验小鼠携带MNV的生物学意义。

鼠诺如病毒的体外分离与鉴定

目的体外分离出小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)毒株,并对其进行鉴定。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对小鼠进行MNV筛查,将检测出的MNV阳性小鼠的盲肠内容物经过处理接种至鼠源巨噬细胞系RAW264.7细胞,培养一段时间后用RT-PCR法扩增测序。结果成功通过传代RAW264.7细胞分离出MNV,并经过鉴定确认,对RT-PCR扩增序列进行初步分析,与韩国MNV4 S18株同源性最高,达99%。结论 MNV在体外的复制成功,为MNV的生物学特性、致病机制和诊断试剂等方面的研究提供了基础,同时作为人诺如病毒研究的理想模型,对人诺如病毒的研究也有重大意义。

我国鼠诺如病毒的分离培养及其基因组序列分析

目的分离我国鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)(命名SH1603),并进行基因组序列测定和分析。方法利用RAW264.7细胞分离MNV SH1603,参考国外已发表的MNV4(DQ223043)基因组序列设计引物,经重叠的反转录PCR扩增全基因组,利用生物信息学软件对全基因组序列进行分析。结果 MNV SH1603引起RAW264.7细胞病变,其基因组全长7 238个核苷酸,包括4个开放阅读框(open reading frames,ORF),预测的ORF1、ORF2、ORF3、ORF4编码蛋白大小分别为186 000、58 000、22 000和23 000,其中ORF1和ORF2之间有14个核苷酸重叠,ORF2和ORF3之间有1个核苷酸重叠,ORF4包含在ORF2中。NCBI Blast比对发现,SH1603基因组与MNV4同源性最高(94%)。衣壳蛋白区的进化分析发现,SH1603与MNV4(DQ223043)和Berlin0606(EF531291)亲缘关系最近。衣壳蛋白区氨基酸比对发现,SH1603与MNV4比较,有4个位点突变,分别为aa211S→A、aa358I→V、aa404E→L、aa534V→A。结论已分离到1株MNV,与国外报道的MNV4具有高度的进化亲源关系,为我国进一步研究MNV流行和致病机制奠定了基础。

一株小鼠诺如病毒的分离和鉴定及全基因组序列分析

小鼠诺如病毒（Murine norovirus,MNV）属于杯状病毒科诺如病毒属成员,是2003年新发现的感染实验小鼠的病毒,也是目前已知的小鼠病毒中感染率最高的一种病毒。本研究利用RAW264.7细胞从MNV感染小鼠的盲肠内容物中进行病毒分离,采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法、病毒空斑试验、TCID50试验、电镜观察、间接免疫荧光试验和测序分析等方法对分离到的病毒进行鉴定,结果显示RAW264.7细胞接毒24~48h后出现明显的细胞病变,表现为细胞圆缩、变亮、聚集,最后大部分细胞死亡脱落。分离株在RAW264.7细胞上传代至第2~3代时可出现稳定的细胞病变。经病毒空斑试验获得一株纯化病毒,病毒滴度TCID50为105.25/0.1mL。电镜观察可见明显的病毒颗粒,颗粒呈球形,无囊膜,直径约30~35nm。分离株经鉴定后命名为MNV Guangzhou/K162/09/CHN。采用RT-PCR技术分段扩增基因组开放阅读框（ORF）,同时应用3′-RACE和5′-RACE技术扩增基因组的3′-UTR和5′-UTR,分别对扩增片段进行克隆和测序,经拼接后获得分离株全基因组序列。结果显示分离株基因组序列全长7 380个核苷酸（GenBank登录号：HQ317203）,将分离株全基因组序列与GenBank登录的国外参考毒株进行同源性比较,结果表明该毒株与其他MNV分离株核苷酸同源性为87.4%~89.7%。基于VP1蛋白核苷酸序列绘制MNV毒株系统发生进化树,结果表明该分离株与来自日本（S7-P2和S7-PP3）、美国（CR3和CR18）、韩国（K4）和德国（Berlin/04/06/DE和Berlin/05/06/DE）的毒株进化距离较近,同属一个进化分支。本研究是国内首次对MNV病毒进行分离鉴定和全基因组序列分析的报道。

鼠诺如病毒分离株全基因组序列的测定及分析

目的对鼠诺如病毒分离株BJ102062进行全基因组序列测定，并对测序结果进行亲缘关系等分析。方法参照美国国立生物技术信息中心（TheNationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）发表的MNVl（AY228235）全基因组序列设计引物，根据测定的结果设计下一步引物，分段扩增测序，最后将所测各段拼接；对分离株的全基因组序列进行分析，与人源、牛源和其他鼠诺如病毒的代表株分别进行核苷酸和氨基酸序列的比较并进行亲缘关系分析。结果鼠诺如病毒分离株BJ10-2062基因组全长7381bp，G＋C含量56．63％，A＋U含量43．33％，含3个开放读码框；全基因组序列经NCBIBI．AST比对，与美国的CR4（EU004674）分离株同源性最高，为92．7％；与其他鼠诺如病毒分离株的同源性大于88％，而与人源和牛源诺如病毒分离株的同源性均小于50％；ORF1～3编码的蛋白相对分子质量分别为187×10^3、58×10^3和22×10^3，含量最高的氨基酸分别是丙氨酸（Ala）、亮氨酸（Leu）、甘氨酸（Oly）和谷氨酰胺（Gln），BJ102062分离株各编码蛋白的氨基酸序列与其他鼠诺如病毒问的同源性明显高于人源和牛源诺如病毒；与原始分离株MNVl相比，BJ10-2062VP1衣壳蛋白第296位由赖氨酸突变为谷氨酸，导致其毒力减弱。基于全基因组核酸序列构建的亲缘关系树表明，BJ10-2062与其他鼠诺如病毒分离株均属于genogroupV，与美国的CR4和NIH-A114株亲缘关系最近，并与美国的其他NIH系列毒株一起形成一个独立的分支。结论对鼠诺如病毒BJ10-2062分离株全基因组的测序分析，为进一步研究鼠诺如病毒特性的分子生物学机制奠定了基础。

鼠诺如病毒感染免疫研究进展

人诺如病毒（Norovirus,NoV）是杯状病毒家族的成员,可引起以恶心、呕吐、腹痛和腹泻为主要临床症状的急性胃肠炎.NoV全球流行,可感染所有年龄阶段的人群,造成了严重的疾病负担.由于缺乏合适的小动物模型,人类对NoV的感染免疫和致病机理还缺乏了解.鼠诺如病毒（Murine norovirus,MNV）最初在免疫缺陷的小鼠中分离得到,在小鼠中可感染和流行,为研究NoV感染引发的宿主肠道免疫机制提供了替代模型.本研究从固有免疫和适应性免疫两方面来阐述.

1株野生鼠诺如病毒的全基因组序列测定及分析

目的为确定1株通过高通量测序获得的GV型野生鼠诺如病毒（MNV）变异株的基因组序列特征。方法将在山东地区采集的210只鼠经解剖后收集的肠道内容物和肝脏进行核酸提取，质检合格后送于华大基因进行高通量测序，获得一株GV型野生鼠诺如病毒。设计特异性巢式引物利用RT-PCR方法扩增该病毒全基因组。利用DNAMAN，MEGA5．0软件进行序列比对及系统进化分析。结果获得的GV型野生MNV变异株全基因组长度7382bp，与从数据库中选取的30株参考毒株全基因组序列相似度为76．8％～78．1％，其中VP1中的高变区P2编码的氨基酸相似度仅为60．9％～78．1％，表明该株MNV具有较高的变异率。结论本研究分离出了一株野生鼠诺如病毒，丰富了国内MNV的基因库，其变异特征为了解国内MNV的分子遗传特征及进化来源提供了参考依据。