微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及机制

目的探讨两种形状微图案化表面对大鼠骨髓间充质干细胞(r BMSCs)成骨分化的影响及机制。方法利用q RT-PCR技术检测三角形和圆形微图案化表面上r BMSCs成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn和成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2的表达情况,利用免疫荧光和q RT-PCR技术检测三角形微图案化表面上Piezo1、F-actin、Myosin和YAP的表达情况。结果三角形微图案化表面上r BMSCs的成骨基因Runx-2、Opn、Alp、Col-1、Ocn的表达均升高,且边长为15μm时表达最强,而成脂基因Pparγ、C/ebpα、AP2表达均降低。在圆形微图案化表面,r BMSCs的成骨和成脂基因表达均下调。此外,在15μm三角形微图案化表面上,r BMSCs的Piezo1、F-actin、Myosin和YAP表达均升高。通过使用Piezo1抑制剂Dooku1处理,观察到这些蛋白的表达均降低,且细胞的成骨能力受到抑制。结论三角形微图案化表面能够显著促进r BMSCs的成骨分化,尤其是在边长为15μm时效果最为显著。该表面通过Piezo1信号通路促进r BMSCs成骨分化,涉及的关键信号分子包括Piezo1、F-actin、Myosin和YAP。

中药龟板提取物化学成分及其调控鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)增殖活性的实验研究

中药龟板提取物浸膏经硅胶柱层析,用石油醚-乙酸乙酯作洗脱剂,梯度洗脱,得到16个组分;采用MTT法和流式细胞技术研究了它们对鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)的增殖作用,实验结果显示组分Ts-12具有促进rMSCs增殖的作用(p<0.05),而组分Ts-4则表现出抑制rMSCs增殖的作用(p<0.05),其它样品对rMSCs的增殖作用不显著(p>0.05),不具统计学意义.采用了GC-MS分析各组分化学成分,并用HPLC和9个标准物质鉴定确证了组分Ts-12中含有十六酸甲酯(S-1)、十六酸乙酯(S-3)、十八酸甲酯(S-4)和甾醇(S-7)以及十四酸甾醇酯(S-8),组分Ts-4主要含有十八酸(S-5).对标准品也采用了MTT法和流式细胞仪研究了它们对rMSCs的增殖作用,结果表明十四酸甾醇酯和十六酸甲酯具有促进rMSCs增殖的作用,而十八酸具有抑制作用.

黄芩苷通过Wnt/β-catenin信号通路对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用

目的研究黄芩苷（baicalin）对大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow derived mesenchymal stem cells,rBMSC）成骨分化过程中Wnt/β-catenin信号通路的影响.方法采用贴壁筛选法体外培养rBMSC,给予黄芩苷3、5、7d后,比较药物处理组与对照组之间碱性磷酸酶（ALP）的活性.同时检测给予黄芩苷对碱性磷酸酶阳性克隆和矿化结节形成的影响.提取总mRNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR检测黄芩苷对Wnt10a、GSK-3β、β-catenin以及LEF1mRNA水平的影响.免疫印迹检测药物处理对β-catenin以及Runx2蛋白表达量的影响.结果黄芩苷明显提高ALP的活性.10μmol·L-1浓度的黄芩苷还可增加碱性磷酸酶克隆数和钙化结节的形成.黄芩苷还可提高Wnt10a、β-catenin、GSK-3β、LEF1以及osteocalcin的mRNA水平,并提高β-catenin和Runx2的蛋白表达量.结论黄芩苷在0.1～50μmol·L^-1的给药浓度下可促进rBMSC的成骨分化成熟,Wnt/β-cate-nin信号可能参与调控rBMSC的成骨分化.

力学刺激和成骨化学诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响

目的探讨力学刺激与成骨化学诱导剂对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone mesenchymal stem cellsr,BMSCs)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)I、型胶原(collagen type I,COL I)和骨钙素(osteocalcin,OCN)基因表达与钙化结节形成的影响。方法体外分离培养rBMSCs,分别在成骨诱导和非成骨诱导条件下应用双轴力学应变加载系统对rBMSCs施加周期性的机械张应变(应变2%,频率1 Hz,每次2 h,间隔2 h,每天加载3次)。力学刺激作用3 d和6 d,采用实时荧光定量RT-PCR检测ALP、COL I和OCN的mRNA表达,同时采用茜素红染色法观察钙化结节的形成情况。结果力学刺激作用后,成骨诱导6 d组出现明显的钙化结节,其余各组均无明显钙化结节形成。与相应非诱导组比较,成骨诱导3 d组ALP、COL I和OCN的mRNA表达量分别增加0.63、和11.8倍;成骨诱导6 d组ALP、COL I和OCN的mRNA表达量分别增加2.73、.2和10倍。结论成骨化学诱导剂和力学刺激均能促进rBMSCs的骨向分化,且二者之间具有协同作用。

缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及葡萄糖摄取和Akt表达的影响

目的探讨缺氧对大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)糖摄取、凋亡、增殖和Akt表达的影响。方法将接种的P3细胞置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱中37℃孵育不同时间点(常氧、缺氧0.5、1、2、4和8h)后分别取出,应用放射同位素法检测MSCs对氚标记-葡萄糖(3H-G)的摄取,应用Annexin V/PI双染法进行流式细胞仪(FCM)分析MSCs凋亡率(apoptotic rate,AR)和死亡率(dead rate,DR),应用MTT分析细胞增殖状态以及检测Akt蛋白表达。结果培养的P3骨髓单个核细胞CD29+、CD71+、CD44+、CD34-和5-aza诱导后表达TnT及骨诱导分化液诱导后细胞ALP+等证实其为骨髓MSCs;各缺氧时间点3H-G摄取量较缺氧前均显著性降低(P<0.01),而各缺氧时间点之间没有统计学意义(P>0.05);MSCs常氧、缺氧0.5、1、2、4、6和8h时的AR均较缺氧前显著增高(P<0.01)、DR亦显著增高(P<0.05),不过,随着缺氧时间延伸,AR显著增加(P<0.05),而DR没有统计学意义(P>0.05);缺氧不同时间点MTT法OD值较常氧(缺氧结束同步时间点)均显著性降低(P<0.01),并随缺氧时间延伸显著降低(P<0.05),不过,与常氧(缺氧8h开始同步时间点)相比,均显著升高(P<0.05);与常氧相比,各缺氧时间点Akt蛋白IOD均显著增强(P<0.05),而各缺氧时间点改变无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧既可引起MSCs摄糖量下降、增殖滞缓,又可上调Akt蛋白表达和促进MSCs凋亡。

缺氧环境下大鼠骨髓间充质干细胞凋亡相关蛋白和mRNA的表达

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)在缺氧环境下凋亡相关蛋白和mRNA的表达。方法将接种的P3细胞置于94%N2、1%O2和5%CO2缺氧箱中37℃孵育,分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h和12h取出分别应用Annexin V/PI双染法进行流式细胞仪(FCM)分析MSCs凋亡率(Apoptotic Rate,AR),并同步用免疫细胞化学、western blotting和Rt-PCR等方法检测Bax/Bcl-2,Fas/Fas L和Caspase-3蛋白和mRNA的表达。结果1.缺氧前,免疫细胞化学法未检测到Bcl-2、Bax、Fas、Fas L和Caspase-3蛋白表达,缺氧0.5h后均可较强表达;2.各缺氧时间点Bcl-2、Bax、Fas、Fas L、Caspase-3蛋白和mRNA表达较缺氧前均显著性增高(P均<0.05);随缺氧时间延伸,Bcl-2蛋白和mRNA表达不显著增加(P>0.05),而Bax、Fas、Fas L、Caspase-3蛋白和mRNA表达均显著增加(P均<0.05),但缺氧6-12h时间点之间表达均没有统计学意义(P均>0.05);3.AR和Bcl-2/Bax蛋白(r1=-0.417,P=0.043)及mRNA(r2=-0.435,P=0.040)呈显著负相关,而和Fas(r1=0.639,P=0.025;r2=0.711,P=0.018)、Fas-L(r1=0.581,P=0.022;r2=0.605,P=0.037)、Caspase-3(r1=0.704,P=0.014;r2=0.657,P=0.026)蛋白及mRNA均呈显著正相关。结论在缺氧促进MSCs凋亡的过程中,Bcl-2蛋白和mRNA可能起着保护作用,而Bax、Fas-L、Fas、Caspase-3蛋白和mRNA可能在MSCs凋亡的进程中起着促进作用。

骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞倍增反应和分化的作用机制实验

背景骨碎补总黄酮(total flavonoids of rhizome drynariae,TFRD)是骨碎补的主要活性成分,近年来许多研究表明TFRD可有效提高骨质疏松症患者骨密度,进而促进骨愈合,但目前其作用的具体分子机制尚不完全明确。目的探讨TFRD对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)倍增反应和分化作用的分子机制。方法获取SD大鼠的骨髓间充质干细胞。细胞培养基中加入TFRD,根据TFRD浓度的不同分为低浓度组(TFRD 0.1 mg/L)、中浓度组(TFRD 1.0 mg/L)、高浓度组(TFRD 10.0 mg/L),细胞培养基中未加入TFRD的作为对照组。采用CCK8法检测各组BMSCs细胞增殖情况,茜素红染色法检测各组成骨分化情况,RT-PCR法和Western blot法检测中浓度组与对照组β-catenin、RunX2、PPARG的mRNA和蛋白表达情况。结果不同时间点低浓度、中浓度、高浓度TFRD组吸光度值与对照组比较均显著升高(P<0.05);4组矿化结节数统计,中浓度组高于其他三组,差异有统计学意义(P<0.05);中浓度组与对照组比较,β-catenin和RunX2 mRNA表达明显升高,PPARG mRNA表达明显降低(P<0.05);中浓度组与对照组比较,β-catenin和RunX2蛋白表达明显升高,PPARG蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论TFRD可促进BMSCs细胞增殖和成骨分化,其作用机制可能与上调β-catenin、RunX2表达,抑制PPARG表达有关。

鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及定向诱导分化为内皮样细胞

目的:探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞(rBMMSCs)的分离培养和血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其定向诱导为内皮样细胞(ELCs)的可行性。方法:采用Percoll(1.073g/ml)分离液分离骨髓单个核细胞,用含10%胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培养基贴壁纯化培养,倒置显微镜、免疫细胞化学法、流式细胞仪、MTT法、透射电镜(TEM)联合对rBMMSCs形态、表型、生长曲线、细胞周期以及超微结构进行鉴定;诱导后的细胞,采用倒置显微镜观察细胞形态,免疫细胞化学法检测CD31、CD144(VE-cadherin)和CD34表达以及摄取Dil-ac-LDL、结合FITC-UEA-1的功能特点。结果:rBMMSCs呈长梭形,漩涡状排列。细胞生长曲线显示潜伏期、对数生长期和平台期,符合干细胞的生长规律。透射电镜结果表明:rBMMSCs有两种不同的形态结构,其中体积较小、核质比大、胞质内细胞器稀少者为处于未分化或分化较低状态的幼稚型rBMMSCs。细胞周期分析显示:第4代细胞G0/G1期为95.67%,表明绝大部分细胞处于非增殖状态;诱导后的部分细胞形态可见类似ELCs改变,表达血管内皮细胞(ECs)特异性表面标志CD31、CD34和CD144,具有摄取Dil-ac-LDL以及结合FITC-UEA-1的功能特点。结论:采用Percoll密度梯度离心与贴壁培养相结合的方法所培养的rBMMSCs在体外具有定向诱导分化为ELCs的潜能,可能成为血管组织工程理想的种子细胞来源。

福莫特罗和ICI118551对大鼠骨髓间充质干细胞来源的成骨样细胞功能的影响

目的:研究选择性β2肾上腺素能激动剂福莫特罗(Formoterol)和阻滞剂ICI118551对体外由大鼠骨髓间充质干细胞(MMSC)成骨分化的影响,探讨β2肾上腺素能受体信号对骨代谢的影响。方法:取3周龄雌性SD大鼠,全贴壁筛选法培养MMSC,用条件培养液诱导向成骨细胞分化后分别加入不同浓度Formoterol和ICI118551,检测细胞碱性磷酸酶,骨钙素的分泌水平和细胞增殖率。结果:MMSC成功诱导分化为成骨样细胞,不同浓度(10-5～10-9mmol/L)的Formoterol均可抑制成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖。高浓度ICI118551(10-5和10-6mmol/L)抑制成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖,低浓度ICI118551(10-8和10-9mmol/L)则可促进成骨样细胞分泌碱性磷酸酶,骨钙素和细胞增殖。结论:β2肾上腺素能受体激动剂可抑制体外成骨样细胞的功能和细胞增殖,而阻滞剂对成骨样细胞功能和增殖的影响与其浓度有关。

大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的研究

目的 观察体外不同诱导条件下大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同时间段分化为心肌样细胞的能力及表达心肌细胞特异性标志物的差别.方法 分离培养SD大鼠BMSCs和SD乳鼠心肌细胞并鉴定,取第3代BMSCs分别进行5-氮胞苷（5-Aza）诱导、与心肌细胞共培养及单独培养,分别于第2、4、6、8、10周使用倒置显徼镜观察细胞生长情况和形态变化,反转录-聚合酶链反应检测每组细胞心肌特异性基因肌钙蛋白I（cTnI）、缝隙连接蛋白43（Cx43）和心肌特异性转录因子4（GATA-4）的表达.结果 对照组未见有搏动细胞,cTnI、Cx43和GATA-4基因表达阴性;5-氮胞苷诱导组于第2周时细胞呈梭形且排列方向趋于一致,未见有搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达第8周达到高峰,GATA-4基因表达第4周达高峰;共培养组细胞多为梭形,呈肌性排列,可见搏动频率不一致的搏动细胞,cTnI、Cx43基因表达于第2～8周表达逐渐增加,GATA-4基因表达第6周达高峰;相同时段内,共培养组的cTnI、Cx43和GATA-4基因表达高于5-氮胞苷诱导组（P＜0.05）.结论 BMSCs经5-氮胞苷诱导或与心肌细胞共培养可转化为心肌样细胞并表达基因cTnI、Cx43和GATA-4,且共培养组BMSCs分化为心肌样细胞的能力比5-氮胞苷诱导组强,推测心肌微环境可促进BMSCs定向分化为心肌样细胞.

与韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞胶原蛋白和韧粘素-C表达的影响

骨髓间充质干细胞(BMSCs)可分化成多种细胞。已有研究表明,局部微环境影响细胞的生长、分化等功能,不同的细胞共培养可为细胞提供特定的环境。因此,本实验将大鼠BMSCs与大鼠韧带成纤维细胞间接共培养不同时间段后,检测其I型、III型胶原和韧粘素-C的mRNA表达以及I型、III型胶原的蛋白合成量。结果显示,体外培养6d,间接共培养组BMSCsI型胶原mRNA的表达量(3.9±0.2)是对照组(1.9±0.3)的2.0倍;间接共培养组BMSCsIII型胶原的表达量(1.9±0.2)是对照组(0.8±0.1)的2.2倍,而韧粘素-C的mRNA表达量两组间无明显差异。体外培养12d,间接共培养组BMSCs的I型和III型胶原mRNA表达量继续升高,它们的蛋白含量分别从对照组的12.4±0.8ng/μg和5.0±0.4ng/μg,增加到13.6±1.3ng/μg和5.9±0.5ng/μg;韧粘素-C的mRNA表达量(0.14±0.02)为对照组(0.07±0.02)的2.0倍。结果提示与韧带成纤维细胞间接共培养,可以促进BMSCsI型、III型胶原蛋白和韧粘素-C的合成。

过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞改善异位移植心脏存活

目的:探讨过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)改善大鼠腹腔异位移植心脏的存活机制。方法:通过慢病毒载体GV308携带IDO基因转染大鼠骨髓间充质干细胞构建过表达IDO大鼠骨髓间充质干细胞。建立大鼠腹腔异位移植心脏模型,经尾静脉给予相应细胞处理:(1)利用超声心动图检测移植心脏心功能变化。(2)采用小动物活体成像系统评估移植心脏局部荧光强度。(3)再取各组受体大鼠的脾脏,采用流式细胞技术检测CD40、CD86、CD80、MHCⅡ、CD274、CD45RA、CD45RA+CD45RB、Treg细胞的表达情况。(4)取各组移植心脏,采用HE染色评估炎性细胞浸润情况。(5)利用液相芯片检测各组血清IL-1ɑ、IL-4、IL-1β、IL-2、IL-10、IFN-γ、IL-18、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3因子的变化情况。结果:(1)给予相应细胞处理,可见过表达IDO-BMSCs处理后2 d移植心脏的EF、FS较其余各组有提高。(2)采用小动物活体评估可见过表达IDO-BMSCs组移植心脏局部荧光强度最强。(3)给予干预措施后2 d可见过表达IDO-BMSCs组脾脏细胞CD40、CD86、CD80、MHCⅡ、CD45RA、CD45RA+CD45RB表达降低,而CD274、Treg细胞的表达增高。(4)采用液相芯片检测各组提取血清可见在2 d时,过表达IDOBMSCs组血清中IL-1α、IL-4、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-18是降低的;IL-10、TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3表达量是升高的。HE染色证实过表达IDO-BMSCs组炎性细胞浸润少于其他组。结论:过表达IDO的BMSCs可以通过有效调节免疫DC、T细胞及细胞因子,从多个免疫层面改善移植心脏存活。

氧化石墨烯对大鼠骨髓间充质干细胞生物活性的影响

目的探讨氧化石墨烯对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生物学活性的影响。方法采用改良Hummers法制备氧化石墨烯,将不同浓度的氧化石墨烯溶液与大鼠骨髓间充质干细胞共培养,检测其对细胞增殖和形态的影响,相关结果采用SAS V8软件进行统计学分析。结果经表征分析,改良Hummers法可以成功制备出高纯度的氧化石墨烯。在细胞密度较低时,氧化石墨烯对大鼠骨髓间充质细胞的分裂增殖有抑制作用;而在细胞密度较高,达到生长接触抑制的浓度时,氧化石墨烯具有促进细胞死亡,降低活性细胞数量的作用。连续镜下观察后发现,氧化石墨烯对细胞形态有显著影响,可使细胞伸展性下降,折光率降低。这些细胞形态的变化与氧化石墨烯的浓度呈正相关。结论氧化石墨烯可抑制大鼠骨髓间充质干细胞的生物学活性,其作用呈浓度依赖性。

VEGF基因体外转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的:探讨脂质体介导血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCS)应用于基因治疗的可行性、安全性。方法:体外分离、培养、鉴定MSCs,PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染MSCs,转染后用免疫荧光和ELISA检测MSCs表达VEGF蛋白的情况,MTT检测MSCs对VEGF质粒转染的敏感性。结果:骨髓中分离得到MSCs,流式细胞检测显示MSCs不表达CD34和CD45,但表达CD90。透射电镜观察可见细胞浆中含大量粗面内质网和分泌颗粒。VEGF基因转染MSCs后第5天抗VEGF免疫荧光染色约90%的MSCs呈阳性,ELISA检测结果显示PcDNA3.1(-)/VEGF165质粒转染组细胞培养上清液中VEGF含量明显高于对照组,并于转染后第5天达到峰值。MTT检测结果显示VEGF质粒转染对MSCs增殖无影响。结论:MSC可作为VEGF基因转染的靶细胞用于基因治疗。

TNF-α对大鼠骨髓间充质干细胞黏附分子L-选择素表达的影响

目的研究大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)经不同浓度的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)预处理后,表面的黏附分子L-选择素(L-selectin,CD62L)的表达变化以及其表达变化与细胞因子浓度之间的关系。方法采用等密度梯度离心法收集大鼠MSCs并用贴壁培养法进行扩增纯化,经免疫组化法鉴定后,加入不同浓度TNF-α分别作用24小时,将其消化分离和标记后,采用流式细胞仪(flow cytometer,FCM)对其表面的CD62L的表达进行检测。结果经TNF-α预处理24小时的大鼠MSCs经流式细胞仪检测,其表面CD62L成阳性表达的细胞占所检测细胞的百分比与未加入任何细胞因子预处理的空白组大鼠MSC相比较,差异显著,不同浓度组间比较,差异显著。结论经不同浓度TNF-α预处理的大鼠MSCs表面CD62L表达较空白组要高,并且随着TNF-α浓度的升高大鼠MSCs表面CD62L的表达也相应升高。

大鼠骨髓间充质干细胞与β-磷酸三钙／聚L-乳酸支架材料的复合

将成骨诱导前后的大鼠骨髓间充质干细胞与不同比例、不同孔径和不同孔隙率的β-TCP／PLLA材料复合,通过体内体外实验研究β-磷酸三钙／聚L-乳酸(β-TCP／PLLA)的成分、孔径和孔隙率等结构参数对复合材料在体内异位成骨能力的影响．结果表明,β-TCP／PLLA成分比为2:1,致孔剂含量为70％;孔径为200-450μm的支架材料在体外更有利于细胞的生长、增殖以及分化．这种支架材料在裸鼠体内具有异位成骨的能力,成骨诱导后的大鼠骨髓间充质干细胞比没有诱导的细胞更适合作为种子细胞．

苯妥英钠对大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的影响

目的:研究苯妥英钠(PHT)对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)向血管内皮细胞(rVECs)分化的影响。方法:建立rBMSCs与rVECs共培养组及rBMSCs单独培养组,各组分别添加不同浓度的PHT(0、20、40μg/ml),培养14 d后real-time PCR检测各组细胞中ICAM-1、VCAM-1、KDR和RUNX2基因的mRNA表达水平。结果:添加PHT后,各组细胞中ICAM-1、KDR和RUNX2基因的mRNA表达均上调。添加相同浓度PHT时,共培养组较单独培养组中rBMSCs的ICAM-1、KDR和RUNX2基因的mRNA表达量增高,而VCAM-1基因的mRNA表达量降低。结论:PHT可能促进大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化。

低氧调控大鼠骨髓间充质干细胞OPG/RANKL mRNA的表达

目的:探讨低氧处理对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bone marrow derived mesenchymal stem cells,rBMSCs)骨保护素(osteoprotegerin,OPG)和核因子κb受体活化因子配体(receptor activator of NF-κb ligand,RANKL)mRNA表达的影响。方法:采用全骨髓细胞贴壁法分离、培养rBMSCs,应用化学低氧剂氯化钴(CoCl_2)建立低氧模型,分别以0、50、100、200、400μmol/L浓度的CoCl_2孵育细胞,首先采用MTT法检测CoCl_2对细胞增殖的影响;利用实时荧光定量PCR及Western免疫印迹检测低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的表达情况。rBMSCs经低氧处理0、12、24、48、72、96 h,实时荧光定量PCR检测OPG、RANKL mRNA的表达。采用SPSS18.0软件包对数据进行统计学分析。结果:与对照组相比,200、400μmol/L的CoCl_2抑制rBMSCs增殖(P<0.05),而50、100μmol/L CoCl_2实验组的增殖并未产生显著影响(P>0.05)。在50、100μmol/L CoCl_2实验组,rBMSCs表达HIF-1α的mRNA和蛋白水平均高于对照组,100μmol/L CoCl_2组较50μmol/L CoCl_2组高。100μmol/L CoCl_2孵育12 h时,低氧组和对照组rBMSCs的OPG、RANKL mRNA的表达无变化(P>0.05);24、48、72、96 h时,与常氧组相比,低氧组OPG mRNA表达水平升高,RANKL mRNA表达水平下降,OPG/RANKL的比值显著升高(P<0.05)。结论:100μmol/L CoCl_2低氧处理可通过调控rBMSCs OPG、RANKL mRNA的表达,从而促进成骨分化。

miR-100-5p通过抑制大鼠骨髓间充质干细胞的迁移和成骨分化参与非创伤性股骨头坏死

目的探讨miR-100-5p在非创伤性股骨头坏死(NONFH)发病机制中的作用。方法实时定量PCR检测NONFH患者的miRNA表达,确定NONFH患者股骨头组织miR-100-5p高表达。而后培养大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSC)分为空白对照组,地塞米松处理组(地塞米松处理3 d),微小RNA阴性对照组(转染miR-NC),agomiR-100-5p组(miR-100-5p过表达),antagomiR-100-5p组(转染miR-100-5p拮抗剂)。使用实时定量PCR检测股骨头骨组织miR-100-5p、碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(RUNX2)和Ⅰ型胶原蛋白(Col1)的mRNA表达。采用Western blot法检测股骨头骨组织ALP、RUNX2、Col1和骨形态发生蛋白受体2(BMPR2)蛋白的表达。采用划痕愈合实验评估miR-100-5p对rBMSC迁移能力的影响。通过茜素红染色观察miR-100-5p对rBMSC成骨分化能力的影响。结果与正常的股骨头骨组织相比,NONFH患者股骨头骨组织中miR-100-5p显著上调;与正常rBMSC相比,20μmol/L地塞米松处理后的rBMSC中miR-100-5p表达上调;rBMSC中miR-100-5p的上调降低ALP、RUNX2、Col1和BMPR2的表达,抑制rBMSC的成骨分化能力和迁移能力。结论miR-100-5p在NONFH患者的骨组织和20μmol/L地塞米松处理后的rBMSC中表达升高。上调的miR-100-5p可能通过抑制rBMSC的迁移和成骨分化参与NONFH的发病机制。

microRNA-145调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨microRNA-145在大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用。方法取3周龄雄性大鼠胫骨骨髓间充质干细胞,分为阴性对照组与microRNA-145下调组,分别感染慢病毒,观察microRNA-145对大鼠骨髓间充质干细胞在细胞增殖、细胞周期、凋亡和成骨分化方面的影响。结果 microRNA-145下调表达组(p Lv3-(anti)miR-145)与阴性对照组(p Lv3-Negative control)相比,大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、细胞周期和凋亡无统计学差异(P>0.05);microRNA-145下调表达组成骨相关基因Sema3A、OPG、Runx2及Osterix/SP7表达均明显高于阴性对照组,且microRNA-145下调组茜素红染色范围也大于阴性对照组。结论 microRNA-145下调表达可以促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化,但对其细胞增殖、细胞周期和凋亡无明显影响。