毛细管电泳免疫分析法研究鼠IgM、兔抗鼠IgG及其免疫复合物

根据鼠IgM能与兔抗鼠IgG发生特异性免疫反应,采用毛细管电泳免疫法分析鼠IgM及其免疫复合物。以Tris为电解质,探讨了缓冲溶液浓度和pH值、进样时间、进样电压等因素对鼠IgM、兔抗鼠IgG及其免疫复合物分离的影响。在缓冲体系浓度为40 mmol.L-1TAE、1.0 mmol.L-1EDTA(pH为8.5),进样时间为12 s,进样电压为18 kV的条件下,鼠IgM、兔抗鼠IgG及其反应形成的免疫复合物获得了很好的分离。

红鳍东方鲀IgM重组表达及多克隆抗体制备

红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)是我国重要的海水养殖经济鱼类,探究红鳍东方鲀IgM的结构与功能对其病害防治与免疫系统的研究均有重要意义。本研究克隆获取了红鳍东方鲀IgM的重(H)链恒定(C)区序列(大小为1326 bp),并将获得的IgM序列连接至pET28a表达载体上,利用大肠杆菌BL21进行体外重组表达。SDS-PAGE结果表明:重组蛋白红鳍东方鲀IgM(TrIgM)大小约为62 kDa,重组表达的IgM主要以包涵体形式表达。通过体外复性获得可溶性TrIgM蛋白,将制备的TrIgM蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了TrIgM鼠抗血清,Western Blot检测结果表明:制备的鼠抗血清可以与重组TrIgM蛋白和红鳍东方鲀天然血清中的IgM重链蛋白特异性结合。本研究中制备的抗血清可作为检测红鳍东方鲀IgM的特异性抗体,为红鳍东方鲀相关免疫检测提供基础。

HSV-IgM人-鼠嵌合抗体制备及稳定细胞株构建工艺开发

为实现体外大规模制备单纯疱疹病毒HSV-IgM(HSV1,HSV2)人鼠嵌合抗体,本研究通过RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增(RNA ligase-mediated rapid amplification of cDNA ends,RLM-RACE)技术获取其对应杂交瘤细胞基因序列,构建嵌合抗体至真核表达载体,在CHO-S细胞中稳定表达所需目的蛋白。同时优化稳定细胞株筛选工艺,对细胞池构建阶段和单克隆筛选阶段的加压条件进行摸索与探究,最后目的抗体采用蛋白L亲和纯化法进行纯化并进行生物活性检测;最终成功制备899 kDa和909 kDa的稳定高表达重组IgM抗体(HSV1,HSV2)细胞株。结果表明,最适筛选压力为20P200M(一轮加压)和50P1000M(二轮加压);使用加压培养基进行单克隆筛选抗体表达量较高,HSV1-IgM和HSV2-IgM单克隆最终表达量分别为1620 mg/L和623 mg/L。本研究为HSV1和HSV2的IgM系列重组抗体质控品开发以及体外高表达分泌IgM亚型抗体提供理论与实践基础。

全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的制备与鉴定

目的:利用人源IgM转基因小鼠制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体,并对其进行初步鉴定。方法:以灭活的狂犬病病毒CTN株作为抗原免疫人IgM转基因小鼠。采用杂交瘤技术结合酶联免疫吸附试验(ELISA)高通量交叉筛选技术(HTS)制备全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体。通过双抗体夹心ELISA鉴定单抗的人源性和抗体型,间接ELISA、斑点杂交(Dot Blot)实验及Western blot检测单抗的特异性,BiaCore X-100测定单抗结合抗原的亲和力。结果:建立了2株稳定分泌抗狂犬病病毒人源性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为9E3和9F2。双抗体夹心ELISA结果显示2株单抗均为人源性免疫球蛋白IgM型。间接ELISA、斑点杂交实验结果表明2株单抗均能特异性识别灭活的狂犬病病毒CTN株。Western blot结果显示2株单抗均能与狂犬病病毒糖蛋白特异性结合。2株单抗与狂犬病病毒CTN株抗原结合的亲和力分别为2.62×10-10mol/L、4.06×10-11mol/L。结论:筛选制备了2株特异性、高亲和力的全人源抗狂犬病病毒单克隆抗体。本研究为进一步筛选人源抗狂犬病病毒免疫预防性中和抗体及其免疫治疗的应用奠定了基础。