益气解毒颗粒对二亚硝基哌嗪诱导人胚鼻咽上皮细胞转化的阻抑作用

目的 :探讨中药复方益气解毒颗粒对人胚鼻咽上皮细胞转化的阻抑作用。方法 :二亚硝基哌 (DNP)诱导人胚鼻咽上皮细胞转化 ,同时用益气解毒颗粒作用于DNP诱导的鼻咽上皮细胞 ,共同培养 ,然后收集不同代数细胞 ,酶连免疫聚合酶链反应 (PCR -ELISA)和巢式聚合酶链反应 (Nested -RT -PCR)法检测实验细胞端粒酶活性和端粒酶RNA的表达。结果 :加益气解毒颗粒药液组鼻咽细胞形态明显好于盐水对照组 ,其端粒酶活性 (0 34± 0 19)也明显低于对照组 (0 73± 0 2 7) (P <0 0 5 )。结论 :益气解毒颗粒能够抑制鼻咽上皮细胞端粒酶的激活 ,进而阻断DNP诱导的细胞转化。

人胚鼻咽上皮细胞cDNA文库的构建及鼻咽癌相关基因的筛选

为了进一步分离人鼻咽组织特异性表达基因和鼻咽癌特异相关基因 ,采用SMART (switchingmechanismat 5′endofRNAtranscript)技术 ,构建了人胚鼻咽上皮cDNA文库 .从原代培养的人胚鼻咽上皮分离总RNA并纯化mRNA ,利用经修饰的oligo (dT)引物 (含sfiⅠB酶切位点 )合成cDNA第一链 ,同时根据真核生物mRNA5′端帽子结构特点 ,利用SMART核苷酸 (含sfiⅠA酶切位点 )作为cDNA第一链在mRNA 5′端延伸出去的模板 ,进而以此序列为引物利用LD PCR (long distance PCR)合成双链cDNA ,双链cDNA经sfiⅠ (ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后 ,克隆入经sfiⅠ酶切的λTrip1EX2载体后经体外包装而成cDNA文库 .结果表明 ,原始人胚鼻咽上皮cDNA文库获得 1 0× 10 6个重组子 ,重组率达 96 % .文库扩增后 ,滴度达 7 8× 10 9pfu ml,插入cDNA平均长度为 1 2kb ,用PCR从该文库扩增出本实验室新克隆的鼻咽癌相关基因NAG4的全长cDNA .构建的人胚鼻咽上皮cDNA文库具有良好的质量 ,该cDNA文库为进一步筛选。

EB病毒介导人鼻咽上皮细胞永生化早期阶段的生物学观察

EB病毒转化人鼻咽上皮细胞,建立体外多阶段细胞模型有利于从细胞和分子水平对肿瘤发病机制作深入研究。我们利用与鼻咽癌密切相关的EB病毒和TPA的协同作用,观察原代人胚鼻咽上皮细胞逃避老化期后其生物学特性的变化。结果表明,EB病毒感染的人胚鼻咽上皮细胞在原代培养后期老化相关半乳糖苷酶(SA-β-Gal)表达降低,形态学上发生改变,出现转化灶样集落,群体倍增时间降低,体外培养寿命延长,表明EB病毒促使部分原代人胚鼻咽上皮细胞逃避老化期、进入永生化早期阶段。这些研究资料为进一步阐明上皮细胞永生化分子机制及建立人鼻咽上皮细胞永生化模型提供实验依据。

EB病毒潜伏膜蛋白1诱导人鼻咽上皮细胞端粒酶的表达

上皮细胞逃避老化期是细胞永生化过程中一个重要分子事件,端粒酶活性表达是维持人染色体端粒长度、抑制细胞进入老化期的关键因素之一。我们利用最新的端粒酶PCR-ELISA半定量技术,检测永生化早期阶段人胚鼻咽上皮细胞中端粒酶表达的情况,探讨EB病毒在人胚鼻咽上皮细胞永生化过程中的分子机制。结果表明,EB病毒诱导老化前期人胚鼻咽上皮细胞端粒酶表达,从而促使人胚鼻咽上皮细胞逃避老化期、进入永生化早期阶段。此外,我们还首次发现,人胚鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性依赖于EB病毒LMP1蛋白的表达水平和LMP1分子的完整性,LMP1可能通过诱导端粒酶活性表达促进人鼻咽上皮细胞永生化。我们的实验为进一步探讨EB病毒诱导人胚鼻咽上皮细胞永生化的作用机制提供了实验基础。

Epstein-Barr病毒潜伏蛋白1通过核转录因子κB诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性

利用已建立的原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet on LMP1系统等良好的实验模型 ,采用荧光酶报道基因分析法和端粒酶TRAP ELISA技术 ,分别检测EB病毒潜伏蛋白 1(LMP1)诱导的核转录因子κB (NFκB)活性和端粒酶活性 ,从LMP1介导NFκB信号传导途径角度 ,探讨LMP1诱导端粒酶表达的分子机制 .结果表明 ,LMP1可诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性 ,将LMP1羧基端胞浆区突变后 ,可同时下调NFκB活性和端粒酶活性 .在Doxycycline诱导LMP1表达状态下 ,NFκB反式激活活性增强 ,同时端粒酶活性升高 ;进一步应用硫代磷酸化修饰的反义NFκBp6 5寡脱氧核苷酸和IκBα的显性负性突变体分别阻断NFκB活性 ,可降低由LMP1诱导的端粒酶活性 .因此 ,NFκB作为LMP1信号传导途径上的枢纽 ,可能介导了LMP1对端粒酶的表达调控 .

运用蛋白质组学技术研究EB病毒诱导鼻咽癌细胞CNE2表达变化的蛋白质

【目的】寻找并鉴定CNE2细胞在EB病毒感染后表达发生变化的功能蛋白质,为阐明该病毒诱导鼻咽上皮细胞发生生物学变化的作用机制提供线索。【方法】分别从EB病毒感染后的CNE2细胞和未经感染的CNE2细胞中抽提总蛋白质,通过双向电泳分离。运用软件比较分析上述两组的蛋白质表达图谱,寻找表达有差异的蛋白质点。从凝胶上切下差异蛋白质点,通过基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定。【结果】图像分析显示,EB病毒感染后的CNE2细胞和未经感染的CNE2细胞之间存在一些明显差异的蛋白质点。通过MALDI-TOF-MS成功地鉴定了其中4个蛋白质点,EB病毒感染CNE2细胞后蛋白质GRP78和硫氧还蛋白过氧化物酶1表达上调,蛋白质肌动蛋白胞浆组分2和蛋白酶体ι链表达下调。【结论】EB病毒感染鼻咽上皮细胞后引起生物学变化的分子机制可能包括:①诱导细胞大量合成蛋白质以促进增生,同时上调蛋白质GRP78的表达而抗凋亡;②提高细胞内氧化状态而诱导蛋白质硫氧还蛋白过氧化物酶1的表达,并可能通过该蛋白质调控NF-κB和AP-1来影响细胞生长。

EBV诱导鼻咽上皮细胞逃避老化期过程中端粒酶活化和p16^(INK4A)失活

目的 探讨EB病毒诱导人鼻咽上皮细胞逃避老化期的分子机制。方法 SA - β -Gal染色法观察人鼻咽上皮细胞逃避老化期 ;PCR -银染法、S -P免疫组化法分别检测端粒酶活性和 p16 INK4A、p2 1WAF1/CIP1和 p5 3的表达情况。 结果 EB病毒感染组细胞表达SA - β Gal活性下降 ,并表达端粒酶活性 ,而 p16 INK4A蛋白不表达 ,但 p2 1WAF1/CIP1和 p5 3蛋白表达无明显变化。 结论 人鼻咽上皮细胞逃避老化期过程中EB病毒激活端粒酶和抑制 p16

EB病毒感染人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期过程中抑制p16^(INK4a)表达

细胞周期调控紊乱是细胞永生化进程中一个重要的分子事件,本文利用Western blotting和S-P法分别检测p16^(INK4a)、p53、p21^(WAF1/CIP1)和E2F1的蛋白表达,试图从细胞周期调控的角度,探讨EB病毒诱导人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期的分子机制。结果表明,EB病毒通过抑制p16^(INK4a)表达而阻断p16^(INK4a)/Rb途径,上调转录因子E2F1,而对p53、p21^(WAF1/CIP1)表达无明显的影响。结果初步揭示,EB病毒介导的p16^(INK4a)/Rb/E2F1细胞周期调控紊乱参与了人胎鼻咽上皮细胞逃避老化期过程,为进一步探讨鼻咽癌发病机制提供了科学依据。

鼻咽泡状核细胞癌中癌细胞群体的AgNORs定量分析

目的 :通过癌细胞核仁组成区 (NORs)蛋白的图像定量分析 ,评价鼻咽泡状核细胞癌的癌细胞群体增生能力。方法 :对18例鼻咽泡状核细胞癌石蜡切片进行银染 (AgNORs) ,应用CAS2 0 0图像分析仪分别测定泡状核癌细胞群体和梭形癌细胞群体的AgNORs参数值 ,并作比较分析。结果 :与梭形癌细胞群体相比 ,泡状核癌细胞群体具有较高的每核AgNOR计数、每核AgNOR面积和平均AgNOR面积 /粒 ,差异均有显著性 ,而且与泡状核癌细胞群体的增殖细胞核抗原 (PCNA)阳性率明显高于梭形癌细胞群体的前研究结果相一致。结论 :泡状核癌细胞群体的增生能力明显高于梭形癌细胞群体 ,增生能力各异的癌细胞群体存在于同一组织类型鼻咽癌中 ,反映了鼻咽癌细胞群体增殖能力的异质性 。

鼻咽上皮细胞的调节性容积回缩能力及机制

用图像分析系统和通道阻断法研究了原代人胎儿鼻咽上皮细胞的调节性容积回缩(regulatoryvolumedecrease,RVD)能力及其机制。结果发现,低渗刺激可诱发鼻咽上皮细胞产生RVD,在160-240mOsmol/L范围内,RVD强弱与渗透压呈“S”形负相关(r=-0.99,P<0.05),与细胞肿胀程度呈“S”形正相关(=0.99,P<0.05)。Cl^-通道阻断剂tamoxifen(20μmol/L),ATP(10mmol/L)或NPPB(100μmol/L)对RVD阻抑率分别为100%(P<0.01),76.3%(P<0.01)和62.7%(P<0.01)。本研究表明,鼻咽上皮细胞受到低渗刺激时可产生RVD,Cl^-通道开放是其RVD的关键机制。

miR-497调控PlexinA4对鼻咽鳞状细胞癌侵袭和迁移能力的影响研究

目的观察miR-497在鼻咽鳞状细胞癌侵袭和迁移过程中的作用及机制。方法收集2017年1月至2018年12月就诊且经病理学确诊的鼻咽鳞状细胞癌患者60例的癌组织及相应癌旁组织,免疫组织化学检测PlexinA4的表达,qRT-PCR检测miR-497及PlexinA4mRNA的表达,以HEP-2细胞系为研究对象,构建稳定过表达miR-497的细胞,Western blot检测PlexinA4的表达量,划线法检测细胞的迁移能力,Transwell法检验细胞的侵袭能力,荧光素酶试验验证PlexinA4与miR-497的靶向关系。结果免疫组织化学结果显示PlexinA4在鼻咽鳞状细胞癌组织中的阳性表达率为86.67%(52/60),明显高于癌旁组织中的阳性表达率33.33%(20/60),差异有统计学意义(χ2=35.556,P=0.000)。qRT-PCR结果显示鼻咽鳞状细胞癌组织中的PlexinA4 mRNA的表达量显著高于癌旁组织,miR-497的表达量显著低于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示miR-497过表达组中PlexinA4的表达明显低于空白对照组与阴性对照组(P<0.001);双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-497与PlexinA4具有靶向关系;miR-497过表达组HEP-2迁移率明显低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01);miR-497过表达组穿透细胞数明显低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论miR-497在鼻咽癌组织中低表达,过表达miR-497可以引起PlexinA4表达量下降,并引起癌细胞侵袭和迁移能力减弱。

CPT-11在鼻咽癌裸鼠组织中时辰给药疗效观察及细胞周期分布变化的初步研究

目的:观察CPT-11(艾力)时辰给药对鼻咽癌裸鼠的疗效、毒副反应以及细胞周期分布的变化,为CPT-11时辰化疗提供实验基础和临床应用参考。方法:统一光照条件下(光照时间7:00～19:00),黑暗时间(19:00～7:00)饲养3周、50只鼻咽癌移植瘤裸鼠模型分为给药组和对照组。给药组荷瘤小鼠在3、9、15、21HALO(Hours After Light Onset设光后小时)腹腔注射CPT-11 66mg/kg;15天后处死所有小鼠,检测各组小鼠的WBC、HB、PLT,然后剥离肿瘤计算各组抑瘤率,制成单个细胞悬液,固定,染色后流式细胞仪测DNA细胞周期含量;并取盲肠组织光镜下观察肠粘膜组织结构。结果:CPT-11对鼻咽癌移植瘤裸鼠有显著性疗效(P<0.01),其中15HALO,抑瘤率最大(P<0.05);而21HALO抑瘤率最小(P<0.05)。15HALO给药组WBC、HB、PLT数均高于其他各组(P<0.05),体重增加明显(P<0.05),光镜下粘膜损伤分级显著降低(P<0.05),21HALO给药组血象、体重增加最少,粘膜损伤分级较高(P<0.05)。9HALO要优于3HALO(P<0.05)。21HALO,3HALO细胞主要分布在G_2期(54.1100±17.3374053.0300±20.79316)。其中15HALO与21HALO差异最明显(P<0.01)。结论:CPT-11对鼻咽癌移植瘤裸鼠有明显的抑制作用且疗效及毒副作用呈现时辰节律变化(15HALO最优,21HALO最差),为CPT-11时辰化疗的临床应用提供了参考。

早期鼻咽NK/T细胞淋巴瘤不同亚型间临床特征、疗效、总生存率和无进展生存率差异比较

目的:比较早期鼻咽NK/T细胞淋巴瘤不同亚型间临床特征、疗效、总生存率和无进展生存率的差异。方法:收集本院收治的83例早期鼻咽NK/T细胞淋巴瘤患者的临床资料进行回顾性分析。将83例患者分为2组:NK细胞淋巴瘤59例为A组,细胞毒性T细胞表型24例为B组。比较2组患者临床特征、疗效、生存预后的差异。结果:A组患者病灶局部侵犯、骨质破坏的发生率均明显低于B组(P<0.05);A组患者治疗总有效率(91.53%)较B组(58.33%)显著升高;A组5年总生存率(59.32%)和无进展生存率(45.76%)较B组(29.17%、16.67%)均显著升高(Log-rank=4.22、4.41,P<0.05)。伴有噬血综合征是影响鼻咽NK/T细胞淋巴瘤患者总生存的危险因素(OR=3.03,95%CI:1.53-6.00,P<0.01);性别、肿瘤亚型及累及淋巴结均是影响患者无进展生存的相关因素(OR=2.01、1.12、3.68,95%CI:1.07-3.77、1.05-1.19、1.63~8.27,均P<0.05)。结论:在早期鼻咽NK/T细胞淋巴瘤患者中,T细胞淋巴瘤较NK细胞淋巴瘤更易出现局部侵犯,且近、远期疗效、生存及预后较差,故在临床中应积极采用放化疗综合治疗的方式以改善患者预后效果。

人胚鼻咽上皮细胞的传代培养和克隆生长

应用低血清和无血清培养基成功地获得了人胚鼻咽上皮细胞的传代培养和克隆生长,而无纤维细胞污染。植块培养细胞增殖旺盛,分裂相多见。早期生长晕内可见成群的纤毛细胞,以后逐渐呈现鳞状终未分化。上皮细胞可传代3～5次,存活期可达80天,组织块可重复植块培养3～4次,克隆形成率平均为12％。培养基中缺少氢化可的松,胰岛素时克隆形成率明显下降,血清浓度为1％时克隆形成率最高。此实验为鼻咽癌研究提供了一个新的模型。

DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2'-脱氧胞苷对人鼻咽癌细胞株CNE2的影响

目的探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2dC对人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2的影响。方法应用10-7、10-6、10-5、10-4mol/L浓度的5-aza-2dC,处理人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2 12、24、36、48、72 h后,应用MTT法测定CNE2细胞株的生存情况,应用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。用甲基化特异性PCR检测药物处理前后死亡相关蛋白激酶(DAPK)启动子甲基化状态。结果同一作用时间不同药物浓度组间,细胞存活率差异有统计学意义(P<0.05),且作用72 h对人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2生长抑制作用最强。流式细胞仪检测结果显示:10-4mol/L 5-aza-2dC诱导细胞凋亡最明显(P<0.01)。甲基化特异性PCR显示鼻咽癌细胞株中,5-aza-2dC可成功逆转DAPK基因启动子高甲基化状态。结论 5-aza-2dC对人低分化鼻咽鳞癌细胞株CNE2生长有抑制作用,且呈浓度和时间依赖性。

非小细胞肺癌患者鼻咽上皮特异性蛋白1的表达及临床意义

目的探究鼻咽上皮细胞特异性蛋白1(nasopharyngeal epithelium specific protein 1,NESG1)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的表达及临床意义。方法收集临床及随访资料完整的150例非小细胞肺癌患者的癌组织及相应癌旁正常肺组织并制成组织芯片,利用免疫组织化学技术Envision二步法检测NESG1在肺癌及癌旁组织中的蛋白表达情况。结果 150例非小细胞肺癌患者的癌组织及相应癌旁正常肺组织免疫组化结果示,NSCLC组织中NESG1阳性表达率为33. 33%(50/150),显著高于癌旁正常组织的6. 47%(9/139),2组差异有统计学意义(χ2=32. 03,P=0. 00)。NESG1表达与淋巴结转移、TNM分期和肿瘤大小等临床病理变量密切相关(P <0. 05),而与患者的年龄、性别、组织类型及病理分级差异无统计学意义(P> 0. 05)。Kaplan-Meier生存分析显示NESG1阴性表达组患者的生存时间明显高于NESG1阳性表达组,二者间差异有统计学意义(P <0. 05)。多因素Cox比例风险模型分析显示NESG1是NSCLC患者预后的一项独立因素。结论 NESG1在NSCLC表达上调与肿瘤的发生发展密切相关,是一项独立的预后因素。它在NSCLC中的具体角色、分子机制还需要进一步研究。

TPA对EB病毒体外转化人胚鼻咽上皮细胞的影响

ＴＰＡ对ＥＢ病毒体外转化人胚鼻咽上皮细胞的影响贺智敏，陈主初，邵细芸，何春梅（湖南医科大学肿瘤研究所长沙４１００７８）流行病学资料显示：鼻咽癌（ＮＰＣ）地理区域分布与含ＴＰＡ植物分布明显相关。ＴＰＡ属佛波醇二酯（ＰｈｏｒｂｏｌＥｓｔｅｒ）类，是肿瘤高...

人鼻咽上皮细胞CYP2E1 cDNA克隆及序列分析

目的 :比较正常人胚鼻咽上皮 (HENE)细胞、二亚硝基哌嗪转化的人胚鼻咽上皮 (HENE)所建的细胞系( 742 9)、鼻咽癌细胞系 (HNE1)细胞色素P45 0 2E1(CYP2E1)mRNA表达序列 ,探讨CYP2E1在鼻咽癌变过程中的作用特点。方法 :采用RT PCR方法和DNA重组技术从HENE ,742 9,HNE13种细胞系中克隆的CYP2E1cDNA片段 ,测序并分析其结构改变特征。结果 :①与HENE 2E1比较 ,742 9 2E1存在 846位 (A→T)、90 1位 (A→G)两个点突变 ;HNE1 2E1存在 90 1位 (A→G)一个点突变。②与成人肝来源的CYP2E1CDs序列 (GenBank号为J0 2 843)比较 ,发现HNE1 2E1序列与其完全匹配 ;HENE 2E1序列存在 90 1位 (G→A)点突变。但上述突变对应部位氨基酸序列并无改变。结论 :鼻咽癌发生过程中CYP2E1基因cDNA序列仅存在少数无义突变 ,表现出其高度保守性。

顺铂不同给药方式对鼻咽癌细胞毒性以及细胞周期影响体外研究

目的:采用细胞培养方法研究顺铂不同给药方式对鼻咽高分化鳞癌细胞株CNE-1的细胞毒性以及细胞周期的影响。方法:MTT方法检测顺铂对鼻咽癌CNE-1细胞的半抑制浓度(IC50),1/5IC50为小剂量化疗参考剂量,而IC70则为MTD化疗参考剂量。细胞分4组进行如下处理:A组剂量为1/5IC50的顺铂连续作用96 h;B组剂量为IC70的顺铂连续作用3 h;C组为IC70作用3 h后间隔93 h;D组为未加入顺铂化疗的鼻咽癌细胞株同样条件下培养96 h。采用流式细胞仪进行细胞周期的检测。结果:顺铂对鼻咽癌CNE-1细胞株作用72 h的IC50值为0.26μg/ml,1/5IC50为0.05μg/ml,IC70为0.72μg/ml。顺铂为0.05μg/ml剂量时对CNE-1细胞无明显毒性,但细胞周期研究发现,当其连续作用96 h时,与阴性对照组相比可引起明显G2/M期阻滞(P<0.05);而顺铂剂量为0.72μg/ml连续作用3 h后间隔24 h以及93 h时检测细胞周期变化也出现显著G2/M期阻滞(P<0.05);但在0.72μg/ml的顺铂作用3 h后立即检测细胞周期变化,与相应阴性对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:体外低毒性的小剂量顺铂连续给药可诱导鼻咽癌细胞株CNE-1细胞周期G2/M期阻滞。