魔芋白绢病病原齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的生物学特性与室内毒力

【目的】探明魔芋白绢病的病原微生物类型及其生物学特性,筛选高效杀菌剂,为魔芋白绢病田间综合防治措施的制订和实施提供理论依据。【方法】采用组织分离和土壤稀释法,对具有典型白绢病症状的魔芋植株和附近土壤进行病原分离和纯化,通过形态学和分子系统学鉴定病原菌;采用菌丝生长速率法探究病原的生物学特性和7种药剂(苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、氟硅唑、戊唑醇、噻呋酰胺、烯唑醇及丙环唑)对其室内毒力。【结果】魔芋白绢病病原为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii),其菌丝在OA和PDA培养基生长速度最快,培养3 d,菌落直径达7 cm,菌丝生长速率为2.33 cm/d;25~30℃为最适培养温度,培养3 d,菌落直径达7.2 cm,菌丝生长速率为2.48 cm/d;pH为5~7的偏弱酸环境有利于菌丝生长,生长速率最高达2.33 cm/d;氮源以蛋白胨、碳源以可溶性淀粉利于病原菌丝生长,生长速率分别为2.14 cm/d和2.43 cm/d,显著高于其他处理。戊唑醇、烯唑醇、噻呋酰胺、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和丙环唑对白绢病均具有很好的抑制作用,其中,戊唑醇的防效最好,EC_(50)为0.101 mg/L;其后依次为烯唑醇、噻呋酰胺、苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯和丙环唑,EC_(50)依次为0.165 mg/L、0.185 mg/L、1.026 mg/L、1.842 mg/L和2.112 mg/L。【结论】S.rolfsii为引起土传病害魔芋白绢病的病原,其适宜生长温度为25~30℃,弱酸和营养丰富的环境有利于病原菌丝生长,戊唑醇可有效抑制菌丝生长。

室内模拟旱直播稻田环境下齐整小核菌Sclerotium rolfsii菌株SC64致病力的影响因子及除草效果的研究

本文通过温室盆栽试验,以鳢肠Eclipta prostrata为例,研究杂草叶龄、不同含菌丝体基质接种量以及温度、土壤湿度、保湿期时间等环境因子对菌株SC64侵染鳢肠的影响。在此基础上,温室条件下模拟旱直播水稻田环境下菌株SC64防治节节菜Rotala indica、异型莎草Cyperus difformis、鸭舌草Monochoria vaginalis和耳叶水苋Ammannia arenaria的试验。结果表明,鳢肠幼苗在5叶期以下,接种含菌丝体固体基质剂量在100g m 2以上,温度范围27～33℃,土壤相对饱水90%左右,并且接菌后湿度保持至少24 h,是菌株SC64达到理想除草效果的必需条件。温室模拟试验结果显示,接种含菌丝体固体基质剂量在120 g m 2时,28 d可引起节节菜和鸭舌草81%和74%的植株死亡率及83.8%和82.5%的鲜重抑制率;对异型莎草和耳叶水苋的防效稍差,仅能引起约50%的植株死亡率及60%～65%的鲜重抑制率。这表明菌株SC64可有效控制阔叶杂草,具有开发作为生物除草剂的潜力。

齐整小核菌胞外多糖的研究

鉴定了一株产胞外多糖的齐整小核菌,经纸层析、旋光度和红外光谱研究表明。该菌产生的多糖是由葡萄糖按β-键形成的多聚糖,可耐受高温、高盐和较广范圈的pH,具良好的增粘性和剪切稀释性能。

哈茨木霉T_2菌株提取物对齐整小核菌抑菌活性的测定

采用甲醇法、乙醇法、超声波水法、碱法等4种方法对哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)T2菌株分生孢子中的抗菌物质进行了提取,并测定了各种粗提物对齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的抑菌活性及温度对粗提物抑菌活性的影响.结果表明,用不同方法提取的哈茨木霉T2菌株粗提物对齐整小核菌有不同程度的抑制效果,其中以超声波水法提取物对齐整小核菌的抑制效果较好,温度对粗提物的抑菌活性有明显的影响.

齐整小核菌和禾长蠕孢菌稗草专化型复配防除直播稻田杂草的试验研究

由齐整小核菌Sclerotium rolfsii SC64和禾长蠕孢菌稗草专化型Helminthosporium gramineum f.sp.echinochloae（Hge）开发的生物除草剂菌克阔和克稗霉,分别防除阔叶草、莎草和稗草,将其复配可能一次性控制直播稻田稗草、阔叶草和莎草等主要杂草。因此在南京江浦农场进行了大田试验,设置了9种不同处理以评价其防除效果。结果表明,菌克阔对水苋菜和鳢肠7 d的株防效随浓度由低到高分别为25.7%-67.8%和21.9%-66.3%,21 d的鲜重防效为26.8%-59.0%和52.4%-82.0%,最优防效高于化学除草剂,其中该菌对马松子的防效差于前两者;对异型莎草7 d的株防效随浓度由低到高为38.7%-63.8%,21 d的鲜重防效为58.5%-87.7%,最优防效高于化学除草剂,因此该菌能有效防除水苋菜、鳢肠等阔叶杂草和异型莎草,防效随着用量的增加而增大;克稗霉对稗草7 d的株防效随浓度由低到高为40.7%-70.6%,21 d的鲜重防效为37.4%-80.5%,最优防效高于化学除草剂,因此该菌能够有效防除稗草,防效随着用量的增加而增大。与单用菌克阔或克稗霉仅分别对阔叶和莎草或稗草有效不同,复配明显提高了总草防效,7 d总草株防效从38.0%-71.0%,21 d的鲜重防效从40.2%-78.0%,防效随着复配剂量的增加而增大。其中,最优防效显著高于化学除草剂处理,说明菌克阔和克稗霉复配能有效防除主要杂草,可以替代化学除草剂应用于直播稻田。

齐整小核菌发酵产胞外多糖的培养基优化研究

为提高齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)发酵产胞外多糖能力,该研究对培养基不同碳源、不同氮源和无机盐进行优化,采用单因素试验、最陡爬坡试验和响应面(Box-Behnken)设计试验等方法优选培养基配方。结果表明,最优培养基配方为葡萄糖136 g/L、胰蛋白胨7 g/L、硝酸钠4 g/L、氯化钾0.5 g/L、磷酸氢二钾1.3 g/L、硫酸镁0.4 g/L和硫酸亚铁0.1 g/L。在此优化条件下,多糖产量最高,为(23.76±1.05)g/L,相比原始培养基提高54.42%。

油茶白绢病原菌齐整小核菌分子检测的研究

目的:设计特异性引物建立油茶白绢病齐整小核菌的快速分子检测体系。方法:扩增齐整小核菌核糖体DNA ITS区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异,设计了特异性引物BF1和BR2。结果:该引物可以从齐整小核菌中扩增得到约540bp特异性条带,而扩增其它近似或相关菌株时没有相应的特异性条带。在25μL PCR反应体系中,引物BF1和BR2检测灵敏度为1pg浓度DNA。结论:利用设计的BF1和BR2特异性引物结合PCR方法可快速的扩增出齐整小核菌DNA,检测灵敏度为1pg.但在生产实践中诊断油茶白绢病发病前组织中的齐整小核菌还需要进一步研究。

齐整小核菌SCL2010产小核菌多糖培养基优化的研究

采用单因素和正交试验对小核菌多糖高产菌株齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)SCL2010的培养基成分进行了深入地筛选与优化。结果表明,最佳培养基配方为葡萄糖45.0 g/L,玉米浆1.5 g/L,NaNO_32.0 g/L,K_2HPO_4·3H_2O 2.0 g/L,柠檬酸0.7 g/L,MgSO_4·7H_2O1.5 g/L,KCl 2.0 g/L。在此优化条件下,小核菌多糖的产量为31.81 g/L,碳源转化率为70.69%。采用发酵罐进行小试放大试验,小核菌多糖的产量达到31.86 g/L,碳源转化率为70.80%,发酵液表观黏度达到4 500 m Pa·s,并将发酵时间缩短至60 h左右,具有显著效果。

城市绿地中立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR快速检测方法

【目的】土传病原真菌立枯丝核菌Rhizoctonia solani和齐整小核菌Sclerotium rolfsii严重威胁园林绿化植物正常生长。建立针对这2种土壤病原真菌的快速定量检测方法。【方法】通过筛选2种病原菌特异性引物,优化反应条件。【结果】初步建立了2种病原菌的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法。引物ST-RS1/ITS4和SRITSF/SRITSR可以分别用于立枯丝核菌和齐整小核菌的qPCR检测,其灵敏度分别达24×10^(6)和22×10^(6)拷贝·L,2次重复反应的变异系数分别为3.37%~4.61%和0.66%~8.61%。对上海绿地土壤样品的检测结果表明:立枯丝核菌和齐整小核菌的检出率分别为100%和19%。【结论】建立的qPCR检测方法具有较强特异性、较高灵敏度和较强重复性,可以用于上海城市绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的快速、有效定量检测。

间歇性热处理对齐整小核菌核生活力的影响

该文作者通过对用不同营养基质培养出的齐整小核菌菌核作间歇性热处理,其试验结果表明: 菌核致死温度为55℃10分钟;但五种培养基中培养出的菌核在热处理中萌发无显著差异。

防控花生白绢病的根际放线菌分离鉴定及防效评价

花生白绢病是由齐整小核菌Sclerotium rolfsii Sacc.引起的发生在花生茎基部的真菌病害,严重制约花生的品质与产量。本研究利用稀释涂布法从怀牛膝根际土壤中分离纯化了116株放线菌,并从中筛选鉴定了能够防控花生白绢病的菌株。通过平板对峙试验筛选得到两株抑菌活性较好且稳定的菌株Soil-1-5和Soil-3-28,它们对齐整小核菌的抑制率分别为80.43%和92.34%。根据形态学观察、生理生化试验及16S rRNA基因序列分析鉴定,两株菌分别被鉴定为疮痂链霉菌Streptomyces scabiei和藤黄灰链霉菌Streptomyces luteogriseus。采用菌丝生长速率法测定了拮抗菌株无菌发酵滤液对植物病原菌的抑制作用。结果表明,菌株Soil-1-5和Soil-3-28的无菌发酵滤液稀释5倍后对齐整小核菌的抑制率分别为73.67%和57.11%,且对禾谷镰孢菌等6种植物病原菌均有不同程度的抑制作用。此外,两菌株的无菌发酵滤液对齐整小核菌菌核萌发和菌核形成也有较好拮抗作用。盆栽试验结果表明,菌株Soil-1-5和Soil-3-28对花生白绢病的防治效果分别为51.92%和31.74%,其中菌株Soil-3-28对花生生长有促进作用。综上,菌株Soil-1-5和Soil-3-28对花生白绢病有较好的防治效果,具有潜在应用价值。

花生白绢病菌拮抗细菌的分离鉴定及其温室抑菌促生效果

由齐整小核菌Sclerotium rolfsii Sacc.侵染引起的土传真菌性病害——花生白绢病,严重威胁花生的生产。为挖掘对花生白绢病有较好防治效果的拮抗细菌,利用稀释涂布法从感染S.rolfsii的植株根际土壤中分离得到570株细菌,采用平板对峙法筛选出32株S.rolfsii拮抗细菌,结合16S rRNA基因序列、形态学及生理生化特征,确定细菌的分类学地位。通过S.rolfsii与拮抗细菌的发酵液共培养和盆栽试验结果表明:在所筛选的32株拮抗细菌中,4株细菌HNZZ23、HNKF5、HNXX14和HNXX169对S.rolfsii的抑制时间长,抑制效果好,其发酵液对S.rolfsii菌丝生长的抑制率分别为85.30%、85.88%、85.16%和91.00%,对S.rolfsii菌核萌发的最大抑制率分别为100%、85.33%、82.67%和93.33%。菌株HNZZ23和HNXX14的发酵液对盆栽花生白绢病的防治效果分别为30.50%和25.73%,且菌株HNZZ23对花生植株的生长具有显著的促进作用。经分类学鉴定,菌株HNZZ23、HNKF5、HNXX14和HNXX169分别为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeuse、短小芽孢杆菌B.pumilus、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa和枯草芽孢杆菌B.subtilis。本研究结果表明,感病花生根际细菌HNZZ23、HNKF5、HNXX14和HNXX169对花生白绢病原菌S.rolfsii具有良好的拮抗作用和生防潜力,可为花生白绢病的生物防治提供优质菌种资源。

发酵法生产小核菌多糖

本文报道小核菌多糖产生菌株的筛选及一株齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)No.1产生胞外多糖的条件。在16升自控罐发酵试验中,多糖产量达14.14g/l,多糖对底物的转化率为47.52%。

一株小核菌多糖高产菌及其发酵特征

从感染白腐病的马铃薯中分离筛选了一株高产小核菌多糖菌株,命名为齐整小核菌SCL2010(Sclerotium rolfsii SCL2010),对菌株SCL2010发酵培养基的碳源、有机氮源进行优化,并对发酵过程中pH值的变化进行了研究。结果表明,以葡萄糖为碳源、玉米浆为有机氮源对菌株SCL2010进行发酵,小核菌多糖的产量、碳源转化率和产物合成速率分别达到28g·L^(-1)、56%和0.39g·L^(-1)·h^(-1),显著高于已有研究报道。在发酵产小核菌多糖的过程中,其pH值的变化与已有研究报道显著不同:其pH值从发酵开始迅速下降至3.0以下后开始缓慢上升至3.5~4.0;如果控制pH值则使小核菌多糖的产量显著降低,而草酸含量升高,以此推测小核菌多糖的合成可能与pH值的变化有关,后续将进行深入研究。

多种杀菌剂对辣椒白绢病防效的综合评价

为了评价防控辣椒白绢病的化学杀菌剂杀菌效果,对7种杀菌剂原药、14种杀菌剂制剂及复配组合的室内生物活性、盆栽和田间防效进行了综合评价。室内生物活性测定结果表明:97%咪鲜胺粉剂、98%咯菌腈粉剂、96%吡唑醚菌酯粉剂原药单剂对辣椒白绢病菌的抑菌效果比较明显,EC50值为0.0006~24.4884 mg·L^(-1);97%恶霉灵粉剂+96%吡唑醚菌酯粉剂原药复配具有明显的增效作用;42%肟菌·戊唑醇悬浮剂、25%吡唑醚菌酯悬浮剂、15%三唑酮可湿性粉剂等8种制剂的EC50值较小,能明显抑制菌丝生长;25%吡唑醚菌酯悬浮剂+42%肟菌·戊唑醇悬浮剂等6种复配剂对辣椒白绢病菌的抑制作用较好,均表现为明显的增效作用。通过盆栽试验筛选得到防效较好的42%肟菌·戊唑醇悬浮剂、15%三唑酮可湿性粉剂、25%吡唑醚菌酯悬浮剂3种制剂及25%吡唑醚菌酯悬浮剂+42%肟菌·戊唑醇悬浮剂、43%戊唑醇悬浮剂+40%五氯硝基苯可湿性粉剂2种复配组合防效最好,防治效果为97.58%~100.00%。经田间试验验证,15%三唑酮可湿性粉剂和25%吡唑醚菌酯悬浮剂+42%肟菌·戊唑醇悬浮剂复配具有明显的防治效果,防效分别为85.81%和82.02%。试验获得防治辣椒白绢病的最优杀菌剂类型为甲氧基丙烯酸酯类和三唑类杀菌剂,其中15%三唑酮可湿性粉剂、25%吡唑醚菌酯悬浮剂+42%肟菌·戊唑醇悬浮剂复配可用于大面积的辣椒白绢病综合防控。

附子白绢病拮抗细菌的分离鉴定及发酵条件优化

【目的】从黄粉甲中分离获得对附子白绢病病原菌具有较好抑制作用的拮抗细菌,为附子白绢病的生物防治提供菌种资源。【方法】以罹病黄粉甲为材料,通过稀释涂布法和平板对峙法分离并筛选对附子白绢病菌具有拮抗作用的细菌,通过形态结构、生理生化特征及16S rDNA序列分析等对拮抗细菌进行种类鉴定;以拮抗细菌发酵液在600 nm波长下的OD值为指标,采用单因素试验的方法对拮抗细菌的培养基组分以及发酵条件进行优化;通过室内盆栽试验明确拮抗细菌对附子白绢病的防治效果。【结果】采用稀释涂布法从罹病黄粉甲中分离获得4株细菌,经平板对峙法筛选获得对附子白绢病菌具有较好拮抗效果的菌株TS1,该菌对齐整小核菌菌丝生长的抑制率可达68.03%。根据菌株TS1的菌落形态结构、生理生化特征及16S rDNA序列分析结果,确定菌株TS1为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。菌株TS1的优化培养基配方:蛋白胨10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、麦芽糖15.0 g/L;最佳发酵条件:装液量30 mL、初始接种量0.50%、转速210 r/min、培养温度42℃、初始pH 9、培养时间48 h。室内盆栽保护和治疗试验结果表明,菌株TS1对附子白绢病的平均防治效果分别为49.39%和62.97%。【结论】优化的发酵方案可用于快速、大批量培养菌株TS1菌悬液。菌株TS1对附子白绢病有较好的防治效果,具有开发成附子白绢病生防菌的潜力。

MPK4甲基化调控水杨酸信号介导的拟南芥对齐整小核菌菌株SC64的抗性机制

为提升齐整小核菌Sclerotium rolfsii菌株SC64作为生物除草剂的应用潜力,解析植物对其的防御机制,通过比较6种生态型拟南芥Arabidopsis thaliana(Col-0、Ms-0、Gr-1、Se-0、Tu-0和Wa-1)被菌株SC64侵染后病理特征、茎秆木质素水平以及抗病相关基因表达的差异,筛选出抗性最高和抗性最弱的典型生态型拟南芥,通过施加0.1 mmol/L外源水杨酸来验证其在拟南芥防御菌株SC64侵染过程中对木质素代谢及病理的调节作用,并比较分析6种生态型拟南芥水杨酸上游调控通路基因MPK4启动子区域的甲基化差异。结果显示,6种生态拟南芥中Col-0的木质素化程度最高,被菌株SC64侵染时木质素代谢通路基因CAD4和PAL3表达上调最显著,与其抗病能力最强相吻合,而Ms-0的病理表型和抗病能力最弱。外源水杨酸预处理使具典型抗性的生态型拟南芥Col-0受菌株SC64侵染后发病程度加重,木质素化程度减弱,同时木质素代谢通路基因MYB46、LAC17、PAL3和CAD4被菌株SC64侵染后的表达上调程度均显著减弱。另外,6种生态型拟南芥MPK4基因启动子区域CHH甲基化位点数与该基因相对表达量和茎秆木质素水平均呈极显著正相关,而与EDS1基因相对表达量和病斑面积均呈显著负相关。表明拟南芥通过MPK4基因启动子区域CHH甲基化位点数正调控MPK4基因的表达量,从而负调控水杨酸代谢,使得木质素代谢水平提高,最终增强植株对齐整小核菌菌株SC64的抗性。

电穿孔法转化齐整小核菌

【目的】建立齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)的电穿孔法转化方案,以实现经济、快速地遗传转化。【方法】将齐整小核菌gpd基因启动子控制的basta抗性基因bar与红色荧光蛋白基因DsRed Max组成的融合蛋白表达盒,通过电击转入野生型齐整小核菌细胞中,筛选转化子并进行PCR与荧光观察验证。在此基础上,测试了不同电压、脉冲时间、外源DNA片段与受体细胞比例等条件下的转化效率,以得到优化的电转化参数。最后,采用优化的条件,尝试转化多种抗性基因与荧光蛋白融合表达盒以测试其可用性。【结果】成功得到了bar、sdhR与aphI基因的转化子。【结论】成功建立了优化的齐整小核菌电穿孔转化法。优化的参数条件为电压2kV/cm、脉冲时间1 ms、DNA/匀浆细胞比例3μg/300 mg,电击1次。

基于Golden Gate技术的齐整小核菌转录单元高效组装系统

【目的】为齐整小核菌代谢工程研究建立高效的转录单元组装系统。【方法】通过应用Golden Gate技术,以mobius assembly为基础,分别设计并构建DNA元件标准化接口改造、单转录单元组装、应用质粒(多转录单元)组装等功能的载体,从而形成一套完整的多转录单元组装系统。【结果】构建了2个用于DNA元件标准化接口改造的Level 0载体,4个用于单转录单元组装的Level 1载体,4个用于应用质粒组装的Level 2载体和13个应用质粒组装的辅助质粒。然后应用此系统为齐整小核菌组装了若干经过标准化接口改造的DNA元件质粒、单转录单元质粒和硬葡聚糖相关基因的功能分析质粒。所构建的最终应用质粒可以同时适用于齐整小核菌的根癌农杆菌介导转化法、电穿孔转化法和原生质体转化法。【结论】此质粒系统具有强大的DNA设计、组装和容纳能力,为未来齐整小核菌代谢工程和功能基因组学研究提供了高效的质粒构建技术平台。

上海城市绿地土壤立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)空间分布特征

为了明确严重危害上海园林绿化植物的立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)在绿地土壤中的分布特征,本研究采用实时荧光定量PCR方法对土壤中两种病原菌ITS基因丰度进行了定量测定,结合土壤理化性质,分析了两种病原菌在上海绿地土壤中的分布及主要影响因素。结果表明:绿地土壤pH偏碱性,含水率偏高,各理化指标变异系数较高;绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌的检出率分别为99.7%和11.6%,检出样品ITS基因的平均丰度分别为9.09×10^(5)和2.42×10^(5)copies·g^(-1);立枯丝核菌ITS基因丰度在公园绿地和道路绿地土壤中存在显著性差异(P<0.05),在中心城区和郊区绿地土壤中的丰度差异不显著(P>0.05),表明其丰度受绿地类型影响显著;齐整小核菌ITS基因丰度在公园绿地和道路绿地以及中心城区和郊区绿地土壤中差异均不显著(P>0.05),其丰度与土壤全铬、全镍呈显著负相关,与土壤全砷呈极显著负相关。研究结果为防控上海绿地土壤中立枯丝核菌和齐整小核菌病害的发生提供了基础数据。