应用RT-PCR方法检测水稻植株和介体昆虫体内的水稻齿叶矮缩病毒

将生物学接种和 RT- PCR检测水稻植株体内的水稻齿叶矮缩病毒的方法进行了比较 ,发现结果基本趋于一致 ,但总体上 RT- PCR检测阳性率稍高于生物学接种的发病率。将生物学接种检测褐飞虱介体内水稻齿叶矮缩病毒方法与 RT- PCR检测方法进行比较分析 ,发现 RT- PCR方法可以检测单头褐飞虱体内的水稻齿叶矮缩病毒 ,具有很高的准确性和灵敏度。

水稻齿叶矮缩病毒的研究进展

水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)属呼肠孤病毒科水稻病毒属,其所致的水稻齿叶矮缩病是东南亚、东亚和南亚一些国家的重要病害,病害的发生对当地的水稻生产造成严重影响。综述了国内外有关RRSV的生物学、分子生物学方面的研究进展及其所致病害的控制策略。

转基因水稻对水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)抗性评价

采用人工繁殖带毒褐飞虱（ Ｎｅｌａｐａｒｖａｔａ Ｌｕｇｅｎｓ） 攻毒接种，结合症状观察和ＲＴＰＣＲ 检测方法，对５７ 个含有水稻齿叶矮缩病毒（ＲＲＳＶ） Ｓ７ ，Ｓ９ 和Ｓ１０ 基因片段的转基因水稻对水稻齿叶矮缩病毒的抗性进行了评价。总体而言，大多数转基因稻发病率比受体品种的发病率要低。从中初步得到对ＲＲＳＶ 具有较强抗性的水稻转基因系３１５ 和３１６ ，其发病率分别为１５ ．８ ％ 和１３ ．３ ％ ；具有中等抗性的水稻转基因系１８４ 和３２８ ，发病率分别为２６ ．９ ％ 和２８ ．０ ％ ；而对照受体品种和当地感病品种的发病率则分别为１００ ％ 和８４ ．２ ％ 。将ＲＴＰＣＲ 的方法用于转基因稻抗性的检测，可提高检测的灵敏度。

水稻齿叶矮缩病毒Segment 9 dsRNA的序列分析及其在大肠杆菌DE3中的表达

通过有机试剂抽提，ＣＦ－１１纤维素柱层析，从感染水稻齿叶矮缩病毒菲律宾分离株（ＲｉｃｅＲａｇｇｅｄＳｔｕｎｔＶｉｒｕｓ，Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｉｓｏｌａｔｅ，简称ＲＲＳＶ－Ｐ）的水稻植株中获取该病毒的全基因组，即获得从Ｓｅｇｍｅｎｔ１到Ｓｅｇｍｅｎｔ１０（Ｓ１－Ｓ１０）的１０条双链ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ），然后设计合适的引物，用ＲＴ－ＰＣＲ方法得到Ｓ９的ｃＤＮＡ并将其克隆到ｐＵＣ１１９质粒上扩增，以双链测序法测定该ｃＤＮＡ的全序列。同时又将此ｃＤＮＡ克隆到大肠杆菌表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ上，在大肠杆菌菌株ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达，经超声波破菌、离心、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和层析，得到纯化的分子量为６４ｋＤ的融合蛋白。

水稻齿叶矮缩病毒在水稻病叶及传毒媒介昆虫组织内的形态

用饲毒后的褐稻虱进行单虫单苗接种,稻苗发病率达60％以上。对病株的叶脉脉肿部位及相应编号的褐稻虱唾液腺进行超薄切片后,在电子显微镜下观察,病株的筛管细胞和传毒昆虫的唾液腺细胞内可见到大量病毒颗粒,并以晶状排列或者包裹于管状组织中。病毒颗粒大小约为70nm,具有45nm致密核心为双链RNA的组成部分,在核酸和核衣壳之间尚有空隙。本文对病毒的细微结构进行了讨论,并提供进一步证据,说明我国发现的RRSV和国外报道起源于东南亚的RRSV是同一种病毒。

水稻齿叶矮缩病毒P8蛋白的抗体制备及其在水稻原生质体内的表达动态

水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus,RRSV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)成员。该病毒引起的水稻齿叶矮缩病在我国南方发病严重,成为我国水稻生产上的重要病害。通过建立水稻原生质体培养体系,对RRSV主要外壳蛋白P8在水稻原生质体内的复制与表达情况进行研究。通过原核表达对P8蛋白进行抗体制备,抗血清经Western印迹检测具有特异性,间接ELISA测得其效价为2 500倍左右。以制备的抗血清为探针,通过Western印迹检测到P8蛋白在病毒侵染原生质体后24h开始表达,48h左右达到最大值,60h后开始下降,但仍保持在较高水平;同时,利用荧光定量PCR技术,对病毒侵染水稻原生质体后的P8RNA含量进行检测,结果表明,P8RNA在8h时开始积累,32h左右达到最大值,48h后表达量开始下降到一个平台期。

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白的原核表达、抗血清制备及初步应用

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白由基因组片段S10编码。从RRSV福建沙县分离物(RRSV-F)中获取该病毒的全基因组,根据RRSV泰国分离物核苷酸序列设计特异性引物获得S10编码区,利用Directional TOPO克隆技术,将S10连接至克隆表达载体pET100/D-TOPO构建重组质粒,并进行了序列测定和分析。重组质粒经IPTG诱导在BL21star(DE3)E.coli中高效表达约35 kD Pns10蛋白。将Pns10蛋白免疫新西兰大白兔制备了特异性的抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价为1∶7 680,Western blot分析表明抗血清特异性强。表达产物及抗血清在Pns10蛋白的结构和功能研究中具有重要的应用价值,制备的抗血清可用于水稻病株和传播介体的检测以及病毒病的诊断。

水稻齿叶矮缩病毒Pns10蛋白在水稻原生质体内的表达

【目的】水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)Pns10蛋白在介体昆虫细胞内可形成类似病毒原质(viroplasm)的内含体,是RRSV侵染介体所必需。然而Pns10蛋白在水稻寄主中是否具有类似功能及其表达情况如何未见报道。【方法】利用大肠杆菌系统表达Pns10蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体;通过水稻原生质体病毒侵染体系,利用免疫荧光技术分析Pns10蛋白在水稻原生质体内的分布情况,利用实时定量PCR技术和Western blot技术分别检测Pns10 RNA和Pns10蛋白在水稻原生质体内的积累情况。【结果】将Pns10基因克隆到Gateway系统原核表达载体p DEST17中,IPTG诱导表达成功后,制备融合蛋白抗血清。Western blot检测显示,该抗血清可检测感病水稻叶片中的Pns10蛋白。病毒侵染水稻原生质体后,Pns10蛋白可形成类似病毒原质的内含体;Pns10 RNA在病毒接种8 h后开始积累,24 h后达到最大值,随后开始下降;Pns10蛋白在24 h后开始表达,之后维持较高水平,60 h后略有下降。【结论】成功获得了Pns10抗血清;Pns10在水稻原生质体内成功表达,可形成类似病毒原质的内含体,并且Pns10 RNA的表达先于其蛋白的表达。

广西南方水稻黑条矮缩病毒及水稻齿叶矮缩病毒的分子检测

【目的】探索南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)和水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的分子检测技术,了解两种病毒在广西的分布,为生产上开展两种病害的防治奠定基础。【方法】用RT-PCR技术检测采自广西各地的水稻、杂草及稻飞虱样品;用CF-11纤维素粉提取水稻茎叶组织中的dsRNA,1.5%琼脂糖凝胶电泳观察dsRNA图谱。【结果】从水稻、稗草、五节芒、李氏禾和白背飞虱样品中获得850bp左右的SRBSDV序列,从水稻和褐飞虱样品中获得700bp左右的RRSV序列;首次从五节芒和李氏禾中检测到SRBSDV。SRBSDV单独侵染、SRBSDV和RRSV复合侵染可见8条dsRNA条带,但带谱不一致;RRSV单独侵染可见5条dsRNA带。在供检测的181株水稻样品中,除了来自北海、贵港和梧州市的水稻样品外,其余样品均检测到SRBSDV;除了来自梧州、贺州、玉林、贵港和来宾的水稻样品外,其余样品均检测出RRSV;其中带SRBSDV的样品数占44.8%,带RRSV的样品占21.5%,两种病毒复合感染占11.0%。【结论】研究设计的特异性引物能用于RT-PCR检测SRBSDV和RRSV、水稻样品提取dsRNA能快速直观地鉴定SRBSDV、RRSV单独感染及混合感染水稻。用设计的引物首次检测出SRBSDV的两种新寄主五节芒和李氏禾。

水稻齿叶矮缩病毒非结构蛋白Pns7在水稻原生质体内的表达动态

水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus,RRSV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)。该病毒编码的非结构蛋白Pns7在昆虫细胞中可形成伸出细胞膜的纤维丝状结构。本研究利用水稻原生质体培养体系,对Pns7蛋白在水稻原生质体内的复制与表达情况进行了分析。本研究首先构建了Pns7蛋白的原核表达载体,通过IPTG诱导获得大量Pns7蛋白,免疫兔子获得抗血清。Western blot证明抗血清具有特异性,间接ELISA测得其效价为1∶2 500。利用实时荧光定量PCR技术,对病毒侵染水稻原生质体后的Pns7 RNA含量进行检测,结果表明:Pns7 RNA在8 h时开始积累,24h左右达到最大值,32 h后表达量维持在一个平台期;同时,以制备的抗血清为探针,通过Western blot检测到Pns7蛋白在病毒侵染原生质体后16 h开始表达,32 h左右达到最大值,60 h后开始下降,但仍保持在较高水平。

2011-2012年三种水稻矮缩病在我国的分布及发生调查

水稻黑条矮缩病毒、南方水稻黑条矮缩病毒和水稻锯齿矮缩病毒均可以引起水稻矮缩病。于2011-2012年,利用dot-ELISA和RT-PCR方法对江苏、浙江、江西、广西、海南、云南、贵州、四川、重庆、湖南等省的水稻矮缩病进行调查。检测结果表明,2011年水稻中3种矮缩病的病毒感染率分别为:水稻黑条矮缩病毒10.92%,南方水稻黑条矮缩病毒30.67%,水稻齿叶矮缩病毒4.62%。2012年水稻中3种矮缩病的病毒感染率分别为:水稻黑条矮缩病毒0.40%,南方水稻黑条矮缩病毒48.38%,水稻齿叶矮缩病毒26.32%。检测结果说明2012年的南方水稻黑条矮缩病害、水稻齿叶矮缩病害重于2011年,水稻黑条矮缩病害轻于2011年。水稻黑条矮缩病主要发生于江苏、浙江等省;南方水稻黑条矮缩病主要在广西、海南、云南、贵州、重庆、浙江等省区流行;水稻齿叶矮缩病在广西、海南、云南等地均有发生,且往往与南方水稻黑条矮缩病毒复合感染。

病毒来源的转基因水稻对靶病毒的抗性评价

通过连续3年对236个病毒来源的转基因水稻系(包括T1,T2和T3代)对靶病毒水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的抗性进行评价,发现抗性与所转RRSV基因片段有相关性,且随着繁殖世代的增加,转基因水稻的抗性逐渐减弱。

防治褐飞虱的药剂

褐飞虱为迁飞性害虫，只危害水稻，不危害其他作物，成虫和若虫群集稻株茎基部刺吸汁液危害，虫量大时造成植株枯死倒伏；成虫产卵时刺伤植株茎叶，造成大量伤口后加速植株倒瘫。褐飞虱还能传播水稻草状丛矮病毒和齿叶矮缩病毒，引发病毒病，一般8月下旬至9月上旬是褐飞虱发生和危害盛期。