龙眼胚性愈伤组织ACC氧化酶基因的克隆及其在龙眼体胚发生过程中的表达分析

【目的】分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织乙烯合成关键酶ACO(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)基因,并分析该基因在龙眼体细胞胚胎(以下简称龙眼体胚)发生过程中的表达情况。【方法】采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA全长序列和DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(q-PCR)法研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达【。结果】克隆得到龙眼胚性愈伤组织ACO基因1315bp的cDNA全长序列(GenBank登录号为FJ534854),该cDNA的开放阅读框推定的氨基酸序列(含315个氨基酸)与其它植物ACO具有86%-47%同源性,包含了5'非编码区为86bp,3'非编码区为281bp,3'poly(A)尾长13bp;该基因的DNA序列(GenBank登录号为GU123929)长为1660bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,整个变化趋势呈字母"M"状。【结论】确定所获得的序列是龙眼胚性愈伤组织ACO基因的cDNA序列和DNA全长序列;该基因在不完全胚性紧实结构和心形胚的表达量为两个峰值。

龙眼胚性愈伤组织2个乙烯受体基因的克隆及序列分析

以龙眼胚性愈伤组织为材料,采用同源克隆和RACE方法分离得到两个乙烯受体基因的cDNA序列,即DL-ETR1和DL-ERS1,并在GenBank登录(检索号分别为FJ513322和FJ513323)。DL-ETR1全长为2611bp,包含长2223bp的完整的开放阅读框(ORF)以及388bp的3-UTR,3'poly(A)尾长24bp;DL-ERS1全长为2259bp,包含一个1929bp的ORF及330bp的3-UTR,3'poly(A)尾长17bp。两者根据核苷酸序列推测的蛋白质具有61.62%的同源性,在N端的同源性较C端高,DL-ERS1比DL-ETR1少104个氨基酸,DL-ERS1的蛋白在C端缺乏信号接受域,HisKA、ATPase_c以及GAF是它们共有的结构域,同属ETR1亚类乙烯受体。

龙眼胚性愈伤组织肌动蛋白基因(actin)片段的克隆与序列分析

采用同源克隆方法从龙眼胚性愈伤组织分离肌动蛋白基因(actin)。通过保守区和3’RACE扩增,分别获得347bp和837bp的特异片段,经过序列拼接得到895bp的龙眼actin基因3’端序列。与多种植物的肌动蛋白基因进行同源性比较,该片段的核苷酸序列同源性多在80%以上,氨基酸序列同源性大于90%,具有高度保守性。可作为龙眼体胚发生过程中基因表达分析的内参。

光周期对龙眼胚性愈伤组织类黄酮类胡萝卜素含量及合成相关基因的表达影响

[目的]研究不同光周期对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累、细胞酶活性的影响,以及对类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因表达的影响。[方法]以龙眼松散型胚性愈伤组织为材料,研究全光照24 h/0 h L/D、长光照18 h/6 h L/D、半光照12 h/12 h L/D、短光照6 h/18 h L/D、全黑暗0 h/24 h L/D 5种光周期处理下龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素积累、细胞保护酶的变化,以及类黄酮和类胡萝卜素合成相关基因的表达。[结果]短光照处理下龙眼胚性愈伤组织中类黄酮的含量和产量最高;全光照处理下龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素含量和产量最高;不同光周期处理下SOD、POD和H2O2的表达趋势基本一致;PRO含量仅全光照时比CK黑暗时期含量高;PAL含量在短光照时最高,与类黄酮短光照时积累量最高的结果一致;光周期处理下类黄酮合成基因CHI和CHS为"M"字表达模式;DFR和F3H为倒"V"字表达模式;类胡萝卜素合成所用的4个基因表达模式各不相同。[结论]该研究表明光周期对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮和类胡萝卜素的积累以及其合成相关基因的表达均有调控作用。

龙眼14-3-3基因及其启动子的克隆以及在体胚发生过程中的表达分析

分离克隆龙眼(Dimocarpus longan Lour.)胚性愈伤组织14-3-3基因,并分析该基因在龙眼体胚发生过程中的表达情况。采用RT-PCR结合RACE法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的cDNA全长序列和DNA序列,采用TAIL-PCR法,获得龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因的启动子DNA序列,运用生物信息学方法对序列进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)研究该基因在龙眼体胚发生过程中的表达。结果表明:经克隆得到龙眼胚性愈伤组织14-3-3基因786 bp的cDNA全长序列(GenBank检索号为GU573765),该cDNA开放阅读框推定的氨基酸序列(含261个氨基酸)与其它植物14-3-3具有较高同源性;该基因的DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为1 859 bp,包含3个内含子,内含子的剪切位点均符合真核生物"GT-AG"规则;该基因的启动子DNA序列(GenBank检索号为GU573766)长为910 bp;该基因在龙眼体胚各阶段均有表达,其中在松散型胚性愈伤组织阶段和心形胚及鱼雷形胚阶段呈现高表达,整个变化趋势呈"倒S"状。