芳香烃龙胆酸降解途径蛋白质组学的研究

芳香烃是一类重要的环境污染物,微生物降解是其主要的处理方法。研究显示降解过程中产生保守型和诱导型的各一组同工酶。目前,仅有保守型的龙胆酸加双氧酶(GDOI)及其下游片段被克隆。产碱假单胞菌NC IB9867(P25X)的突变株--SNZ28 GDO I被打断,在龙胆酸诱导的情况下,该突变株仍能检测到龙胆酸加双氧酶活性。采用二维蛋白电泳分析突变株SNZ28在有和没有龙胆酸诱导条件下的蛋白质表达差异。电泳结果显示了两者存在有15个蛋白点的差异。通过MALD I-TOF和Q-TOF分析,其中的12个蛋白质点与数据库中已知多肽片段有同源性。其中,P4点与青枯菌(Ralstonia species)龙胆酸1,2加双氧酶同源。该结果在蛋白质组学上证实了GDO II的存在。

反向PCR法克隆芳香烃龙胆酸降解途径中诱导型龙胆酸1,2-加双氧酶基因

龙胆酸1,2-加双氧酶(GDO)是芳香烃龙胆酸途径的一个关键酶.产碱假单胞菌P25X具有保守性与诱导性各一组GDO同工酶,突变株SNZ28的保守型龙胆酸1,2加双氧酶基因(GDOⅠ)被链霉素/奇霉素抗性基因打断,但在含有龙胆酸盐的基本培养基上,仍能明显观察到GDO的活性.由龙胆酸诱导生长的SNZ28全蛋白二维电泳结果分析,获得了一个与Ralstoniasp.U2的GDO酶有极高同源性的蛋白点.根据对该蛋白点的N端和Q-Tof测序的结果,设计了一对简并引物,克隆了诱导型GDO酶的片段,通过对此片段的分析,设计了逆向PCR引物,利用Southern blot杂交,确定了合适的限制性内切酶(SalⅠ和SphⅠ),以单一酶切的P25X基因组DNA自联后的产物为模板,进行反向PCR.测序表明,获得了一段1047bp与Ralstoniasp.U2.的龙胆酸1,2-加双氧酶具有极高同源性的序列.研究结果揭示了SNZ28中存在诱导型GDO酶.本文中也对不同来源的GDO酶进行了比较研究,其结果为进一步对生物降解基因的进化研究打下了基础.

交替三线性分解算法结合高效液相色谱法同时测定水杨酸与龙胆酸

利用交替三线性分解算法（ATLD）与高效液相色谱法相结合,在色谱保留时间为0.662 8～0.949 5min（间隔1/150 min）、紫外吸收波长为268～332 nm（间隔2 nm）且在未知干扰物2,3-二羟基苯甲酸存在下,同时测定了水溶液中光谱及色谱严重重叠的水杨酸（SA）和龙胆酸（GA）的含量,回收率分别为（102.2±6.7）%,（102.1±4.1）%,分辨结果与实际结果一致。研究结果表明：该方法定量快速准确、实验操作步骤简单,说明ATLD算法收敛快速稳定,对复杂体系中组分数估计不敏感,能有效解决色谱中的二阶校正问题。

ESR法研究龙胆酸在碱性溶液中的反应

本文用静态毛细管法研究了龙胆酸在醇钠-醇溶液中的反应,主要是氧化反应,发现了属于同一类型三种新的自由基物种,给出了它们的自由基结构模式;龙胆酸在氢氧化钠水溶液中的反应,不仅有氧化还有取代反应,氧化之后紧接着进行取代反应,本文都给予了解释。

龙胆酸碱性氧化的ESR研究

本文用电子自旋共振波谱法研究了龙胆酸在碱性溶液中的自动氧化。发现龙胆酸的碱性氧化不单纯是氧化过程,同时伴随着OH加到芳环上的变化,这种变化经历了醌中间过程。

铽-EDTA-龙胆酸荧光体系的研究

根据龙胆酸与Ｔｂ—ＥＤＴＡ在碱性溶液中能形成三元配合物产生铽的敏化荧光，建立了检测龙胆酸的高灵敏、高选择性的新方法．在所选定的最佳条件下，龙胆酸的浓度在４．０×１０－８一４．０×１０－６ｍｏｌ·Ｌ－１范围内与体系相对荧光强度成良好的线性关系，方法的检测限为６．９×１０－９ｍｏｌ·Ｌ－１．用该法不经任何分离测定了血浆、血清、尿样中龙胆酸的回收实验，结果满意．

柞蚕茧中龙胆酸及其糖苷的荧光光谱研究

本文以荧光光谱法研究了用6NHCl水解柞蚕茧,发现茧层中的龙胆酸已与丝蛋白交联的交联键和游离的龙胆酸糖苷的糖苷键均不被破坏,此法可用于游离的龙胆酸及其糖苷的定量分析。

桑丝与龙胆酸交联反应电子光谱研究

本文采用白色桑蚕丝素与龙胆酸进行交联反应,得到黄褐色桑蚕丝素,其电子光谱与黄褐色的柞蚕茧丝谱图相同。进一步证实了柞蚕丝黄色生色物质为龙胆酸与丝蛋白的交联物这个结论是正确的。

产碱杆菌Alcaligenes sp.P156中龙胆酸1,2-双加氧酶GdoP的研究

龙胆酸是芳香族化合物微生物降解的核心代谢产物,龙胆酸降解研究对于芳香族化合物的降解研究具有重要意义。龙胆酸1,2-双加氧酶是催化龙胆酸降解的关键酶。本研究利用双加氧酶催化保守结构域在产碱杆菌P156的基因组上通过多序列比对找到一个龙胆酸双加氧酶基因gdoP;利用分子生物学技术对该基因进行异源表达;并利用重组蛋白对酶学性质和动力学参数进行测定。酶学性质研究表明,GdoP催化反应的最适pH为7.5,最适温度为40℃。GdoP是一个Fe2+依赖型双加氧酶,含有Fe2+离子结合结构域。Fe2+离子能够明显促进GdoP酶活,Cu2+、Cd2+离子对GdoP的酶活有明显抑制。以龙胆酸为底物,GdoP的Km值和Vmax值分别为641μmol/L和23.9U/mg。GdoP具有较强的底物特异性,能够催化龙胆酸开环生成3-马来酰丙酮酸,不能催化5-氨基水杨酸、水杨酸和1-羟基-2-萘酸的转化。本研究系统的研究了龙胆酸1,2-双加氧酶GdoP的酶学性质,有助于更好的研究芳香族化合物的微生物降解过程。

Pseudomonas putida ZWL73经龙胆酸途径分解代谢3-羟基苯甲酸

一株4-氯硝基苯(4-CNB)的完全降解菌Pseudomonas putidaZWL73能利用3-羟基苯甲酸(3-HBA)为惟一碳源和能源生长,而且ZWL73在对3-HBA降解的过程中,有中间产物龙胆酸生成;酶学分析的分光光度法证实,ZWL73通过GSH依赖型的龙胆酸途径代谢3-HBA,并且该途径需经3-HBA或龙胆酸诱导.

龙胆酸对B-Z化学振荡反应的影响及其分析测定

利用龙胆酸对四氮杂大环铜催化的B-Z化学振荡体系(NaBrO3-H2SO4-苹果酸-[CuL](ClO4)2)的扰动建立测定龙胆酸的新方法.其分析结果表明龙胆酸的浓度在1.25×10-6～1×10-4mol.L-1之间时,振幅改变值与加入龙胆酸的浓度对数有良好的线性关系,其相关系数为0.99821.同时对各组分浓度的影响及其扰动机理进行了探讨.

烟碱龙胆酸盐的制备、表征和缓释性能研究

【目的】为了研发适用于新型烟草制品,具有缓释烟碱效果的烟碱有机酸盐,【方法】在可与烟碱成盐的有机酸中,以pKa<4.5(优选pKa<3.5)、含有羧基和羟基、可作为食品添加剂等为原则,结合分子对接模拟(YASARA)软件,筛选出烟碱龙胆酸盐。利用X-射线单晶衍射技术解析其晶体结构。以离体猪口腔颊黏膜为跨膜载体,通过药物透皮扩散体外模拟实验,研究对比了不同pH下烟碱及烟碱龙胆酸盐的跨膜扩散行为。【结果】(1)烟碱龙胆酸盐相对分子质量为316.35,晶体密度为1.342 mg/m^3,属单斜晶系,空间群为P21。(2)烟碱龙胆酸盐在低pH介质中具有相对偏慢的渗透速率,跨膜扩散慢。(3)在相同pH条件下,表现出初始浓度越高,稳态渗透速率越大,即跨膜扩散越快。【结论】总体而言,烟碱龙胆酸盐具有明显的缓释扩散特性,且在低pH介质中缓释效果更为显著,可用于新型烟草制品开发。

芳香烃分解代谢的龙胆酸途径

龙胆酸代谢途径是微生物降解芳香烃的 3条典型的代谢途径之一 ,是一条重要但需要深入研究的代谢途经。综述了龙胆酸代谢途径的研究进展 ,特别是分子生物学方面的成果。

PSF多相UV-Fenton体系原儿茶酸与龙胆酸的增效对比

对比研究了原儿茶酸和龙胆酸对聚合硅酸铁(PSF)多相UV-Fenton体系降解橙Ⅱ的增效能力,分析了两种增效体系中铁离子转化、H2O2分解以及·OH生成之间的关系,探讨了两种增效试剂对PSF多相UV-Fenton体系的增效机制.结果表明:原儿茶酸和龙胆酸均能够有效促进催化剂Fe^(2+)生成与释放,进而提高体系·OH的浓度、促进橙Ⅱ的降解.相对原儿茶酸,龙胆酸对PSF的还原能力更强,其相应增效体系中·OH的浓度更高、橙Ⅱ的降解速度更快.0.2mmol/L的增效浓度下,橙Ⅱ在原儿茶酸和龙胆酸增效体系中第一段脱色速率常数能分别从基础体系的0.11min^(-1)提高至1.68和2.48min^(-1),分别增加14.27倍和21.55倍.原儿茶酸和龙胆酸能够循环增效PSF多相UV-Fenton体系降解橙Ⅱ,反应结束后PSF对Fe^(3+)的再吸附使得溶液总铁离子浓度低于5mg/L,从而避免催化剂铁元素的损失以及铁离子的二次污染,表明原儿茶酸和龙胆酸均是PSF多相UV-Fenton体系的高效增效试剂.

青枯雷尔氏菌GMI1000菌株龙胆酸1,2-双加氧酶活性中心关键氨基酸残基的鉴定(英文)

生物信息学分析表明,位于青枯雷尔氏菌GMI1000菌株的染色体上的读码框RSc1087可能编码一个龙胆酸1,2-双加氧酶.本研究克隆、表达了该基因,并通过亲和层析对该基因表达产物进行了纯化.酶学测试结果证实,该基因编码的正是龙胆酸1,2-双加氧酶.SDS-PAGE结果表明,该酶亚基分子量约为38×103.基因的定点突变揭示105位、107位和146位组氨酸残基是该酶活性中心的关键氨基酸残基.

青枯雷尔氏菌龙胆酸1,2-双加氧酶基因的克隆、表达和酶性质的研究(英文)

本研究克隆、表达了青枯雷尔氏菌GMI1000菌株中编码龙胆酸1,2-双加氧酶的基因,并通过亲和层析对该酶进行了纯化,SDS-PAGE结果表明该酶亚基约为38kDa。该酶的最适反应温度和最适pH分别为30℃和7.5。该酶的Km为56μmol/L,pI为4.6～4.8。纯化后的龙胆酸1,2-双加氧高度不稳定:4℃下放置72h即失去85%的酶活。甘油和β-巯基乙醇可稳定该酶酶活,在添加10%(体积比)甘油至酶液(50mmol/L,pH7.3的磷酸盐缓冲液保存)后,-20℃保藏2周后均能检出明显的酶活。0.1～1mmol/LFe2+可以激活或者稳定该酶的酶活。Na+,K+,Mg2+和Ca2+(分别为1～2mmol/L)对该酶的酶活无明显的影响。Mn2+,Zn2+和Fe3+的添加量超过2mmol/L时,酶活急剧下降。1mmol/L的Cu2+即使该酶失去酶活。

龙胆酸-H_2O_2-HRP伏安酶联免疫分析体系测定HRP

提出龙胆酸-H202-辣根过氧化物酶（HRP）伏安酶联免疫分析体系。以线性扫描二阶导数伏安法测定HRP催化H2O2氧化龙胆酸的产物，从而可以测定HRP的活性，进而可应用于免疫分析。在BR缓冲溶液中，龙胆酸的氧化产物在-O．58V（vs·SCE）左右产生灵敏的伏安峰。应用此峰测定HRP的检测限为1．4×10-8g·L－l，线性范围为5．0×10－8～1．0×10-5g·L-1测定了酶标记物羊抗免IgG—HRP。

嗜盐古菌Haloferax volcanii WFD11中龙胆酸1,2-双加氧酶HagA的研究

【目的】研究嗜盐古菌Haloferax volcanii WFD11菌株以不同芳香酸作为碳源的生长情况;鉴定其通过龙胆酸途径代谢芳香酸过程中的开环酶龙胆酸1,2-双加氧酶的基因,并对其进行生化水平的研究;初步揭示古菌和细菌代谢芳香酸的可能差异。【方法】分别以4 mmol/L的6种不同芳香酸为唯一碳源培养菌株WFD11,利用全自动生长曲线分析仪测定菌株生长情况并绘制生长曲线;利用高效液相色谱检测菌株WFD11代谢3-羟基苯甲酸的中间产物;对菌株WFD11的基因组进行生物信息学分析,寻找潜在的龙胆酸1,2-双加氧酶编码基因,并在Haloferax volcanii H1424中异源表达;通过快速纯化系统(采用Ni2+-NTA亲和层析柱)纯化异源表达的蛋白,以龙胆酸为底物通过紫外分光光度计检测粗酶液和纯化后的龙胆酸1,2-双加氧酶和相关酶学特性;通过实时定量PCR观察hag A的表达类型。【结果】菌株WFD11能以4 mmol/L的3-羟基苯甲酸和3-羟基苯丙酸为唯一碳源和能源生长;高效液相色谱检测证明菌株WFD11通过龙胆酸代谢3-羟基苯甲酸(3HBA);克隆和异源表达了龙胆酸1,2-双加氧酶基因hag A;Hag A粗酶液和纯化蛋白均具龙胆酸1,2-双加氧酶的活性,催化龙胆酸开环生成顺丁二酸单酰丙酮酸;Hag A的龙胆酸1,2-双加氧酶比活力为0.024 8 U/mg,且其活性不依赖于Fe2+;荧光定量PCR实验结果证明hag A是组成型表达。【结论】嗜盐古菌H.volcanii WFD11可能是通过龙胆酸途径代谢芳香酸类物质,为进一步研究古菌和细菌代谢芳香酸的可能差异打下了基础。

新型龙胆酸衍生物的合成及其抑制酪氨酸酶活性研究

为发现新型的美白活性化合物,以龙胆酸甲酯、卤代烃和α-羟基酸乙酯为原料,合成了10个未见文献报道的2-羟基-5-烷(H)氧基苯甲酸酯类衍生物(3a,3b和6a～6h),其结构经1H NMR,IR,MS和HRMS确认.初步生物活性测试结果表明6a,6b,6e和6f具有较强的抑制酪氨酸酶活性,进一步药理实验表明经取代改造后的6a～6h,其毒性和光学毒性都相对龙胆酸甲酯和氢醌更低.

真菌对龙胆苦苷的生物转化研究

目的:采用非恒定温度的培养方法,研究5种真菌对底物龙胆苦苷的生物转化。方法:用薄层色谱法(TLC)以及高效液相色谱法(HPLC)检测转化后生成的产物,并用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)定性分析。结果:该研究证明黑曲霉、米根霉、少根根霉、酿酒酵母YS58和毕赤酵母GS115均能转化龙胆苦苷。其中通过GC-MS定性分析,黑曲霉、米根霉、少根根霉以及毕赤酵母GS115的转化产物之一确定为龙胆酸(2,5-dihydroxybenzoic acid)。结论:与龙胆苦苷相比,转化产物龙胆酸同样具有抗炎的药理作用,并且无毒副作用。