龟板提取物抑制细胞衰老缓解SOP小鼠骨量丢失及海马退变

目的探讨龟板提取物(Plastrum testudinis extract,后简称PTE)通过抑制细胞衰老缓解SOP小鼠的骨量丢失及海马退变的作用。方法动物实验:应用传统半乳糖皮下注射+去势法建立老年性骨质疏松症(senile osteoporosis,SOP)模型,将C57/BL6小鼠分为雌性或雄性的CON组、SOP组、SOP+PTE组;SOP+PTE组在造模过程中用PTE 0.5 g/mL灌胃干预4周,取材前1周进行行为学实验,后取大脑、L4椎体,检测骨和海马组织形态学;细胞实验:利用过氧叔丁醇(TBHP)诱导MC3T3/HT22细胞衰老,分别观察诱导后HT22半乳糖苷酶染色、衰老标志物和MC3T3成骨、衰老标志物的变化及PTE相应的治疗效果。结果MicroCT提示雌雄小鼠中,与CON组相比,SOP组骨量丢失,SOP+PTE组骨量则得到了恢复;骨HE切片结果与MicroCT结果相符;海马组织切片提示,与CON组相比,SOP组海马出现退变,而SOP+PTE组退变则得到缓解。在新物体识别实验和时序实验中,与CON、SOP组相比,雄性SOP+PTE组记忆能力明显恢复;但雌雄小鼠旷场实验均无明显变化。②TBHP可诱导MC3T3衰老,降低成骨能力及增加衰老蛋白表达,而当加入PTE后,均能逆转TBHP导致的成骨能力降低与蛋白下降;TBHP亦可增加HT22半乳糖苷酶染色区域,增加衰老蛋白表达,而加入PTE后,上述变化均得到逆转。结论PTE通过抑制前成骨细胞与海马神经元细胞的衰老,缓解SOP小鼠的骨量丢失和海马衰老退变。

龟板提取物对PC12细胞凋亡的影响及其机制

目的:探讨龟板提取物(Plastrum testudinis Extracts,PTE)对6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制。方法:采用无血清培养PC12细胞同时100μmol/mL 6-OHDA损伤24 h的方法建立PC12细胞凋亡模型。细胞分为正常对照组、6-OHDA组及PTE 3、30μg/mL组四组。在施加处理因素24 h后,MTT比色分析测定细胞光密度值,Ammexin V/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blot检测BCL-X/L的表达水平。用Bio-Rad Quantity One凝胶分析系统对条带进行半定量分析。结果:MTT与流式细胞术结果显示PTE能提高PC12细胞活力,降低PC12细胞凋亡率,并呈剂量依赖性,PTE 3、30μg/mL组与模型组比较,差异具有统计学意义。Western blot结果显示龟板提取物使BCL-X/L表达增强,并呈剂量依赖性。结论:龟板提取物具有抑制6-羟基多巴胺诱导PC12细胞凋亡的作用,其作用机制可能与上调BCL-X/L的表达有关。

龟板提取物诱导神经干细胞向神经元分化过程中相关microRNA表达变化

【目的】观察龟板提取物诱导神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元细胞定向分化过程中相关micro RNA表达的变化。【方法】分离培养孕14 d SD胎鼠原代神经干细胞,经免疫荧光染色鉴定神经干细胞的特异抗原及其多向分化能力。神经干细胞随机设空白对照组、龟板提取物低浓度组(3μg/m L)、龟板提取物高浓度组(30μg/m L)。诱导分化7 d,提取各组细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR法检测不同组别mi R-124和mi R-9的变化。【结果】与空白对照组比较,龟板提取物低浓度组mi R-124和mi R-9表达均无显著变化,龟板提取物高浓度组均显著升高(P<0.05)。【结论】龟板提取物可能通过调控mi R-124、mi R-9表达在NSCs向神经元细胞定向分化过程中起重要作用。

维生素D调控龟板提取物促骨髓间充质干细胞增殖分化的研究

目的观察维生素D(Vit D)调控龟板提取物(PTE)促进骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖过程的作用及其机制。方法构建PGL3-Id1启动子,转染大鼠MSCs,PTE分别联合10-6、10-7、10-8mol/L的Vit D作用于转染后的MSCs 36 h,利用荧光素酶检测MSCs中Id1启动子的水平。1、3、30、100μg/m L PTE分别联合10-7mol/L Vit D作用于MSCs 36 h、3 d、7 d,RT-PCR检测VDR的表达。结果 PTE促进了MSCs中Id1的表达,联合应用Vit D,Id1的表达会降低,这种差异具有极显著性统计学意义(P<0.01),且不同剂量Vit D之间比较差异也有极显著性统计学意义(P<0.01)。药物联合作用36 h、3 d和7 d时,均不同程度抑制了VDR的表达;作用36 h时Vit D联合大剂量PTE时抑制作用显著,与不加PTE组比较,差异有统计学意义(P<0.05);而作用3 d和7 d时,Vit D联合大剂量PTE时抑制作用更为明显;不同剂量PTE联合Vit D作用相同时间,不同剂量之间VDR的表达量差异有统计学意义(P<0.05),而相同剂量PTE联合Vit D作用不同时间,7 d与36 h时VDR表达量比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 Vit D抑制了PTE促MSCs的增殖作用,核受体VDR可能是PTE调控MSCs增殖和分化的一个药物作用靶点。

龟板提取物调控毛囊干细胞Wnt/BMP信号通路促进大鼠压疮修复

【目的】基于毛囊干细胞(hair follicle stem cells,HFSCs)Wnt/BMP信号通路,观察龟板提取物(CPTE)对大鼠压疮皮肤的修复效果。【方法】(1)体内实验:将40只SD大鼠随机分为模型对照组、溶剂对照组、CPTE高浓度组、CPTE低浓度组,每组10只。复制SD大鼠压疮模型。测算创面愈合率,采用苏木素—伊红(HE)染色观察大鼠压疮病理变化,采用免疫荧光染色法检测大鼠创面皮肤组织中β-catenin、骨形态发生蛋白4(BMP4)的表达。(2)体外实验:分离培养SD乳鼠HFSCs,采用免疫荧光鉴定细胞表面标志物细胞角蛋白15(CK15)的表达,采用CCK-8法观察CPTE对HFSCs增殖能力的影响,采用Western blot法观察CPTE对HFSCs中β-catenin、BMP4表达的影响。【结果】CPTE 2组大鼠压疮愈合情况优于其他2组。培养的HFSCs细胞表面CK15呈阳性表达;3、10、30μg·mL-1CPTE对HFSCs有促增殖作用;与空白对照组比较,CPTE 3、10μg·mL-1组HFSCs中β-catenin蛋白表达上升,BMP4蛋白表达下降(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。【结论】CPTE可能通过调控HFSCs中Wnt/BMP通路促进SD大鼠压疮创面修复。

龟板提取物激活wnt/β-catenin通路促大鼠触须部皮肤创面修复

目的探讨龟板提取物(Plastrum Testudinis extracts,PTE)对大鼠触须部皮肤创面修复中Wnt/β-catenin通路的调控。方法分离培养SD乳鼠毛囊干细胞(Hair follicle stem cells,HFSCs),免疫荧光检测细胞表面标志物CD34、CD71表达,CCK-8法检测PTE对HFSCs增殖的影响,Western-blot检测PTE对HFSCs中Gsk-3β、β-catenin蛋白表达的作用;制作SD大鼠触须部皮肤缺损模型,随机分为空白对照组、实验对照组、阳性药物对照组、PTE组,测算动物创面面积和愈合率,病理学及免疫荧光检测创面组织。结果培养的细胞形态饱满,折光性强,呈铺路石样,细胞表面CD34及CD71阳性。CCK-8显示PTE对HFSCs有促增殖作用(P<0.01)。PTE作用于HFSCs后,Gsk-3β蛋白(P<0.05)下降的同时β-catenin蛋白表达上升(P<0.001)。术后7 d各组创面基本愈合,PTE组及阳性药物对照组表皮较其他组薄,毛囊周围有新生表皮参与修复,表皮与真皮结合牢固,真皮无炎性细胞,组织结构排列规则,促修复效果优于其他各组;PTE组修复表皮内Gsk-3β蛋白下降而β-catenin蛋白表达上升。结论 PTE可通过激活HFSCs中Wnt/β-catenin通路促进SD大鼠触须部创面修复。

龟板提取物调控Otx2基因促进神经干细胞向多巴胺神经元分化的研究

目的探讨龟板提取物是否能够通过调控同源盒基因Otx2(orthodenticle homeobox 2)来促进神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向多巴胺神经元的分化。方法分离培养孕14 d左右的SD胎鼠NSCs 7 d,随机设空白对照组和30μg·m L^(-1)的龟板有效成分PTE(2B)组、龟板提取物十八酸乙酯(S6)组、4-甾酮(S9)组,诱导分化5~7 d,用免疫荧光法检测多巴胺酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性神经元和Otx2的表达,用实时荧光定量PCR法检测Otx2的m RNA表达,蛋白质印迹法(Western Blot)检测Otx2的蛋白表达。结果与空白对照组比较,2B组、S6组和S9组Otx2和TH的荧光表达均升高(P<0.05),S6组Otx2的m RNA表达升高(P<0.05),S6组和S9组Otx2的蛋白表达升高(P<0.05)。结论龟板提取物可能通过调控Otx2基因促进神经干细胞向多巴胺神经元分化。

龟板提取物上调维生素D受体表达促骨髓间充质干细胞向成骨分化

目的探讨龟板提取物诱导大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymalstem cells,MSCs)向成骨分化和对维生素D受体(VDR)表达的影响。方法从大鼠骨髓中分离MSCs,体外培养,利用流式细胞术检测MSCs表面抗原CD44细胞标志,体外培养MSCs分成不同的组观察其向成骨分化,在培养基中不加任何处理的作为对照组,培养基中加成骨诱导液诱导MSCs向成骨分化作为阳性对照组,龟板提取物组在培养基中加龟板提取物,诱导7d后,通过免疫化学染色、Western blotting、原位杂交、RT-PCR等方法观察龟板提取物对原代培养的MSCs向成骨分化的成骨分化标记分子碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)及VDR阳性表达及VDR mRNA的表达情况。结果免疫组化染色显示,龟板提取物组成骨分化标记分子ALP、OPN和VDR的阳性百分比明显高于对照组,Western blotting结果也显示龟板提取物组的ALP、OPN和VDR的蛋白表达水平高于对照组;同时原位杂交、RT-PCR结果表明,龟板提取物诱导MSCs向成骨分化过程可明显促进VDR mRNA的表达。结论龟板提取物可促MSCs向成骨分化,其机制可能与VDR的上调有关。

龟板提取物对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1表达的影响

目的观察不同剂量的龟板提取物对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1(inhibitor of differentiation 1,Id1)的作用。方法将构建成功的PGL3-Id1启动子用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞,龟板提取物分别作用于转染后的骨髓间充质干细胞12、24、36 h,选取作用最为明显的36 h,每组分别加入0、1、3、30、100μg/mL龟板提取物,药物作用36 h后收集细胞分别应用萤光素酶报告基因系统、RT-PCR和Western blotting检测Id1的表达。结果早期、小剂量龟板提取物对Id1的影响不大;随着时间和剂量的增加,Id1的表达水平也逐渐升高。结论龟板提取物促进了骨髓间充质干细胞中Id1的表达,剂量越大,作用时间越长,促进作用越明显。

龟板提取物靶向BMP4通路抑制PC12细胞凋亡

目的探讨龟板提取物(Testudinis Carapax et Plastrum extracts,TCPE)对血清饥饿诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及其机制。方法采用血清饥饿3 d的方法建立PC12细胞凋亡模型,并将细胞分为对照组,模型组,TCPE低、高剂量(3、30μg/mL)组。在施加处理因素3 d后,用MTT比色分析测定细胞吸光度值,Annexin V/PI双染流式细胞术测定细胞凋亡率,Western blotting检测Caspase-3、BMPs信号通路的表达水平,并检测BMPs信号通路阻断后TCPE的抗凋亡作用。用Bio-Rad Quantity One凝胶分析系统对条带进行半定量分析。结果 MTT与流式细胞术结果显示,TCPE能提高PC12细胞活性,降低PC12细胞凋亡率,并呈剂量依赖性,TCPE组与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05、0.01)。Western blotting结果显示,TCPE能降低Caspase-3表达,增加BMP4、BMPR-IA、p-Smad1/5/8的表达,TCPE组与模型组相比,差异具有统计学意义(P<0.05、0.01)。TCPE对BMP2、BMP7、BMPR-II的表达没有影响,BMPR-IB没有被检测出。BMP4中和抗体减弱了TCPE的抗凋亡活性。结论 TCPE具有抑制血清饥饿诱导PC12细胞凋亡的作用,且这种作用呈剂量依赖性,其作用机制可能与激活BMP4信号通路表达有关。

龟板提取物调控骨髓间充质干细胞中Id1表达的研究

目的观察龟板提取物在不同的时间点对骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1的影响。方法将构建成功的PGL3-Id1启动子用磷酸钙共沉淀法转染大鼠骨髓间充质干细胞,龟板提取物分别作用于转染后的骨髓间充质干细胞36小时、3天、7天,每个时间点分别加入0,1,3,30,100μg/ml的龟板提取物,药物作用一定时间后收集细胞分别应用萤光素酶报告基因系统、RT-PCR检测Id1蛋白的表达。结果 36小时和3天时,小剂量的龟板提取物对分化抑制蛋白1的影响不大,随着时间和剂量的增加,龟板提取物量效依赖性地促进了Id1的表达;7天时,龟板提取物对Id1的促进作用逐渐减弱。结论龟板提取物促进了骨髓间充质干细胞中分化抑制蛋白1的表达,且其促进作用呈现增高-最强-减弱的特点。