龟甲提取物对骨髓间充质干细胞增殖过程中核受体的影响

【目的】观察龟甲(也称龟版或龟板)提取物对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖过程中核受体 (nuclear receptor,NR)表达的影响。【方法】采用密度梯度法分离大鼠MSC进行培养,经5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记和 CD44免疫组化染色鉴定后,分别以高、中、低剂量的龟甲提取物(3 333、333．3、33．33μg／mL)加入到体外培养的MSC中, 与龟甲提取物作用12、24、72、120 h后,采用免疫组化法和免疫荧光细胞化学法检测MSC的视黄酸受体(retinoic acid receptor-α,RARα)、维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)、雌激素受体(estrogen reeepror,ER)、糖皮质激素受体 (glucocorticoid receptor,GR)、甲状腺激素受体(thyroid hormone receptor-α,TRα)和过氧化物酶体增殖物活化受体(peroxisome proliferator activated receptor-δ,PPARδ)的表达。【结果】高、中、低剂量龟甲提取物组的MSC的RARα、VDR表达阳性细胞均高于对照组(P<0．05或P<0．01),且呈剂量依赖性;作用24 h后RARα表达达峰值,作用72 h后VDR表达达峰值。未检测到ER、GR、PPARδ、TRα阳性反应细胞。【结论】视黄酸受体α和维生素D受体可能为龟甲提取物促MSC增殖的药理靶点。

BMP4调控龟甲提取物促骨髓间充质干细胞的增殖作用

目地:观察骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic proteins-4,BMP4)对龟甲提取物(Extracts from Testudinis Carapacis et Plastri,PTE)促骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及作用机制。方法:PGL3-ID1分别和0、0.1、0.3、0.5、1μg/m L的p EGFP-BMP4用磷酸钙共沉淀法共转染大鼠MSCs,转染细胞每个剂量组均分为空白对照组和PTE组。空白对照组不加PTE,PTE组加入30μg/m L的PTE作用36 h,收集细胞萤光素酶报告基因检测ID1的表达。选取0.3μg/m L的p EGFP-BMP4与PGL3-ID1共转染。再将MSCs细胞分为对照组、PTE组、BMP4组和BMP4+PTE组。对照组和PTE组MSCs不做转染,PTE组MSCs加入30μg/m L的PTE作用36h;BMP4组MSCs共转染PGL3-ID1和p EGFP-BMP4;BMP4+PTE组MSCs共转染PGL3-ID1和p EGFP-BMP4,加入30μg/m L的PTE作用36 h。应用RT-PCR分别检测各组中ID1、BMP4、RARα的表达。结果:与空白对照组比较PTE组BMP4、ID1、RARα表达均显著增高;BMP4组BMP4、RARα表达显著增高,ID1表达显著降低;BMP4+PTE组BMP4、ID1、RARα表达与BMP4组相比均显著降低。结论:龟甲提取物可以促进MSCs增殖,其又可通过调节BMP4的表达防止MSCs的过度增殖。

视黄酸对龟甲提取物促骨髓间充质干细胞增殖的促进作用

目地:观察视黄酸(retinociacdi,RA)对龟甲提取物(Extracts from Testudinis Carapacis et Plastri,PTE)促骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)增殖的影响及其作用机制。方法:将PGL3-ID1用磷酸钙共沉淀法转染大鼠MSCs。PTE联合视黄酸(RA)、视黄酸受体阻断剂Ro41分别以10-6、10-7、10-8mol/L的浓度作用于转染后MSCs 36 h,萤光素酶报告基因检测ID1的表达。1、3、30、100μg/mL PTE分别作用于MSCs 36 h、3 d、7 d,RTPCR检测RAR的表达。PTE分别联合10-6mol/L RA、10-7mol/L Ro41作用于MSCs 36 h,RT-PCR检测RAR、ID1的表达。结果:PTE促进了MSCs中ID1的表达,联合应用RA,其促进作用增强,同时促进了RAR的表达;应用Ro41阻断RAR,PTE对ID1的促进作用减弱。结论:RA促进了MSCs中ID1的表达,PTE通过调控核受体RAR的表达水平来调控MSCs的增殖和分化。

一测多评法测定龟甲提取物中6种氨基酸的含量

目的建立一测多评法测定龟甲提取物中的6种氨基酸的含量。方法以甘氨酸为内标物质,计算L-羟脯氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸的相对校正因子,并进行含量测定,实现一测多评。同时用一测多评法和外标法测定18批龟甲提取物中6种氨基酸的含量,将其测定值进行对比,验证一测多评法的准确性和可行性。结果 L-羟脯氨酸、瓜氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸、亮氨酸对甘氨酸的相对校正因子分别为1.931、2.442、1.248、1.348、1.737,相对保留时间分别为0.745、1.164、1.363、1.434、2.384,外标法测定值和一测多评法计算值之间无显著性差异。结论一测多评法可以用于龟甲提取物中6中氨基酸的含量测定。

龟甲提取物作为保健食品原料的安全性研究

龟甲可作为保健食品原料使用,龟甲提取物也已成为天然保健品市场上的重要原料。本实验以龟甲提取物为研究对象,通过小鼠急性经口毒性试验、90天经口毒性试验探究龟甲提取物的安全性,为龟甲原料的开发和利用提供数据基础。

龟甲提取物作为保健食品原料增强小鼠免疫力研究

目的:研究龟甲提取物作为保健食品原料增强小鼠免疫力的作用。方法:设置龟甲提取物0.025 g/kg bw、0.050 g/kg bw、0.150 g/kg bw 3个剂量组,进行体液免疫检测、细胞免疫检测、单核-巨噬细胞功能检测、NK细胞活性测定。结果:龟甲提取物0.025 g/kg bw和0.050 g/kg bw剂量组小鼠溶血空斑数、OD差值、小鼠碳廓清吞噬指数a、NK细胞活性显著高于对照组(P<0.05);0.150 g/kg bw剂量组小鼠溶血空斑数、抗体积数、OD差值、小鼠碳廓清吞噬指数a、NK细胞活性显著高于对照组(P<0.05)。结论:龟甲提取物作为保健食品原料具有增强细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性作用。

龟甲提取物抗疲劳作用研究

目的:研究龟甲提取物抗疲劳的作用。方法:以小鼠为研究对象,通过小鼠负重游泳实验、小鼠肝糖原、血清尿素以及血乳酸测定,对龟甲提取物抗疲劳作用进行研究。结果:与对照组相比较,龟甲提取物高剂量组(180mg/kg bw)小鼠的负重游泳时间有明显延长,差异有显著性(P<0.05);中、高剂量组(60、180 mg/kg bw)小鼠血清尿素含量降低,小鼠肝糖原含量有明显升高,差异有显著性(P<0.05)。实验结果表明龟甲提取物能够缓解体力疲劳。结论:龟甲提取物具有抗疲劳作用。

龟甲提取物对增强免疫力和抗疲劳的作用研究

本研究旨在探讨龟甲提取物对小鼠免疫力功能和抗疲劳性的作用。方法 选择清洁级ICR健康小鼠,灌胃给予0.042g/kg.bw、0.083g/kg.bw、0.250g/kg.bw剂量的龟甲提取物及无菌水30d,进行增强免疫力和抗疲劳试验。结果 龟甲提取物对细胞免疫、体液免疫、NK细胞活性三个方面显示阳性;负重游泳试验、血乳酸、血清尿素指标均呈阳性。结论 龟甲提取物对小鼠具有增强免疫力和缓解体力疲劳作用。

龟甲提取物干扰NF-κB-NLRP3炎症体正反馈回路改善老年性骨质疏松的研究

目的:探讨龟甲提取物对NF-κB-NLRP3炎症体正反馈回路的调节作用及改善老年性骨质疏松的起效机制。方法:超高效液相联用质谱技术完成龟甲水提液中有效成分的鉴定。体外实验中,TRAP染色法检测龟甲提取物对骨髓源性巨噬细胞破骨分化的影响,使用NF-κB信号通路激动剂与抑制剂验证龟甲提取物对NF-κB信号通路的影响,使用NLRP3炎症体激动剂与抑制剂验证龟甲提取物对NLRP3炎症体活性的影响,RT-qPCR检测Nfatc1、Ctsk基因的表达量,Western Blot法检测p50、p-p50、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β的表达量。体内实验中,将6只3月龄C57BL/6小鼠作为对照组,12只22月龄自然衰老小鼠随机分为老年性骨质疏松模型组、龟甲提取物干预组,每组6只,连续干预8周。结果:筛选出龟甲水提液有效成分肉豆蔻酸。体外实验:与对照组比较,肉豆蔻酸显著抑制破骨分化(P<0.01),Nfatc1、Ctsk基因的表达量被显著抑制(P<0.05,P<0.01),p-p50、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β的表达量显著下调(P<0.01)。体内实验:与模型组比较,肉豆蔻酸有效提高骨体积分数(P<0.05),抑制骨髓腔中炎症体的表达量(P<0.01)。结论:龟甲提取物肉豆蔻酸改善老年性骨质疏松可能与干扰NF-κB-NLRP3炎症体正反馈回路,抑制破骨细胞形成相关。