Molecular evidence and phylogenetic delineation of spotted fever group Rickettsia species in Amblyomma ticks from cattle in Gauteng and Limpopo Provinces,South Africa

Objective:To determine the prevalence of tick-borne pathogens with a particular focus on Rickettsia spp.in ticks collected from cattle in Gauteng and Limpopo Provinces,South Africa.Methods:A total of 200 ticks were collected from cattle within the Madala livestock,Pretoria,Gauteng Province and in Mankweng Township,Polokwane,Limpopo Province in 2019.The ticks were morphologically identified and processed individually for a total genomic DNA extraction.Specific primers targetting ompA,ompB,and the 17KDa genes were used for a molecular screening and delineation of Rickettsia from the extracted genetic materials using polymerase chain reaction(PCR)technique.PCR amplicons of positive samples were sequenced bidirectionally using the Sanger sequencing method.Sequences generated were processed and analysed using appropriate bioinformatics software.Results:The ticks were morphologically identified as Amblyomma spp.PCR profiling of the genomic DNA samples revealed the presence of the Rickettsia pathogen in 42(21%)of the ticks collected from both Provinces.Out of the genes profiled,14(7%)were positive for 17KDa,42(21%)for ompA and 32(16%)were positive for ompB genes respectively.The nucleotide blast of the sequenced genomes showed high similarity,as high as 100% with other reference Rickettsia(R.)africae in the GenBank.The phylogenetic analysis of the sequences further validated them as R.africae with their characteristic clustering pattern with related reference sequences.Conclusions:There is an abundance of R.africae in Amblyomma ticks collected from cattle in the study areas.This has serious public health implications as individuals who accidentally get infested with the ticks could acquire R.africae.Hence,adequate precautions in terms of sensitization of farmers about the risk and mass mobilization drive to control the vectors in the areas are highly recommended to safeguard public health.

河南省首次实验室证实恙虫病暴发疫情

目的调查以发热、头痛、淋巴结肿大、皮疹为主要症状的不明原因疾病病因。方法对可疑病人进行流行病学调查,用血清学、巢式PCR方法检测病人血清抗体滴度、血清型及立克次体特异性基因片段。结果对发生在农村的32例病人中的20例病人进行血清外裴OXk凝集反应,阳性率达100%,其中11份的第2次病人血清OXk反应呈4倍升高;间接免疫荧光法检测IgM和IgG抗体,20份均为阳性,最高达到1∶2560;恙虫病血清学分型Gilliam 4例,Karp6例,Kato 8例。巢式PCR检测病人血凝块,结果3份扩增出Ot特异性DNA片段。结论首次证实河南省出现恙虫病暴发疫情。

栉孔扇贝急性病毒性坏死症病原人工感染研究

从发病疫区栉孔扇贝(Chlamysfarreri)组织中分离出病毒和立克次体(Rickettsiaorganism,RO),对健康栉孔扇贝进行人工感染。结果显示,病毒注射组死亡率为75%,病毒浸浴组死亡率为68.7%;RO注射组死亡率仅为18.7%;灭活RO注射组死亡率为31%;灭活病毒注射和空白对照组死亡率皆为12.5%;病毒注射、浸浴组与灭活病毒注射组、空白对照组死亡率有显著差异。而RO注射组与灭活RO注射组、空白对照组死亡率没有显著差异。电镜复检结果显示,发病扇贝的外套膜、鳃、消化腺组织中分布有大量病毒粒子,该病毒粒子的形态特征、病理学特征与自然海区发病扇贝中的病毒粒子特征完全一致。人工感染实验结果证明,栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒(A cuteVirusNecrobioticVirus,AVNV)是栉孔扇贝大规模死亡的直接病原。

聚合酶链反应用于恙虫病立克次体检测和分型的研究

本文报道聚合酶结反应用于恙虫病立克次体（Rt）检测和分型研究结果，以构建的Rt外膜主要蛋白56kDa型特异抗原（tsa56kDa）基因编码区的群、型特异引物，采用1步法PCR分别对Gilliam，Karp，Kato，Kawasaki和Kuroki5株标准株Rt，江苏地区5份Rt阳性标本，斑点热和莫氏立次体以及5份正常输血员全血标本进行检测和分型。研究结果证明所构建的Rt群、型引物具有Rt的特异性，型特异引物在Rt的型与型之间无交叉扩增。因此，该研究对恙虫病的诊断、流行病学调查以及Rt的型别鉴定具有实用价值。通过对江苏省东台、海安、南京地区5株Rt的型别鉴定，再次证明江苏地区Rt流行株为我国首次从分子水平发现的一个新型Rt．而且是江苏地区流行的主要优势株，与日本Kawasaki型相似。在调查中未发现其它株型。

恙虫病立克次体弱毒株分离方法的研究

江苏省于1986年发现秋冬型恙虫病的流行,并从病原学和血清学得到证实。但用病人、鼠、螨标本接种小白鼠,鼠的症状和病变不明显,且难以检出恙虫病立克次体。1990年以来,我们在分离恙虫病立克次体方法上作了以下改进:多次用环磷酰胺和稀释液处理接种标本的小白鼠;增加稀释液的成分;把握好小白鼠的传代时机等。结果从病人外周血、鼠和小盾纤恙螨中均分离到恙虫病立克次体,说明该方法对分离恙虫病立克次体弱毒株是有效的。

应用NPCR发现我国Kawasaki型恙虫病立克次体

本文报告用恙虫病立克次体表面蛋白５６ＫＤａ型特异抗原（ｔｓａ５６ＫＤａ）基因编码区的引物，采用嵌合式聚合酶链反应（ＮＰＣＲ）鉴定江苏地区的２株恙虫病立克次体。结果该２株恙虫病立克次体与Ｇｉｌｌｉａｍ，Ｋａｒｐ，Ｋａｔｏ和Ｋｕｒｏｋｉ型特异引物无任何ＤＮＡ扩增带，而与日本ｋａｗａｓａｋｉ株型特异引物扩增后有５２３ｂｐ的ＤＮＡ扩增带，表明我国存在Ｋａｗａｓａｋｉ型恙虫病立克次体。

用PCR检测现场单个小盾纤恙螨体内恙虫病立克次体的研究

恙虫病立克次体（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ，Ｒ．ｔ）表面蛋白５６ＫＤａ（ｔｓａ５６ＫＤａ）基因编码区构建的群特异引物，采用嵌合式聚合酶链反应（ＮｅｓｔｅｄＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ，ＮＰＣＲ）检测现场捕获的单个小盾纤恙螨幼虫体内Ｒ．ｔ的ＤＮＡ。共检测江苏省恙虫病疫区小盾纤恙螨幼虫６１只，结果２只幼虫提取的ＤＮＡ经扩增后见４８１～５０７ｂｐ的ＤＮＡ扩增带，表明这２只幼虫携带有Ｒ．ｔ，其该种螨Ｒ．ｔ携带率为３．２７％。证明该法可用于单个恙螨幼虫体内Ｒ．ｔ的检测，对恙虫病疫区媒介恙螨的流行病学调查具有实用价值。

我国西沙群岛吸血昆虫的种群动态和鼠形动物病原感染检测

目的研究我国西沙群岛吸血昆虫的种群动态以及鼠形动物病原感染情况,为当地传染病防控提供资料。方法2014年1月至7月在西沙群岛的永兴岛和石岛以灯诱法诱捕昆虫,每个月2次。结合形态和分子特征对昆虫进行种类鉴定并统计种群数量。用胶体金试剂条和PCR检测鼠形动物的常见病原感染情况,依据形态学初步鉴定鼠形动物体外寄生虫。结果西沙群岛的吸血昆虫中,库蚊、阿蚊和库蠓为优势种群,蠓在4月密度最高(55.55%,6 984/12 573),并在西沙群岛采集到贝氏司蛉(n=11)。鼠形动物血清中A型金黄色葡萄球菌肠毒素和A型肉毒毒素的阳性检出率分别为3.45%(1/29)和14.00%(7/50),鼠疫和立克次体病抗体均为阴性。巢氏PCR扩增70只鼠形动物的立克次体Sta58基因片段,阳性率为11.43%(8/70)。获得鼠形动物体外寄生虫共248个个体,其中革螨占93.55%(232/248)。结论吸血昆虫在西沙群岛未见明显的种群动态变化,本研究首次记述了西沙群岛的白蛉;鼠形动物中恙虫病立克次体和2种细菌的毒素携带率较高。

海南岛恙虫病立克次体研究

目的:阐明海南岛恙虫病立克次体的存在及其分布。方法:①恙虫病立克次体血清学调查用微量免疫荧光检测法(mIFA)。②恙虫病立克次体分离用小鼠接种法和L929细胞培养法,恙虫病立克次体鉴定用特异性抗体mIFA。③应用聚合酶链反应(PCR、NPCR)技术检测恙虫病立克次体特异性DNA。④DNA序列。结果:①35份不明原因发热患者血清中,10/35(28.57％)份血清呈IgG抗体阳性反应(滴度≥1:80)。收集自海南岛的东、西、南、北、中部地区的561份人群血清恙虫病立克次体IgG抗体阳性率为13.55％(76/561)。其中东部地区阳性率为8.69％(10/115),南部为7.22％(7/97),西部为28.83％(32/111),北部为11.76％(12/102),中部为11.03％(15/136)。②小白鼠接种分离法从疑似立克次体病患者血液中分离出3株恙虫病立克次体,L929细胞培养法从20份不明原因发热患者血液中分离出3株恙虫病立克次体。③应用PCR技术从9例疑似立克次体感染患者血液中检出4例恙虫病立克次体特异性DNA。用NPCR法从17组野鼠脾脏标本中检出3组恙虫病立克次体特异性DNA。④DNA序列已经分析清楚。结论:海南岛确有恙虫病存在,该岛的中、西部感染率较高,南、北部较低。海南岛恙虫病立克次体DNA序列已分析清楚。

安徽三界地区啮齿动物感染恙虫病东方体调查

目的调查安徽三界地区啮齿动物自然感染恙虫病东方体分离株,并确定其基因型别。方法流行季节在野外用鼠笼捕鼠并鉴定鼠种、携螨率;巢式PCR对鼠脏器进行恙虫病东方体56 kD基因片段检测;将鼠脏器接种小白鼠进行病原体分离,PCR扩增分离株Ot 56 kD基因片段,并将目的片段进行测序,基因序列同源性及进化分析。结果捕获啮齿动物数及其携螨率,黑线姬鼠60%(15/25);褐家鼠45.5%(5/11);东方田鼠和鼩鼱各2只,均阴性。40只野鼠脏器有3只恙虫病东方体PCR扩增阳性,阳性率为7.5%;从黑线姬鼠标本中分离到1株恙虫病东方体Sanjie,56 kD基因片段测定该株与台湾TT0711a和NT0511b分离株同源性最高(98%),系统发生树分析也显示与Kawasaki型共处于同一分支。结论安徽三界地区存在鼠类恙虫病东方体自然感染,黑线姬鼠为其主要宿主,当地恙虫病东方体属Kawasaki基因型。

恙螨体内恙虫病立克次体动态变化的实验研究

应用ＰＣＲ技术研究地里纤恙螨（Ｌｅｐｔｏｔｒｏｍｂｉｄｉｕｍｄｅｌｉｅｎｓｅ）实验感染恙虫病立克次体（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）后恙螨体内立克次体ＤＮＡ的动态变化。结果如下：立克次体在接种组成虫体内持续３６０天和经卵传递达４代；叮咬组饱食蚴体内立克次体经若蛹、若虫、成蛹达成虫期，成虫体内立克次体持续２７０天和经卵传递达２代，表明叮咬带立克次体鼠和经卵传递是保持恙螨亲代和子代体内立克次体动态循环的基础。

套式PCR用于恙虫病的早期诊断及恙螨幼虫体内立克次体的检测

从恙虫病立克次体（Ｒｔ）Ｋａｒｐ株的群特异性抗原基因序列设计两对引物建立套式ＰＣＲ检测现场鼠体采集的恙螨幼虫体内及恙虫病现症病人外周血单核细胞内的ＲｔＤＮＡ。除一份已用过药病人标本外，其余９份均可检见８８ｂｐＤＮＡ扩增产物；检测结果表明：现场鼠体采集的地里纤恙螨（Ｌｅｐｔｏｔｒｏｍｂｉｄｉｕｍｄｅｌｉｅｎｓｅ）幼虫的Ｒｔ携带率是１３．３％，证实套式ＰＣＲ可用于急性期恙虫病的诊断和媒介恙螨流行病学的调查。

海南岛立克次体血清学和病原学调查报告

目的:调查海南岛立克次体的群别及其分布。方法:应用微量免疫荧光检测法(mIFA)对人群血清进行恙虫病、斑疹伤寒和斑点热3种立克次体IgM、IgC抗体检测。应用L929单层细胞进行立克次体分离培养。立克次体用特异性抗体进行mIFA鉴定。结果:恙虫病、斑疹伤寒和斑点热3种立克次体ISC抗体阳性率分别是13.55％(76/561),18.77％(101/538),30.83％(164/532)。其中IgM和IgC抗体均≥1:80者,斑疹伤寒为32.08％,斑点热为46.30％。立克次体分离培养结果,20份不明原因发热或疑似立克次体病患者血液标本分离出12株立克次体,免疫血清mIFA鉴定及聚合酶链反应(PCR)技术检测立克次体特异性DNA等方法鉴定出3株恙虫病立克次体、2株斑疹伤寒立克次体和7株斑点热群立克次体。结论:海南岛确有恙虫病、斑疹伤寒、斑点热病存在,该岛的中、西部感染率较高,南、北部较低。

地里纤恙螨红、白体色体内恙虫病立克次体的聚合酶链反应技术检测及其传病作用

本文应用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）检测了红、白体色地里纤恙螨亲代成虫及子代幼虫体内恙虫病立克次体ＤＮＡ的动态变化，结果表明：恙虫病立克次体能在红、白体色恙螨体内生长繁殖，且至少持续２７０天，并可以经卵传递给子代。叮咬试验证明两体色恙螨幼虫均具有叮咬和传病能力。

南澳、南澎列岛恙虫病立克次体的分离鉴定

目的 对广东省南澳及南澎列岛的鼠类和地里纤恙螨进行立克次体现场和实验室分离鉴定。方法 动物分离 ,血清分型 ,毒力测定及免疫力试验。结果 鼠类和地里纤恙螨分离阳性率 ,南澳岛分别达 2 6 0 9%和 40 % ,南澎列岛平均为33 75 %和 75 % ;获得明确分型的Karp抗原型分离株 ,其LD50和ID50 分别为 10 -5～ 10 -5 2 5和 10 -5～ 10 -5 75,免疫保护指数≥ 4。结论 南澳和南澎列岛鼠类及地里纤恙螨的恙虫病立克次体病原分离阳性率高 ,Karp型流行株毒力大、免疫性强。

PCR/RFLP用于恙虫病立克次体基因分析的研究

为查明江苏地区恙虫病立克次体（Ｒｔ）型别及目的基因序列差异性。本室构建Ｒｔ外膜主要蛋白型特异抗原５６ｋＤ的群、型引物进行ＰＣＲ分型。选用ＳｎａＢＩ，ＨｈａＩ和ＢｇｌⅡ限制性核苷酸内切酶切割ＰＣＲ产物（ＰＣＲ／ＲＦＬＰ）方法，对江苏地区的５份Ｒｔ目的基因分析研究与Ｇｉｌｉａｍ，Ｋａｒｐ，Ｋａｔｏ，Ｋａｗａｓａｋｉ和Ｋｕｒｏｋｉ标准参照株Ｒｔ比较，结果证明江苏地区Ｒｔ型别与日本Ｋａｗａｓａｋｉ型相似，但缺乏ＨｈａＩ的酶切位点。

以肺炎为主要表现的恙虫病10例临床分析

目的探讨恙虫病立克次体肺炎的临床特征，诊断及治疗。方法对10例以肺炎为主要表现的恙虫病患者临床资料进行回顾性分析。结果10例恙虫病患者发病时间为：7月份2例，8月份6例，9月份2例；均有恙螨叮咬史；均有发热、胸闷、呼吸困难、咳嗽症状；分别于小腿、阴囊、肛门、腋窝、上臂、颈部发现焦痂或溃疡；行血液及部分骨髓培养均未检出细菌，使用多种抗菌药物治疗无效。均给予四环素及对症、支持治疗，其中2例因急性呼吸衰竭死亡，其他患者痊愈出院。结论恙虫病东方体作为立克次体肺炎的病因之一应得到重视，不明原因肺炎要考虑除外恙虫病。早期诊断和治疗是抢救成功的关键。

应用PCR技术检测恙螨体内恙虫病立克次体动态和经卵传递的研究

本文应用聚合酶链反应技术检测恙虫病立克次体实验感染的恙螨体内立克次体的动态变化，通过人工腹腔接种而感染的恙螨成虫，恙虫病立克次体至少能在其体内生存３６０天和经卵传递４代；通过未食幼虫叮咬病小鼠而感染的恙螨，经饱蚴、若蛹、若虫、成蛹和成虫阶段，恙虫病立克次体检测均呈阳性，至少能在成虫期体内生存２７０天和经卵传递１代。

恙虫病并发急性呼吸衰竭临床分析

目的探讨恙虫病并发急性呼吸衰竭的发病情况。方法我院收治恙虫病并发呼吸衰竭13例进行回顾分析。结果恙虫病并发呼吸衰竭患者常并发多脏器功能受损,死亡率高,该病危重程度与误诊时间长短成正相关,及时诊治,预后好。结论恙虫病并发呼吸衰竭较少见,误诊率高,应仔细收集病史,认真体检,及时诊治,防止恙虫病并发呼吸衰竭。