中国林蛙和中华蟾蜍皮肤抗菌肽的分离纯化及其抗菌活性

分别以中国林蛙长白山亚种Rana chensinensis changbaishansis和中华蟾蜍Bufo gargarizans的鲜皮为原料,通过酸化乙醇法提取抗菌肽粗提液,再经葡聚糖凝胶层析进一步分离纯化获得抗菌肽纯品,采用滤纸片法进行抑菌活性研究。结果表明,经Sephadex G-50和Sephadex G-100分离纯化后获得3种多肽,中国林蛙与中华蟾蜍皮肤中的活性多肽对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都具有一定的抗菌作用,其中多肽Ⅲ具有最佳的抑菌效果。抗菌肽相对含量比较的结果表明,蟾蜍皮肤中抗菌活性肽的含量较高,是理想的抗菌肽提出和纯化的源材料。

中国林蛙皮抗菌肽的提取纯化及抑菌活性检测

采用酸化甲醇法提取中国林蛙皮肤中的抗菌肽,并采用凝胶色谱的方法对提取物进行纯化。结果表明:采用Sephadex G-50和Sephadex G-25串联凝胶层析法获取的F2组分,即纯化后的抗菌肽的抑菌率可达90%以上。抗菌肽对革兰氏阴性菌和阳性菌以及真菌均有一定抑制效果。对各受试菌株的最小抑菌浓度(MIC)分别为:金黄色葡萄球菌和链球菌为0.2mg/mL;枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为0.4mg/mL;蜡样芽孢杆菌为0.8mg/mL;白色念珠菌为1.2mg/mL;酿酒酵母和毛霉为1.5mg/mL;根霉为2.0mg/mL。

中国林蛙皮抗菌肽提取条件的优化研究

本研究以林蛙干皮为原料,采用甲醇、乙酸和磷酸盐三种浸提液提取有抑菌活性的多肽,并分别以提取温度、时间、液料比、pH值四因素对每种浸提液的提取方法进行三水平正交试验,以进一步精纯后产物的抑菌活力为指标,探索林蛙抗菌肽的最优分离纯化工艺。结果表明,三种浸提液的最优条件分别是:甲醇法为浸提时间24h、温度0℃、液料比为22.5(W/V)、pH5.4;乙酸法为24h、0℃、液料比22.5、pH3.0;磷酸盐法为24h、20℃、液料比22.5、pH6.4。其中甲醇法浸提产物的抑菌活性最佳,粗提品经G-25层析后,力活提高了5倍,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用。

榆黄蘑干品和鲜品的抗氧化性

以DPPH.清除能力作为考察指标,通过正交试验确定榆黄蘑干品和鲜品抗氧化物的最佳提取方案,同时测定不同浓度榆黄蘑提取液清除DPPH.、羟自由基、过氧化氢的能力。通过正交试验确定,榆黄蘑干品用甲醇在20℃提取30min为佳,而鲜品则用蒸馏水在50℃提取60min为佳。榆黄蘑鲜品和干品对DPPH.、.OH和H2O2均具有清除作用,尤其对H2O2有较强的清除作用,且均随浓度增加而增强。榆黄蘑鲜品的提取物对于DPPH.、.OH和H2O2清除率比干品的更高。结论为榆黄蘑的干品和鲜品均具抗氧化性,鲜品的抗氧化性更强。

中国林蛙抗菌肽基因在毕赤酵母中的表达及其活性检测

将中国林蛙皮肤抗菌肽基因(RC)克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,使之准确融合于а交配因子分泌信号,然后通过电击转化毕赤酵母宿主菌GS115/His-,构建pPIC9K/RC。将筛选出的高效表达的重组转化子用甲醇作诱导剂进行小瓶发酵,28～30℃诱导后,经Tricine SDS-PAGE检测,表达产物在а信号因子引导下分泌到培养基中。分泌到培养基中的表达产物能够抑杀细菌和抑制肿瘤细胞生长。对酵母重组子用酵母染色体DNA的通用引物和目的片段的引物进行PCR扩增。结果表明,中国林蛙皮肤抗菌肽基因能以单拷贝整合到毕赤酵母染色体基因组中并形成转录产物。

林蛙皮胶原蛋白的提取及抗氧化性

用木瓜蛋白酶提取林蛙皮胶原蛋白,采用单因素试验和正交试验设计优选最佳提取工艺,并对林蛙皮胶原蛋白的抗氧化性进行研究。结果表明:林蛙皮胶原蛋白的最佳提取工艺是加酶量为1%,料液比为1∶20(g/mL),pH为5.5于室温反应36 h,此条件下胶原蛋白提取率为24.71%,纯度为72.03%。林蛙皮胶原蛋白具有一定的还原能力,对羟自由基具有一定的清除能力,并且随着浓度的增加抗氧化活性逐渐增强。

木瓜蛋白酶水解林蛙皮制备活性肽的工艺研究

[目的]以林蛙皮为原料,利用木瓜蛋白酶水解法制备活性肽。[方法]选取固液比、酶用量、pH、水解时间和水解温度为影响因素,以活性肽的水解度为考察指标,通过单因素试验和正交试验优选木瓜蛋白酶酶解林蛙皮制备活性肽的最佳工艺条件。[结果]最优工艺条件为固液比1∶4,酶用量14 000 U/g,pH 7.0,水解温度55℃,水解时间4 h。[结论]该研究为林蛙资源的综合利用提供了新的途径。

中国林蛙卵油抗士的宁惊厥的机制

目的揭示CO2超临界萃取的中国林蛙卵油(Rana temporaria chensinensis Davidegg oil,EORTCD)抗士的宁惊厥作用的机制。方法以士的宁为致惊剂,评价中国林蛙卵油抗惊厥活性的时效和量效关系。通过利血平耗竭单胺神经递质和奥单西隆阻断5-HT3受体,在士的宁致惊厥的小鼠模型中探讨中国林蛙卵油抗惊厥作用机制。结果中国林蛙卵油给予动物30 min,其抗惊厥作用效果最好。中国林蛙卵油抗惊厥作用呈现良好的剂量-效应关系;利血平耗竭单胺递质后,EORTCD对抗士的宁惊厥的效应消失;奥丹西隆阻断5-HT3受体后,再给EORTCD 1.4 g.kg-1,EOTCD的抗士的宁惊厥作用也被阻断。而高剂量组EORTCD未受奥丹西隆阻断。结论高、低剂量EORTCD抗惊厥作用可能启动不同的通路。低剂量EORTCD抗士的宁惊厥可能与5-HT3受体有关。

中国林蛙蛙皮肽抗菌性质及其机理的研究

本实验对从中国林蛙的皮肤中提取的蛙皮肽的抗菌性质及其机理进行了研究。结果表明,该蛙皮肽抗菌谱较广,对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌都有较好的抗菌效果,其抗菌活性具有很强的热稳定性,且在酸性条件下抗菌活性强,当pH值大于8时丧失抗菌活性。对经蛙皮肽处理的枯草杆菌作电镜扫描检查,发现细菌细胞壁出现破损或穿孔,而对照组细菌壁结构完整,表明该蛙皮肽的抗菌机制是通过破坏细菌细胞壁,使细胞质外流而致菌体死亡。

林蛙皮、卵活性成分提取方法及药理作用的研究进展

林蛙皮、卵中含有多种对人体有益的活性成分,对其深入研究有利于林蛙资源的综合利用.本文对林蛙皮、卵的主要活性成分提取方法及药理作用进行综述,为其在药品、保健品、化妆品等大健康领域的开发利用提供参考.

林蛙脑蛋白酶解物抗氧化性研究

用木瓜蛋白酶对林蛙脑进行酶解,并以抗坏血酸为对照,测定林蛙脑蛋白酶解液清除DPPH.、羟自由基和过氧化氢的能力.结果表明:林蛙脑蛋白酶水解液对DPPH.、.OH和H2O2均具有清除作用,尤其对H2O2有较强的清除作用,且均随浓度增加而增强.林蛙脑蛋白酶解液在浓度达到25 mg/mL时,对DPPH.的清除率达67.8%;在浓度达到4 mg/mL时,对H2O2的清除率达91.62%;浓度在4 mg/mL时,对.OH的清除率为66.89%.这说明林蛙脑蛋白酶解液具有很好的抗氧化性.

MTT法检测蛙皮活性多肽促进小鼠淋巴细胞增殖作用

目的研究林蛙皮活性多肽对小鼠淋巴细胞增殖作用。方法利用溴化四唑蓝法测定TF等促进小鼠脾淋巴细胞的增殖活性。结果实验组细胞免疫活性明显高于对照组(P<0.05)。结论林蛙皮活性多肽对培养的小鼠淋巴细胞具有明显的增殖作用,为今后林蛙皮的开发和利用提供了广阔的前景。

中国林蛙精子活动力研究初报

以不同质量分数的ＮａＣｌ溶液、无氯水及蒸馏水稀释林蛙的精液，研究精子在不同水域的活动力．实验证明，中国林蛙精子在蒸馏水、无氯水及低质量分数的ＮａＣｌ液中均有较好的生命力及活动能力．其中最少持续时间是在无氯水中，约０．５ｈ，最多持续时间是在０．１％ＮａＣｌ溶液中，约２ｈ．故中国林蛙的人工受精宜在０．１％ＮａＣｌ溶液中进行．

林蛙卵黑色素的理化性质及其抗氧化活性研究

以林蛙卵为原料,采用木瓜蛋白酶酶解和碱液除蛋白的方法制备林蛙卵黑色素,研究其理化性质和抗氧化活性。采用紫外分光光度计、傅里叶红外光谱仪和元素分析仪对林蛙卵黑色素进行检测,并进行了溶解性试验、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力试验、超氧阴离子清除试验和羟自由基清除试验。林蛙卵黑色素在紫外区域都有强烈的吸收,并且伴随波长的逐渐增加,吸光度呈现下降的趋势;元素分析表明林蛙卵黑色素的S∶N为0.05;红外光谱表明林蛙卵黑色素含有OH、NH2、C=C、C=N、C=O、C-N和苯环。体外抗氧化试验表明林蛙卵黑色素对DPPH自由基的IC50为0.404 mg/m L,对超氧阴离子的IC50为1.250 mg/m L,对羟自由基的IC50为0.662 mg/m L。结果表明:林蛙卵黑色素是真黑色素,并且具有较强的抗氧化活性。

林蛙卵油的提取、成分分析及抗氧化活性研究

以林蛙卵为原料,采用超临界CO2提取法提取林蛙卵中的林蛙卵油,研究其成分含量和抗氧化活性。采用气相色谱-质谱法(GC-MS)联用对林蛙卵油的成分进行检测分析,确定成分及含量,并进行DPPH自由基清除能力试验、羟基自由基清除试验和超氧阴离子自由基清除试验确定林蛙卵油的抗氧化能力。通过单因素实验和正交试验确定最佳提取工艺为提取压力35 MPa,提取温度60℃,CO2流量10 L/h,提取时间150 min,此时林蛙卵油的提取率为34.26%。GC-MS结果显示林蛙卵油中含有34种脂肪酸,其中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸相对含量分别为31.95%和68.05%。体外抗氧化试验结果表明林蛙卵油对DPPH自由基的IC50值为0.897 mg/mL,对羟基自由基的IC50值为1.392 mg/mL,对超氧阴离子的IC50值为1.687 mg/mL。林蛙卵油具有较强的体外抗氧化活性,在天然抗氧化剂和保健食品中有一定的开发利用价值。

温度及pH对中国林蛙精子活力的影响

在实验室条件下，采用单因子试验方法研究了水环境中不同温度、pH对中国林蛙精子活力的影响．结果表明：精子对温度的适应范围为10～20℃，对pH的适应范围为6．56～9．20，具有良好的耐碱性．不同温度F4，5，6组精子平均寿命分别为75，71，58min，运动状态均呈现为强；不同pH下e，f，g，h组精予平均寿命分圳为95，97，88，123min，其中h组运动状态呈现为极强．

林蛙皮的抗氧化性研究

目的研究林蛙皮的抗氧化性。方法以1,1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)清除能力作为考察指标,通过正交实验确定林蛙皮抗氧化物质的最佳提取方案,并进一步测定林蛙皮提取液的清除羟自由基、超氧阴离子的能力,综合分析林蛙皮的抗氧化能力。结果林蛙皮抗氧化物质提取的最优方案为:采用冷冻干燥的方式,用蒸馏水在50℃下提取30min,其DPPH·清除率达79.12%,且DPPH·的清除能力随浓度增加而增强;林蛙皮水提物也表现出较强的·OH清除能力,但对O2-·的清除能力较弱。结论林蛙皮水提液对DPPH·和·OH具有很好的抗氧化性,但对O2-·作用不明显。

中国林蛙皮抗菌肽的提取及其抗菌活性的研究

采用甲醇提取中国林蛙皮肤中的抗菌肽。并考察了影响抗菌肽粗提物抑菌率的各个因素:如提取时间、提取温度、料液比和pH值等,通过正交试验确定了获取抗菌肽粗提物的最佳条件。即:提取时间为24 h,提取温度为-20℃,提取料液比为1∶25,提取液pH值5.0。此条件下抗菌肽粗提物抑菌率可达75.22%。抗菌肽粗提物对常见的革兰阴性菌和阳性菌以及真菌均有一定抑制效果。对各测试菌株的最低抑制浓度分别为:金黄色葡萄球菌和链球菌为0.25 mg/mL;枯草芽孢杆菌和大肠杆菌为0.5 mg/mL;蜡样芽孢杆菌为1.0 mg/mL;白色念珠菌、酿酒酵母和毛霉为2.0 mg/mL;根霉为4.0 mg/mL。

哈蟆油中免疫活性部位的提取工艺与药效学研究

目的:研究哈蟆油中免疫活性部位的最佳提取工艺,并通过药效学实验验证其免疫调节作用。方法:采用正交试验,以酶解液的水解度、收率为指标,利用酶法对哈蟆油中蛋白质进行提取;并通过腹腔注射不同剂量的环磷酰胺复制免疫低下和免疫增强模型小鼠,以脏器指数、吞噬指数为指标,验证哈蟆油中免疫活性部位的免疫调节作用。结果:哈蟆油中蛋白质分2次水解出,第1次水解的最佳工艺为加木瓜蛋白酶2000u·g-1,调pH值至6.0,在45℃下提取4.5h;第2次水解的最佳工艺为固液比为1∶20(V/V),调pH值至6.0,在40℃下提取4.5h;药效学实验证明0.1g·kg-1哈蟆油提取物对免疫低下模型小鼠免疫功能有显著增强作用(P<0.01);0.2g·kg-1哈蟆油提取物对免疫增强模型小鼠免疫功能有显著抑制作用(P<0.01),并对免疫器官有一定的保护作用。结论:所选工艺合理、可行,提取的蛋白质有一定的免疫调节作用。

中国林蛙皮肤抗菌肽基因的cDNA克隆及抗菌、抗癌和溶血活性的测定

采用RT-PCR和3′RACE方法,从中国林蛙皮肤总RNA中克隆出了6条编码不同抗菌肽前体的cDNA序列,分别命名为:preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb、preprotemporin-1CEc、preprobrevinin-1CEa、preprobrevinin-1CEb和preprochensinin-1。cDNA碱基序列全长为289～315bp,编码59～65个氨基酸。6个抗菌肽前体由3部分结构域组成:22个氨基酸残基组成的信号肽、多个酸性氨基酸残基组成的中间序列、高度变异的成熟肽。preprotemporin-1CEa、preprotemporin-1CEb和preprotemporin-1CEc属于temporin-1家族抗菌肽前体,具有肽链短,C-端酰胺化的特点;preprobrevinin-1CEb和preprobrevinin-1CEa属于brevinin-1家族抗菌肽前体,在肽链的C-端含有RANA盒结构,可在2个半胱氨酸残基间形成二硫键,组成7肽环;preprochensinin-1在已知多种数据库中没有发现序列同源的多肽,被鉴定为新抗菌肽。人工合成temporin-1CEa、temporin-1CEb、brevinin-1CEa和chensinin-1四种中国林蛙皮肤抗菌肽,活性检测结果表明:它们对金黄葡萄球菌等3种革兰氏阳性细菌的生长具有明显抑制作用,同时抑制乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌HeLa细胞生长。