紫草素调节Nrf2/HO-1信号通路对实验性大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎的治疗作用研究

目的探究紫草素(Shikonin,SHI)通过调节核因子-红细胞2型相关因子2/血红素加氧酶(Nrf2/HO-1)信号通路对肉芽肿性小叶性乳腺炎模型大鼠的影响及作用机制。方法建立肉芽肿性小叶性乳腺炎(GLM)大鼠模型,将大鼠分为对照组(Control组)、模型组(GLM组)、紫草素低剂量组(SHI-L组,17.5 mg·kg^(-1)·d^(-1)SHI)、紫草素中剂量组(SHI-M组,35 mg·kg^(-1)·d^(-1)SHI)、紫草素高剂量组(SHI-H组,70mg·kg^(-1)·d^(-1)SHI)和紫草素高剂量+Nrf2抑制剂ML385组(SHI-H+ML385组,70 mg·kg^(-1)·d^(-1)SHI+14 mg·kg^(-1)·d^(-1)ML385)。HE染色观察乳腺组织病理变化情况;ELISA检测乳腺组织中IL-1β、TNF-α、IL-8、T-AOC、SOD、GSH、MPO、NAGase和ROS水平;免疫荧光检测NLRP3表达;Western blotting检测Nrf2和HO-1蛋白表达。结果与Control组相比,GLM组大鼠乳腺小叶完全被破坏、大片结节样慢性肉芽肿炎性病灶生成,乳腺小叶组织边界不清,腺叶内出现空泡,伴有大量淋巴细胞及中性粒细胞浸润;IL-8、IL-1β、TNF-α、ROS、MPO和NAGase水平、NLRP3阳性表达率显著增加(P<0.05),T-AOC、SOD和GSH水平、Nrf2和HO-1蛋白表达显著降低(P<0.05)。与GLM组相比,SHI-L组、SHI-M组和SHI-H组乳腺组织病变逐渐减轻;IL-8、IL-1β、TNF-α、ROS、MPO和NAGase水平、NLRP3阳性表达率依次降低(P<0.05),T-AOC、SOD和GSH水平、Nrf2和HO-1蛋白表达依次升高(P<0.05)。与SHI-H组相比,SHI-H+ML385组乳腺组织病变加重;IL-8、IL-1β、TNF-α、ROS、MPO和NAGase水平、NLRP3阳性表达率显著增加(P<0.05),T-AOC、SOD和GSH水平、Nrf2和HO-1蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论紫草素发挥抗炎抗氧化作用改善大鼠肉芽肿性小叶性乳腺炎,其机制可能与激活Nrf2信号通路,上调HO-1表达有关。

紫草素通过调控ERK1/2-NF-κB通路改善2型糖尿病小鼠肝损伤

目的本研究利用网络药理学及分子对接技术,探究紫草素改善2型糖尿病(T2DM)小鼠肝损伤靶点及机制。方法利用靶点数据库及疾病数据库挖掘紫草素药物靶点及T2DM肝损伤疾病靶点,韦恩交集法收集紫草素-T2DM肝损伤的共有靶点,String数据库构建蛋白互作(PPI)网络,Glue-GO及Metascape数据库分析Biological Process及KEGG。AutoDock进行分子对接。ELISA检测血清丙二醛(MDA)、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)含量,HE染色观察肝脏形态,Q-PCR检测炎症因子及抗氧化酶基因表达,Western blot检测细胞外调节激酶1/2(ERK1/2)、p-ERK1/2、磷酸化核转录因子-κB(p-NF-κB)、NF-κB等蛋白表达。结果紫草素与T2DM肝损伤的共有靶点105个,36%共有靶点富集在“regulation of inflammatory response”生物学过程,KEGG信号通路主要涉及“AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications”等炎症通路。紫草素与ERK1/2、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、蛋白激酶B(AKT)有较好的对接活性。体内动物实验结果显示,与模型组相比,紫草素显著减少肝脏组织炎性颗粒细胞浸润,抑制脂质空泡形成,减少血清MDA、AST、ALT含量(P<0.05),上调SOD1、SOD2、CAT抗氧化酶基因表达(P<0.05),下调p-ERK1/2/ERK1/2、p-NF-κB/NF-κB及IL-1β等炎症因子表达(P<0.01)。结论紫草素能通过增加抗氧化酶基因表达及抑制ERK1/2-NF-κB信号通路改善T2DM肝损伤。

紫草素对糖尿病周围神经病变大鼠的治疗作用及对腺苷酸活化蛋白激酶/核因子E2相关因子2信号通路的影响

目的:探究紫草素对糖尿病周围神经病变(DPN)大鼠的治疗作用及对腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路的影响。方法:构建DPN模型,将建模成功的48只大鼠随机分为模型组、紫草素低剂量组、紫草素高剂量组和甲钴胺片组,每组12只。另取12只大鼠作为对照组。紫草素低、高剂量组大鼠分别给予12.5、25 mg/kg紫草素灌胃,甲钴胺片组大鼠给予0.14 mg/kg甲钴胺片灌胃,对照组和模型组大鼠给予等体积0.9%氯化钠溶液灌胃,每日给药1次,连续8周。观察各组大鼠坐骨神经病理学变化。检测大鼠坐骨神经感觉神经传导速度(SNCV)和运动神经传导速度(MNCV),血清肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β,坐骨神经超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平。结果:对照组大鼠坐骨神经结构正常;模型组大鼠坐骨神经髓鞘变薄,出现白色结缔物质,间隙加宽,可见明显炎症细胞浸润;紫草素低、高剂量组大鼠坐骨神经病变程度依次减轻;甲钴胺片组和紫草素高剂量组大鼠坐骨神经病理学变化无明显差异。与对照组比较,坐骨神经SNCV和MNCV、血清SOD水平以及坐骨神经AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平显著降低,血清TNF-α、IL-6及坐骨神经MDA水平显著升高(均P<0.05)。与模型组比较,坐骨神经SNCV和MNCV、血清SOD水平以及坐骨神经AMPK、Nrf2 mRNA和蛋白水平依次升高,血清TNF-α、IL-6及坐骨神经MDA水平依次降低(均P<0.05)。甲钴胺片组和紫草素高剂量组上述各项指标比较差异无统计学意义(均P>0.05)。结论:紫草素能抑制DPN大鼠炎症反应和氧化应激,保护大鼠坐骨神经,其机制可能与激活AMPK/Nrf2信号通路有关。

紫草素通过Keap1/Nrf2通路对膀胱癌细胞恶性增殖及凋亡的影响及作用机制

目的探讨紫草素对膀胱癌(BC)细胞T24恶性增殖、凋亡的影响及可能作用机制。方法含不同浓度紫草素培养液(0、10、20、40、80μmoL·L^(-1))培养对数生长期T24细胞48 h,CCK-8法检测细胞存活率;平板克隆实验检测细胞集落形成能力;流式细胞术检测细胞凋亡水平;荧光探针2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(ROS)生成水平;比色法检测细胞丙二醛(MDA)及还原型谷胱甘肽(GSH)含量;RT-qPCR技术检测细胞中Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)mRNA相对表达;Western blot法检测细胞中Keap1、Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)及醌氧化还原酶1(NQO1)蛋白相对表达量。结果T24细胞存活率、集落形成数、GSH含量、Nrf2 mRNA和蛋白、HO-1及NQO1蛋白相对表达量均随紫草素作用浓度增加而降低(P<0.05);紫草素作用效果呈浓度依赖性(P<0.05)。结论紫草素可抑制BC细胞恶性增殖并促进其凋亡,其作用机制可能与抑制Keap1/Nrf2通路激活,提高细胞内ROS水平进而促进BC细胞内氧化还原稳态失衡有关。

紫草素对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞COX-2表达的影响

目的观察紫草素对人滑膜成纤维细胞环氧化酶-2(COX-2)mRNA表达的影响,探讨紫草素可能的免疫抗炎作用机制。方法分离并培养人膝关节滑膜成纤维细胞,各加入IL-1β、TNF-α15 ng/mL,体外模拟人类风湿关节炎滑膜细胞。以塞来昔布作阳性对照,进行紫草素(浓度为5～80μg/L)干预,分别作用24、48、72 h后终止培养。用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达情况。结果紫草素对滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA的表达,对浓度无明显依赖性(P=0.089),用药时间上有显著统计学意义(P<0.0001)。塞来昔布抑制滑膜成纤维细胞COX-2mRNA水平的表达亦无明显浓度依赖性(P=0.051),而与用药时间显著相关(P<0.0001)。紫草素对滑膜成纤维细胞COX-2 mRNA表达的影响与塞来昔布相比,其抑制作用无明显差异。结论紫草素可通过抑制COX-2 mRNA基因表达,减少炎症性细胞因子的产生而发挥其对类风湿关节炎的免疫抗炎作用,为开发紫草素成为COX-2抑制剂提供一定的实验基础。

紫草素抑制ERK1/2-NF-κB通路对大鼠心房颤动的改善作用

目的探讨紫草素通过细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)/核转录因子-κB(NF-κB)介导心肌细胞纤维化对大鼠心房颤动(简称房颤)的改善作用。方法30只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、紫草素组,每组10只。紫草素组大鼠以4 mg/kg紫草素灌胃给药,正常对照组和模型组大鼠等量生理盐水灌胃,1次/d,连续7 d;除正常对照组外,其余组大鼠按照1 ml/kg的剂量尾静脉注射乙酰胆碱-氯化钙(ACh-CaCl2)混合液1次/d、连续7 d建立房颤模型,正常对照组大鼠尾静脉注射等量生理盐水,7 d后取材。心电图检测各组大鼠房颤诱发时间和持续时间;超声心动图检测各组大鼠心功能;HE染色观察各组大鼠心肌组织病理学改变;Masson染色检测各组大鼠心肌组织胶原面积百分比;Western blotting检测各组大鼠胶原蛋白Ⅰ(ColⅠ)、ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB p65和p-NF-κB p65蛋白表达情况。结果正常对照组大鼠心肌细胞排列致密、整齐;模型组大鼠心肌细胞排列紊乱、肥大、间隙增宽;紫草素组大鼠心肌细胞形态和结构较模型组有所改善。与正常对照组比较,模型组及紫草素组大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室缩短分数(LVFS)降低,左心室收缩末期内径(LVESD)和左心室舒张末期内径(LVEED)增高,胶原面积百分比增加,ColⅠ、p-ERK1/2和p-NF-κB p65蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,紫草素组大鼠房颤诱发时间延长、持续时间缩短,LVEF、LVFS升高,LVESD、LVEED缩短,胶原面积百分比减小,ColⅠ、p-ERK1/2和p-NF-κB p65蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论紫草素可能通过抑制ERK1/2-NF-κB信号通路而减轻心肌纤维化,抑制房颤的发生,并改善心功能。

1,4,5,8-四甲氧基萘-2-甲醛的合成

对紫草素合成中间体1,4,5,8-四甲氧基萘-2-甲醛的制备工艺进行了改进,由萘茜在溴化四丁基铵催化下进行还原甲基化的收率由文献报道的44%提高到90%,标题化合物总收率72%(以对二甲氧基苯计)。

紫草素对膀胱癌细胞T24增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨紫草素抑制T24细胞生长的作用及其机制。方法:MTT法测定紫草素对T24细胞的生长抑制实验;用RT-PCR、westen-blot法检测不同浓度的紫草素作用于T24细胞时,对COX-2 mRNA和蛋白表达的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果:25、50和75μmol/L紫草素均能抑制T24细胞生长,诱导凋亡,并呈明显的量效关系和时间依赖性,紫草素能够抑制COX-2 mRNA和蛋白的表达。结论:紫草素能明显抑制T24细胞增殖,促其凋亡,其机制可能与COX-2表达下调有关。

紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的作用研究

目的:研究紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的作用。方法:以不同浓度的紫草素作用于人喉癌Hep-2细胞,MTT法检测紫草素对人喉癌Hep-2细胞生长的抑制率,荧光显微镜观察人喉癌Hep-2细胞凋亡情况,流式细胞仪分析细胞周期分布及凋亡率变化,荧光定量PCR法测量人喉癌Hep-2细胞增殖诱导配体(APRIL)的表达量。结果:紫草素对人喉癌Hep-2细胞的增殖有明显抑制作用,并呈明显的量效关系和时间依赖性。紫草素主要阻滞细胞G1期向S期的发展。紫草素作用人喉癌Hep-2细胞后其APRIL mRNA表达量随时间的延长和浓度的增加而升高,48 h后各紫草素浓度组APRIL mRNA表达与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:紫草素可以抑制喉癌Hep-2细胞的增殖,未凋亡的人喉癌Hep-2细胞因APRIL表达升高而有增殖能力增强的潜在趋势。

左旋紫草素肠道转运及Caco-2细胞转运特性

目的研究左旋紫草素肠道及Caco-2细胞转运特征及其机制。方法应用翻转肠囊法和Caco-2细胞模型考察时间、浓度对左旋紫草素转运吸收特性的影响,应用P-糖蛋白抑制剂维拉帕米对左旋紫草素转运吸收机制进行研究,采用HPLC法测定左旋紫草素的浓度,计算其表观渗透系数(Papp)。结果在Caco-2细胞模型,随浓度增加和时间延长,左旋紫草素的累积转运量逐渐增加;加用维拉帕米后,使AP侧到BL侧的表观渗透系数Papp(AP→BL)显著增加,而从BL侧到AP侧的表观渗透系数Papp(BL→AP)显著降低。在翻转肠囊模型,100μmol·L-1左旋紫草素中加入维拉帕米后Papp显著增加。结论左旋紫草素的转运存在被动转运和主动转运2种形式,P糖蛋白参与主动转运过程;该药经肠道吸收中等,加入维拉帕米可能促进吸收。

紫草素纳米结构脂质载体经Caco-2细胞及大鼠肠道的转运特征研究

目的研究紫草素纳米结构脂质载体经Caco-2细胞及大鼠肠道的转运特征。方法采用Caco-2细胞模型和翻转肠囊法考察转运时间、药物浓度对紫草素纳米结构脂质载体吸收的影响,采用HPLC法测定紫草素的浓度,计算其表观渗透系数(Papp)。结果随吸收时间与浓度的增长,紫草素纳米结构脂质载体的累积转运量比原料药紫草素增加明显。细胞转运实验中,紫草素纳米结构脂质载体的Papp(BL→AP)/Papp(AP→BL)比值下降且小于1.5。大鼠肠囊翻转实验中,紫草素纳米结构脂质载体的Papp值是紫草素的2.46倍。结论紫草素纳米结构脂质载体可在一定程度上改善其在肠道的吸收,吸收存在被动扩散和主动转运两种形式。

1,4,5,8-四甲氧基萘-2-甲醛的合成工艺研究

The synthesis of 1,4,5,8-tetramethoxynaphthalene-2-carboxaldehyde,an intermediate of shikonin was investigated.1,4,5,8-tetramethoxynaphthalene was prepared from the oxidation of 1,5-dinitronaphthalene and the reaction product naphthazarin was directly methylated without been purified.The title compound was obtained by the formylation of 1,4,5,8-tetramethoxynaphthalene.The overall yield was 38.5% based on 1,5-dinitronaphthalene.

4-羟基-5,8-二甲氧基-萘-2-甲醛的合成

以2,5-二甲氧基苯甲醛为起始原料合成出了软毛柿木中分离到的天然产物4-羟基-5,8-二甲氧基-萘-2-甲醛,原料经过Stobbe缩合,环化,还原,氧化四步生成产物,并对醇选择性氧化成醛的过程进行了详细的研究.整个合成总的产率为32.2%.

紫草素体外对细胞色素P4501A2和羧酸酯酶2介导氟他胺代谢的抑制作用

目的考察紫草素体外对氟他胺(Flu)经细胞色素P4501A2(CYP1A2)酶的羟化反应及羧酸酯酶2(CES2)介导的水解反应的抑制作用,并对其体内抑制强度进行定量预测。方法在确定Flu水解反应动力学的前提下,分别以Flu和7-乙氧基试卤灵为CES2和CYP1A2的底物,采用人肝微粒体(HLM)的体外孵育体系,通过高效液相色谱仪及荧光酶标仪测定产物的生成量,计算残余活性、半数抑制浓度(IC_(50))及抑制动力学常数(K_i),同时对抑制类型进行分析,并进一步进行体内抑制强度的定量预测。结果紫草素对CES2活性具有较强抑制作用,IC_(50)和K_i值分别为7.01μmol·L^(-1)和7.88μmol·L^(-1),抑制类型为非竞争型抑制;而对CYP1A2无显著抑制作用(IC_(50)>100μmol·L^(-1))。体内抑制效应的预测结果表明,紫草素与Flu联用时,可能引起Flu在体内暴露水平的增加,增幅可达6%～43%。结论紫草素对Flu产生潜在肝毒性产物的水解代谢通路存在较强抑制作用,而对生成药效活性产物的羟化代谢通路影响较小。

紫草素通过调控PI3K/AKT通路减轻脑缺血再灌注损伤的机制研究

目的探讨脑缺血再灌注损伤后PI3K/AKT信号通路的活性变化及紫草素发挥相应作用的调控机制。方法采用改良的Longa线栓法制作小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型。成年雄性CD-1小鼠随机被分为5组:假手术组(Sham)、缺血再灌注组(Vehicle)、低剂量紫草素干预组(L-Shi)、高剂量紫草素干预组(H-Shi)、紫草素+LY294002组(H-Shi+LY294002)。各组小鼠取材前先进行神经功能评分、取材后进行脑梗死体积、脑组织含水量的测定,并对超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)含量的变化进行检测,运用免疫组化,蛋白印迹法和实时定量PCR等方法检测缺血侧脑组织中PI3K、AKT、HO-1、Nrf2蛋白和mRNA水平的变化;以及紫草素在脑缺血再灌注损伤中的神经保护作用及其对PI3K/AKT信号转导通路的作用。结果H-Shi组可明显改善神经功能缺损、降低脑含水量、减小脑梗死体积;免疫组化、Western blot结果显示H-Shi组在24 h和72 h均可明显升高p-PI3K、p-AKT、HO-1、Nrf2的表达,但这种作用同样可被LY294002阻断。H-Shi对于HO-1、Nrf2的mRNA表达与免疫组化和Western blot结果一致。结论PI3K/AKT通路参与了紫草素的脑保护作用,为其临床进一步应用提供了理论基础。

紫草素对白血病细胞HL-60增殖及凋亡作用的影响

目的研究紫草素诱导人早幼粒白血病HL-60细胞凋亡的作用机制。方法 MTT比色法检测紫草素对HL-60细胞增殖的影响;Annexin V/PI分析凋亡率;半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测bcl-2基因水平,分析白血病HL-60细胞凋亡作用与bcl-2表达水平关系。结果紫草素在1～8μg/mL浓度范围内能抑制HL-60细胞的增殖,具有时间和浓度的依赖性。2μg/mL紫草素能够诱导HL-60细胞凋亡,凋亡呈时间依赖性。在2μg/mL紫草素作用下,HL-60细胞bcl-2表达明显下调。结论紫草素能够诱导HL-60细胞凋亡,其作用机制与下调bcl-2表达有关。

β-紫草素复方的药代动力学研究

目的 对β 紫草素在方剂中药代动力学进行研究。方法 用过氧化氢氧化β 紫草素中所含羟基的反应与鲁米诺 -过氧化氢 -钴离子化学发光反应相偶合进行测定。结果 用实用药动学计算程序 3P87处理数据得到系列药动学参数。结论 β 紫草素在复方中有更大的药效作用。

NF-κB信号通路在紫草素诱导Tca8113细胞凋亡中的作用机制

目的:探讨NF-κB信号转导通路在紫草素诱导Tca-8113细胞凋亡中的作用。方法:采用蛋白印迹法检测IκBa,磷酸化-IκBa、bcl-2及Bax蛋白的表达,采用EMSA方法检测NF-κB的DNA结合活性,采用酶联免疫吸附方法(ELISA)分析Caspase 3、8、9的活性。采用SPSS12.0软件包对数据进行单因素方差分析及t检验。结果:经过紫草素作用的癌细胞,磷酸化-IκBa蛋白及NF-κB的DNA结合活性均明显降低,Bcl-2蛋白表达显著减少。Caspase 3、8、9在紫草素诱导的细胞凋亡过程中被激活,泛Caspase阻断剂Z-Asp-CH2-DCB可以明显抑制紫草素引起的细胞凋亡(P=0.02)。结论:紫草素诱导口腔鳞癌细胞的凋亡作用,至少部分通过抑制NF-κB信号通路活性,继而调节其下游调亡调控分子,包括bcl-2家族及Caspase家族等来实现。应用紫草素特异性抑制口腔鳞癌中高激活状态的NF-κB通路,可望成为口腔鳞癌防治的一条新的有效途径。

紫草素诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡及其机制的研究

目的:研究紫草素诱导体外培养的子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡作用及其机制。方法:流式细胞术分析细胞周期分布及凋亡率变化;免疫组化法(SABC法)检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果:紫草素可诱导细胞凋亡,改变细胞周期分布,多数细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05);紫草素可上调Bax和下调Bcl-2基因蛋白的表达,与空白组对照差异有统计学意义(P<0.05)。结论:紫草素能够诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞凋亡,其凋亡机制可能与促进Ishikawa细胞中Bax上调,Bcl-2下调相关。

紫草中活性成分的体外抗癌作用

对紫草中化学成分进行了抗癌活性研究。以顺氯氨铂(DDP)为阳性对照,通过形态学、MTT实验考察了从紫草中分离得到的7个化合物对人胃癌细胞MGC-803和人肝癌细胞BEL-7402的增殖抑制作用,并以抑制率和半数抑制浓度(IC50)为指标进行了评价。结果表明,7个化合物在体外对两株癌细胞有不同程度的抑制作用。去氧紫草素(Ⅰ)、β,β-二甲基丙烯酰紫草素(Ⅱ)、异丁酰紫草素(Ⅲ)、紫草素(Ⅳ)、甲基紫草素(Ⅴ)、β-谷甾醇(Ⅵ)、咖啡酸脂肪醇酯混合物(Ⅶ)和DDP对胃癌细胞MGC-803的IC50分别为:1.7、1.4、7.0、0.5、1.5、>100、>100和4.4μg/mL;对肝癌细胞BEL-7402的IC50分别为:1.5、1.3、34.0、1.3、1.4、>100、>100和7.6μg/mL。证明从紫草分离得到的萘醌类化合物(Ⅰ-Ⅴ)对人胃癌细胞MGC-803和人肝癌细胞BEL-7402的生长有较强的抑制作用,呈明显的剂量-药效依赖关系,其中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的抗肿瘤活性远强于阳性药物DDP。化合物Ⅵ、Ⅶ则没有抑制这两株癌细胞的作用。