基于miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭心肌纤维化的机制

目的基于miRNA21-5p调控转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1,TGF-β1)/Smads信号通路探讨苓桂气化方抗射血分数保留心力衰竭(heart failure with preserved ejection fraction,HFpEF)心肌纤维化的机制。方法40只4周龄自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)平均分为HFpEF组、沙库巴曲缬沙坦组(LCZ696,0.018 g·kg^(-1))、苓桂气化方低剂量组(LGQH-L,3.87 g·kg^(-1))和苓桂气化方高剂量组(LGQH-H,7.74 g·kg^(-1)),给予高脂、高盐及高糖饮食16周及腹腔注射链脲霉素溶液8周建立HFpEF大鼠模型。10只威斯塔京都(Wistar Kyoto,WKY)大鼠和10只SHR大鼠作为对照组,以普通饲料喂养至实验结束。造模成功后,WKY、SHR和HFpEF组给予等剂量生理盐水,其他3组按照预先规定的干预措施,每天灌胃1次,持续6周。干预结束后,行超声心动图测量左心室(left ventricle,LV)前壁厚度(LV end-diastolic anterior wall thickness,LVAWd)、LV后壁厚度(LV end-diastolic posterior wall thickness,LVPWd)、LV舒张末内径(LV end-diastolic internal diameter,LVIDd)、LV射血分数(LV ejection fraction,LVEF)、LV舒张早期二尖瓣流入峰值速度(E)、舒张晚期二尖瓣流入峰值速度(A)和LV舒张早期二尖瓣环运动速度(e'),并计算E/A和E/e';酶联免疫吸附试验检测血清心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、B型利钠肽(B-type brain natriuretic peptide,BNP)及半乳糖凝集素3(Galectin-3,Gal-3);病理切片进行苏木精伊红及马松染色观察心肌肥厚及纤维化,并计算LV室壁厚度(LV wall thickness,LVWT)、胶原体积分数(collagen volume fraction,CVF)及血管周围纤维化比率(perivascular fibrosis ratio,PFR);实时定量聚合酶链反应检测LV心肌miRNA21-5p及TGF-β1/Smads信号通路相关mRNA表达;蛋白印迹检测LV心肌TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,HFpEF组的LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR显著升高(P<0.05或P<0.01);LV心肌miR-NA21-5,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、P-Smad2/3蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01);Smad7 mRNA及蛋白表达显著下调(P<0.05或P<0.01)。与HFpEF组比较,苓桂气化方呈剂量依赖性减少LVAWd、LVPWd、LVIDd、E/A、E/e'、ANP、BNP、Gal-3、LVWT、CVF和PFR(P<0.05或P<0.01);下调miRNA21-5p,α-SMA、CollⅠ、CollⅢ、TGF-β1、Smad2、Smad3 mRNA表达和α-SMA、CollⅠ、GF-β1、P-Smad2/3蛋白表达(P<0.05或P<0.01);上调Smad7 mRNA及蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。结论苓桂气化方可能通过靶向miRNA21-5p调控TGF-β1/Smads信号通路抑制心肌纤维化,从而减轻HFpEF大鼠LV重塑和舒张功能障碍,是治疗HFpEF的有效中药复方。

P21活化激酶4在胃肠道间质瘤中的表达及意义

目的通过研究不同危险度胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor,GIST)中P21活化激酶4(P21-activated kinase 4,PAK4)的表达量,探讨PAK4与GIST危险度的关系。方法选取2020年10月至2021年4月秦皇岛市第一医院病理诊断为GIST患者24例,根据共识将患者分为高危组、中危组、低危组,通过病理切片来确定不同危险度组的PAK4的表达量,并根据Callow计算方法对不同危险度组进行评分。结果PAK4随着GIST危险度增加表达升高,并且与正常对照组织及瘤旁组织相比,GIST中的PAK4表达量升高。结论PAK4表达量与GIST危险度相关,并且随着危险度升高,表达量也升高。

血清microRNA-21、microRNA-193a-3p表达与结直肠癌患者手术预后的关系

目的探究血清microRNA-21(miR-21)、microRNA-193a-3p(miR-193a-3p)水平与结直肠癌患者手术预后的关系。方法回顾性分析2020年1月—2022年1月苏州大学附属第一医院收治112例结直肠癌患者的病历资料。患者均接受结直肠癌根治术,术后随访16个月,记录患者的预后生存结局,多因素逐步Logistic回归分析结直肠癌患者手术预后的影响因素,评估血清miR-21、miR-193a-3p对结直肠癌患者预后的预测效能。结果112例结直肠癌患者死亡22例,病死率为19.64%;生存90例,生存率为80.36%。死亡组术前血清miR-21 mRNA相对表达量、临床分期Ⅲ期占比、淋巴结转移率均高于生存组(P<0.05),血清miR-193a-3p m RNA相对表达量低于生存组(P<0.05)。多因素逐步Logistic回归分析结果显示,临床分期Ⅲ期[OR=3.777(95%CI:1.399,10.194)]、淋巴结转移[OR=5.099(95%CI:1.715,15.156)]、miR-21表达升高[OR=4.889(95%CI:1.645,14.533)]、miR-193a-3p表达降低[OR=4.402(95%CI:1.481,13.084)]均是直肠癌患者预后的影响因素(P<0.05)。受试者工作特性曲线分析结果显示,血清miR-21、miR-193a-3p单一及联合预测结直肠癌预后的敏感性分别为69.04%(95%CI:0.487,0.813)、72.73%(95%CI:0.495,0.884)、86.36%(95%CI:0.640,0.964),特异性分别为62.22%(95%CI:0.513,0.720)、68.89%(95%CI:0.581,0.780)、90.00%(95%CI:0.814,0.950),曲线下面积分别为0.782、0.731和0.901。结论结直肠癌患者术前miR-21、miR-193a-3p表达与术后预后密切相关,且在结直肠癌患者的预后结局中表现出良好的预测效能。

血清miRNA-21-5p、miRNA-5189-5p表达水平对行根治性前列腺切除术老年前列腺癌患者预后的评估价值

目的分析血清微小RNA(miRNA)-21-5p、miRNA-5189-5p表达水平对行腹腔镜根治性前列腺切除术(LRP)的老年前列腺癌患者预后的评估价值。方法选取2014年1月至2018年9月该院收治的行LRP治疗的213例老年前列腺癌患者作为研究对象,根据5年随访结局将患者分为预后优良组(87例)和预后不良组(126例)。收集患者术前临床基线资料及血清miRNA-21-5p、miRNA-5189-5p表达水平。采用Logistic回归分析筛选影响患者预后的因素,并以独立危险因素构建预后预测模型,绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析其预测价值。结果多因素Logistic回归分析结果显示,患者血清前列腺特异性抗原(PSA)水平、切缘阳性、血清miRNA-21-5p与miRNA-5189-5p表达水平均为行LRP的老年前列腺癌患者预后的独立危险因素(P<0.05),以独立危险因素构建联合预测模型,各因素单独预测行LRP的老年前列腺癌患者预后的曲线下面积均小于4项联合(P<0.05)。结论血清miRNA-21-5p、miRNA-5189-5p表达水平对行LRP的老年前列腺癌患者预后的预测具有较高价值。

miR-21-3p靶向STAT3促进银屑病角质形成细胞增殖的研究

目的探讨miR-21-3p及其靶蛋白信号转导子和转录激活子3蛋白(STAT3)在寻常型银屑病发生过程中角质形成细胞的作用意义。方法对皮肤组织中STAT3蛋白表达情况的检测选择免疫组织化学法,对健康人群皮肤组织及银屑病患者皮损组织miR-21-3p表达量的检测选择实时荧光定量PCR法,靶基因STAT3和miR-21-3p关系的检测选择双荧光素酶报告基因。化学合成miR-21-3p模拟物、抑制剂,瞬时转染HaCaT细胞,对不同分组细胞进行CCK8、流式细胞凋亡实验,探究分析miR-21-3p调控细胞表型主要作用。对于转染细胞中STAT3蛋白表达情况,选择Western Blot检测。结果寻常型银屑病患者皮肤组织中miR-21-3p呈高表达(P<0.05)。STAT3免疫组化阳性表达定位于细胞浆,在银屑病组患者皮损组织阳性表达率为82.22%(37/45)高于正常皮肤组织(P<0.01)。双荧光素酶报告基因显示miR-21-3p与STAT3存在结合,呈靶向关系。miR-21-3p mimics促进HaCaT细胞增殖活性,抑制细胞凋亡;miR-21-3p inhibitor抑制HaCaT细胞的增殖能力,促使细胞趋向凋亡。miR-21-3p转染HaCaT过表达可对STAT3蛋白表达量产生促进,相反则降低(F=48.632,P<0.01)。结论miR-21-3p呈现正调控关系,能够靶向调控STAT3;两者共同作用参与并加重银屑病的病程,并抑制患者细胞凋亡,调节角质形成细胞增殖活性。

LncRNA p21调控Hippo-YAP信号通路对小鼠腹主动脉瘤形成的影响及机制

目的 探究长链非编码RNA p21(long non-coding RNA,LncRNA p21)调控Hippo-Yes相关蛋白(Hippo-Yes-associated protein, Hippo-YAP)信号通路对小鼠腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)形成的影响。方法 C57BL/6 ApoE-/-通过皮下植入渗透性微泵构建血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导小鼠AAA模型。将C57BL/6 ApoE-/-随机分为假手术组(sham)、模型组(model)、LncRNA p21阴性对照组(sh-NC)、LncRNA p21敲低组(sh-LncRNA p21)。HE和血管弹力纤维染色(VVG)观察血管形态变化;qRT-PCR检测LncRNA p21表达;Western blot检测MMP-2、MMP-9、TIMP-1表达;原位末端标记法(TUNEL)染色检测平滑肌细胞凋亡;Western blot检测caspase-3、cyclinD1及Hippo-YAP信号通路蛋白表达。结果 与sham组相比,model组小鼠血管弹力纤维断裂紊乱,出现明显损伤,且LncRNA p21、MMP-2、MMP-9、caspase-3表达和细胞凋亡率均增加(P<0.01),TIMP-1、cyclinD1和YAP、TAZ表达均降低(P<0.01)。与model组相比,sh-LncRNA p21组小鼠血管弹力纤维断裂及损伤程度减轻,LncRNA p21、MMP-2、MMP-9、caspase-3表达和细胞凋亡率均降低(P<0.01),TIMP-1、cyclinD1和YAP、TAZ表达均增加(P<0.01)。结论 LncRNA p21能够促进小鼠AAA形成,其机制与调控Hippo-YAP信号、促进细胞凋亡、抑制细胞增殖相关。

温石棉对内皮细胞Wnt5a、p16和p21表达的影响

目的探讨温石棉对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的影响。方法实验组以50、100、200 mg/L温石棉纤维液刺激HUVECs 24、48、72 h,对照组仅加RPMI 1640培养基培养细胞,观察细胞形态变化,β-半乳糖苷酶法分析细胞衰老情况,四甲基偶氮唑蓝法检测细胞存活率。采用实时荧光定量PCR法检测细胞中Wnt5a、p16和p21 mRNA的表达情况。结果实验组HUVECs多呈梭形,部分呈圆形或不规则形,出现裸核及空泡现象,可见死亡细胞。随温石棉质量浓度及暴露时间的增加,细胞活性逐渐降低,衰老细胞逐渐增多。100 mg/L温石棉处理HUVECs 24 h时,细胞生长较活跃。与对照组相比,实验组Wnt5a、p16和p21 mRNA表达水平均增高(P<0.05)。结论温石棉可促进HUVECs衰老,Wnt5a、p16和p21参与此过程。

TGF-β_(1)通过miR-21d-5p调控BMP7表达诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移

目的:探讨转化生长因子-β_(1)(TGF-β_(1))可能通过微小RNA-21d-5p(miR-21d-5p)对骨形态发生蛋白7(BMP7)的调控,从而对肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的影响及可能机制。方法:观察TGF-β_(1)处理的肾小管上皮细胞HK-2并检测miR-21d-5p的表达,在HK-2细胞中分组转染miR-21d-5p或anti-miR-21d-5p,再使用TGF-β_(1)处理,观察过度表达或抑制表达miR-21d-5p对TGF-β_(1)诱导肾小管上皮细胞的细胞活性及迁移的影响。分析TGF-β_(1)、miR-21d-5p与BMP7的靶向关系。共转染miR-21d-5p和pcDNA3.1-BMP7,或anti-miR-21d-5p和si-BMP7,使用TGF-β_(1)处理,评估TGF-β_(1)、miR-21d-5p与BMP7的在肾小管上皮细胞的增殖以及迁移的相互关系。结果:TGF-β_(1)处理HK-2细胞后,miR-21d-5p表达和迁移细胞数量升高(P<0.05),P21和E-钙黏蛋白(E-cadherin)水平降低(P<0.05)。过度表达miR-21d-5p增加TGF-β_(1)诱导HK-2细胞增殖和迁移上调(P<0.05),降低P21和E-cadherin蛋白表达(P<0.05),过度表达BMP7可以逆转此过程。抑制miR-21d-5p降低TGF-β_(1)诱导HK-2细胞增殖和迁移细胞水平(P<0.05),显著升高P21和E-cadherin蛋白水平(P<0.05),被抑制表达的BMP7可以逆转此过程。结论:TGF-β_(1)可能通过miR-21d-5p靶向调控BMP7表达,从而诱导肾小管上皮细胞增殖及迁移,进一步影响肾脏纤维化进展。

肺部超声评分及血浆miRNA-21-5p对脓毒症患者肺损伤程度及预后预判价值

目的分析外周血miRNA-21-5p水平与肺部超声评分(LUS)对脓毒症患者并发急性肺损伤(ALI)的病情及预后的预测价值。方法选择我院就诊的90例ALI患者作为研究对象,根据ALI患者病情严重程度分为3组:低危组(38例,APACHEⅡ评分≤10分)、中危组(32例,APACHEⅡ评分10-20分)及重危组(20例,APACHEⅡ评分≥20分)。检测比较3组血浆miRNA-21-5p、B型脑钠肽(BNP)、D二聚体(D-dimer)、氧合指数(OI)、血管外肺水指数(EVLWI)以及LUS评分。采用Pearson直线分析评估血浆miRNA-21-5p水平及LUS评分和APACHEⅡ评分相关程度。依据患者预后结局分为存活组(71例)和死亡组(19例),比较上述临床指标的差异。应用多元Logistic回归分析上述指标与患者预后结局的危险程度。应用受试者工作特征曲线(ROC)分析血浆miRNA-21-5p水平与LUS评分对ALI患者预后的诊断价值。结果中危组血浆miRNA-21-5p、BNP、EVLWI及LUS评分均低于重危组(P<0.05),但均高于轻危组(P<0.05);而中危组OI高于重危组(P<0.05),但低于轻危组(P<0.05)。三组D-dimer均无统计学差异(P>0.05)。血浆miRNA-21-5p水平及LUS评分和APACHEⅡ评分均呈正相关(r=0.857,P=0.026;r=0.795,P=0.036)。死亡组的血浆miRNA-21-5p、BNP、EVLWI及LUS评分显著高于存活组(P<0.05),但OI则显著低于存活组(P<0.05)。血浆miRNA-21-5p水平与LUS评分是ALI患者预后结局的危险因素(OR=3.656,P=0.013;OR=2.913,P=0.029)。血浆miRNA-21-5p切点3.25与LUS评分切点17.50对预测ALI患者短期预后的曲线下面积为0.856,灵敏度为84.2%和特异度为81.7%(P=0.018)。结论血浆miRNA-21-5p与LUS评分能有效评估ALI患者病情严重程度,对短期预后结局预测有较好价值。

尿液前列腺特异性抗原联合微小RNA-21-5p对前列腺癌的早期诊断价值

目的探讨尿液前列腺特异性抗原(PSA)联合微小RNA-21-5p(miR-21-5p)对前列腺癌(PCa)的早期诊断价值。方法选取2020年1月至2022年12月重庆市合川区人民医院收治的73例PCa患者为病例组,75例良性前列腺增生(BPH)患者为对照组。检测两组尿PSA、miR-21-5p水平,分析PSA和miR-21-5p对PCa早期诊断价值。结果病例组患者尿液PSA、miR-21-5p水平明显高于对照组(P<0.05)。随着Gleason分级、TNM分期的升高,PCa患者尿PSA、miR-21-5p水平逐渐升高(P<0.05);存在转移的PCa患者尿PSA、miR-21-5p水平高于未转移患者(P<0.05)。PSA、miR-21-5p及串联联合试验诊断PCa的受试者操作特征曲线下面积为0.841、0.878、0.947,其中联合诊断的特异度显著高于单独检测(P<0.05)。结论PCa患者尿PSA、miR-21-5p水平明显升高,PSA、miR-21-5p可作为PCa诊断和病理分级的参考指标,联合检测对PCa具有更高诊断效能。

CD137信号调控P53/P21通路对血管平滑肌细胞衰老的机制研究

目的探讨CD137信号调控P53/P21通路对血管平滑肌细胞(VSMC)衰老的机制。方法选择8周龄雄性C57BL/6J小鼠30只,随机分为年轻组(8周龄)和衰老组(80周龄),每组15只。饲养对应时间后处死小鼠并分离血浆及主动脉血管。细胞实验中将正常VSMC分为空白对照组、博来霉素(BLM)组、联合激动剂组和联合抑制剂组。采用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒染色检测VSMC衰老水平。Western blot和聚合酶链反应检测组织及细胞中衰老相关蛋白,酶联免疫吸附测定衰老相关炎性因子表达。结果衰老组小鼠主动脉中CD137、组蛋白h2ax(γ-H2AX)表达明显高于年轻组,增殖细胞核抗原(PCNA)表达明显低于年轻组(P<0.05)。衰老组小鼠血浆CD137水平明显高于年轻组[(154.0±4.1)pg/ml vs(98.0±2.3)pg/ml,P<0.05]。与空白对照组比较,BLM组衰老VSMC明显增加(P<0.05);与BLM组比较,联合激动剂组衰老VSMC明显增加(P<0.05);与联合激动剂组比较,联合抑制剂组衰老VSMC明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,BLM组肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β水平明显增高(P<0.05);与BLM组比较,联合激动剂组TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显增加(P<0.05);与联合激动剂组比较,联合抑制剂组TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白对照组比较,BLM组、联合激动剂组和联合抑制剂组B淋巴细胞瘤2基因、γ-H2AX、P53和P21表达明显增加,PCNA表达明显减少(P<0.05);与BLM组比较,联合激动剂组P53和P21表达明显增加(P<0.05);与联合激动剂组比较,联合抑制剂组P53表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CD137信号调控P53/P21通路促进VSMC衰老。

IgA肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA表达与肾病预后不良的关系分析

目的:探讨免疫球蛋白A(IgA)肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、增殖细胞核抗原(PCNA)表达与肾脏预后不良的关系。方法:选取2017年4月至2019年8月孝感市中心医院收治的145例IgA肾病患者作为研究对象,采用免疫组化法检测肾小球系膜组织P21、P27、PCNA的表达。所有患者均接受跟踪随访24个月,统计预后情况,对比不同预后患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA的表达,并采用Logistic回归分析法分析IgA肾病患者预后不良的影响因素。结果:IgA肾病患者肾小球系膜组织P21、P27、PCNA阳性细胞表达率分别为(38.69±6.83)%、(55.94±8.08)%、(33.47±5.72)%;IgA肾病患者预后不良发生率为17.24%,预后不良患者肾小球系膜组织P21、PCNA阳性细胞表达率均高于预后良好组(P<0.05),P27阳性细胞表达率低于预后良好组(P<0.05);经Logistic多元回归分析显示,舒张压升高、24 h蛋白尿增多、系膜细胞增生、节段性肾小球硬化、肾小管萎缩/间质纤维化、新月体与P21、PCNA阳性表达率升高、P27阳性细胞表达率降低均是影响IgA肾病患者预后不良的危险因素(P<0.05)。结论:IgA肾病肾小球系膜组织存在P21、P27、PCNA阳性表达,IgA肾病预后不良患者肾小球系膜组织P21、PCNA阳性细胞表达率均高于预后良好者,P27蛋白阳性细胞表达率低于预后良好者,且均为IgA肾病患者预后不良的危险因素。

电针干预老年膝骨关节炎大鼠关节软骨及软骨下骨P53、P21的表达

背景:膝骨关节炎的治疗方法有很多,其中电针作为一种重要的非药物治疗方法,治疗膝骨关节炎疗效确切,目前其确切的作用机制尚不明确。目的:探讨电针对老年大鼠膝骨关节炎关节软骨及软骨下骨P53、P21表达的影响。方法:青年组为8只6月龄SD雄性大鼠,16只24月龄SD雄性大鼠按随机抽样法分为老年组和电针组,每组8只。电针组大鼠接受电针刺激,每周5 d,1次/d,连续刺激8周,其余两组不做处理。8周后取材,ELISA法检测外周血Ⅱ型胶原C端肽水平,番红O-固绿染色对左膝关节软骨及软骨下骨进行形态学观察;改良Mankin’s评分评估膝关节软骨退变程度;显微CT检测左膝关节软骨及软骨下骨微结构;RT-qPCR、Western blot检测右膝关节软骨及软骨下骨基质金属蛋白酶13、P53、P21 mRNA及蛋白表达水平。结果与结论:①与青年组相比,老年组大鼠外周血Ⅱ型胶原C端肽水平升高(P<0.05);显微CT显示老年组大鼠骨体积分数、骨密度、骨小梁数量均降低(P<0.05),骨小梁分离度增大(P<0.05);番红O-固绿染色显示老年组大鼠软骨表层不平整,出现裂层,软骨细胞形态不均,染色不均匀,软骨与软骨下骨分界模糊,基质损失严重;Mankin’s评分增加(P<0.05);基质金属蛋白酶13、P53、P21 mRNA表达升高(P<0.05),蛋白表达升高(P<0.05);②与老年组相比,电针组大鼠Ⅱ型胶原C端肽水平降低(P<0.05);显微CT显示电针组大鼠骨体积分数、骨密度、骨小梁数量均升高(P<0.05),骨小梁分离度减小(P<0.05);番红O-固绿染色显示软骨表面较平整,红染较均匀,细胞形态结构介于青年组和老年组之间;Mankin’s评分降低(P<0.05);基质金属蛋白酶13、P21 mRNA表达降低(P<0.05),P53 mRNA表达有降低趋势,但差异无显著性意义(P>0.05);基质金属蛋白酶13、P53蛋白表达降低(P<0.05),P21蛋白表达有下降趋势,差异无统计学意义(P>0.05);③结果表明电针可能通过抑制P53和P21的表达而延缓老年大鼠关节软骨退变,并抑制关节软骨下骨骨质疏松,从而达到保护关节的作用延缓关节衰老。

牙龈卟啉单胞菌通过miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路促进食管鳞癌自噬

目的探讨牙龈卟啉单胞菌(Pg)促进食管鳞癌(ESCC)细胞自噬发生的分子机制。方法Pg感染siAtg7或氯喹(CQ)预处理的KYSE70细胞和KYSE140细胞,Western blot检测Atg7、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和p62蛋白,荧光共聚焦显微镜检测mRFP-GFP-LC3标记ESCC细胞自噬流,CCK-8法检测ESCC细胞活性,迁移小室检测ESCC细胞迁移及侵袭能力。miR-21-5p inhibitor、RASA1过表达或U0126分别阻断miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路,如上检测自噬相关表型变化。免疫组化检测ESCC组织中Pg丰度和LC3蛋白表达,RT-PCR检测ESCC及其癌旁组织中miR-21-5p的表达,统计分析Pg、LC3和miR-21-5p相关性。结果Pg感染诱导KYSE70细胞和KYSE140细胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达上调、p62蛋白表达下调,增加了mRFP-GFP-LC3标记细胞中的红色、绿色和黄色荧光斑点数目和荧光强度,同时促进KYSE70细胞和KYSE140细胞增殖、迁移和侵袭能力增加,上述Pg诱导的ESCC细胞表型改变被CQ或siAtg7预处理逆转。miR-21-5p inhibitor、U0126或RASA1过表达质粒的预处理,也同样逆转了Pg对ESCC细胞自噬的促进作用。Pg丰度与miR-21-5p、LC3蛋白表达呈正相关。结论Pg通过miR-21-5p/RASA1/ERK信号通路促进ESCC自噬发生。

miR⁃21⁃5p靶向BNC2调控食管癌的恶性生物行为的研究

目的:探讨miR-21-5p靶向肌成纤维细胞的身份转录因子(BNC2)调控食管癌(esophageal cancer,ESCA)细胞增殖、迁移、侵袭机制。方法:应用实时定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)方法检测食管癌组织中miR-21-5P和BNC2的相对表达量并用统计学分析其是否存在表达差异。用miR-21-5p mimics和miR-21-5P inhibitor和阴性对照(NC包括mimcs NC、inhibitor NC)分别转染ECA109、KYSE30两个食管癌细胞系后,进行细胞功能试验CCK8,Transwell等实验方法观察当miR-21-5p过表达或敲低时细胞的增殖、迁移和侵袭能力是否受到影响。通过生物信息学方法预测分析miR-21-5P的靶基因并通过双荧光素酶实验、qRT-PCR和Western blot实验验证miR-21-5p与靶向基因的负向调控关系。结果:qRT-PCR结果显示,相对于癌旁组织,BNC2在食管癌组织中的表达量显著性降低,而miR-21-5P则显著性升高,CCK8、Transwell实验结果显示,当miR-21-5P过表达时,细胞的增殖、迁移和侵袭能力增强,反之细胞功能受到抑制。也就是说,miR-21-5P在食管恶性肿瘤中起着促癌基因的功能作用。通过生物信息学方法预测miR-21-5P的靶基因为BNC2,双荧光素酶实验结果表明miR-21-5P与野生型BNC2′-UTR靶向结合,qRT-PCR和WB实验结果表示在食管癌细胞中,当miR-21-5P过表达时,BNC2的表达量降低,当miR-21-5P被敲低时,BNC2的表达量升高。这些结果显示miR-21-5P与BNC2存在靶向关系。结论:在食管癌中,miR-21-5p直接靶向BNC2,其调节作用可能从而导致癌症的增殖迁移和侵袭作用。

miR-21-3p通过下调CCT4抑制食管鳞癌细胞的迁移及侵袭

目的:探讨miR-21-3p对食管鳞癌细胞迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法:通过数据库检索miR-21-3p的下游靶基因,GEPIA2数据库预测CCT4在食管鳞癌中的表达和对食管鳞癌患者预后的影响,培养食管鳞癌细胞TE-1、KYSE150,将miR-21-3p inhibitor、SiCCT4、Plenti-CMV-CCT4-GFP/Puro转染至TE-1和KYSE150细胞中,分为miR-21-3p inhibitor组和inhibitor NC组、SiCCT4组和SiNC组、Plenti-CMV-CCT4组和inhibitor+Plenti-CMV-CCT4组,采用qRT-PCR检测各组细胞中miR-21-3p和CCT4 mRNA的表达水平,Transwell迁移侵袭实验检测各组细胞的迁移及侵袭能力,Western blot检测转染后各组细胞CCT4蛋白的表达水平。结果:数据库预测结果显示CCT4在食管鳞癌中过表达,与食管鳞癌患者总体生存期相关,与miR-21-3p呈正相关。qRT-PCR显示miR-21-3p和CCT4在食管癌细胞相较于正常上皮细胞表达显著升高,且在抑制miR-21-3p后CCT4表达水平显著降低(P<0.05)。Transwell实验显示,inhibitor组迁移率及侵袭率显著低于inhibitor NC组(P<0.05);SiCCT4组迁移率及侵袭率显著低于SiNC组(P<0.05);inhibitor+Plenti-CMV-CCT4组迁移率及侵袭率显著高于inhibitor组(P<0.05);Western blot检测CCT4蛋白发现,inhibitor组蛋白低于inhibitor NC组(P<0.05),inhibitor+Plenti-CMV-CCT4组蛋白显著高于inhibitor组(P<0.05)。结论:miR-21-3p和CCT4在食管癌中呈现过表达,miR-21-3p通过下调CCT4表达抑制食管癌细胞迁移和侵袭能力。

MiR-21-5p通过下调电压门控钾离子通道Kv1.1表达减轻大鼠三叉神经痛

目的:三叉神经痛(trigeminal neuralgia,TN)是一种临床上常见的神经病理性疼痛。电压门控性钾通道(voltage-gated potassium channel,Kv)已被证实参与TN的发生、发展,但具体机制仍不明确。微RNA(microRNA,miR)可通过调节三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)上Kv通道的表达及神经元兴奋性,参与神经病理性疼痛。本研究旨在探索TN模型中TG上Kv1.1和miR-21-5p的关系,评估miR-21-5p是否对Kv1.1有调控作用,为TN的治疗提供新的靶点。方法:将48只SD大鼠随机分为6组:1)假手术组(sham组,n=12),大鼠仅在术侧切口缝合,不结扎神经;2)Sham+agomir NC组(n=6),sham大鼠通过脑立体定位注射方法于术侧TG微量注射agomir NC;3)Sham+miR-21-5p agomir组(n=6),sham大鼠通过脑立体定位注射方法于术侧TG微量注射miR-21-5p agomir;4)TN组(n=12),采用铬肠线慢性缩窄性眶下远端神经损伤(chronic constriction injury of the distal infraorbital nerve,dIoN-CCI)法构建TN大鼠模型;5)TN+antagomir NC组(n=6),TN大鼠通过脑立体定位注射方法于术侧TG微量注射antagomir NC;6)TN+miR-21-5p antagomir组(n=6),TN大鼠通过脑立体定位注射方法于术侧TG微量注射miR-21-5p antagomir。检测术后各组大鼠面部机械痛阈变化。采用蛋白质印迹法和实时反转录聚合酶链反应检测术后大鼠术侧TG中Kv1.1和miR-21-5p的表达情况。利用双荧光素酶报告基因确定Kv1.1和miR-21-5p是否存在靶标关系,即miR-21-5p是否可以直接影响KCNA1的3'端非翻译区(3'-untranslated region,3'-UTR)。通过免疫荧光法测定,对脑立体定位注射的效果进行评价,随后分别将miR-21-5p的类似物(agomir)和agomir NC通过脑立体定位仪注射至sham组大鼠TG内,使miR-21-5p过表达;向TN组大鼠TG内分别注射miR-21-5p的抑制剂(antagomir)和antagomir NC,抑制miR-21-5p表达。观察给药前后大鼠行为学变化,检测干预后大鼠TG内miR-21-5p和Kv1.1表达的变化。结果:与基础痛阈值相比,TN组大鼠在术后第5至15天,面部机械痛阈值显著降低(P<0.05),sham组大鼠面部机械痛阈值稳定在正常水平,证明dIoN-CCI模型构建成功。与sham组相比,TN组TG中Kv1.1 mRNA和蛋白质表达均下调(均P<0.05),miR-21-5p的表达上调(P<0.05)。双荧光素酶报告结果显示:与转染mimic NC和野生型KCNA1(KCNA1 WT)组相比,共转染6 nmol/L或20 nmol/L的rno-miR-21-5p mimics的KCNA1 WT组的荧光素酶活性显著降低(P<0.001);与6 nmol/L rno-miR-21-5p mimics共转染组相比,较大剂量(20 nmol/L)的rno-miR-21-5p mimics共转染组的荧光素酶相对活性显著降低(P<0.001)。免疫荧光法结果显示通过脑立体定位可以将药物准确注入TG。TN组抑制miR-21-5p表达后,大鼠面部机械痛阈升高,TG中Kv1.1 mRNA及蛋白质的表达水平升高;sham组过表达miR-21-5p后,大鼠面部机械痛阈降低,TG中Kv1.1 mRNA及蛋白质的表达降低。结论:Kv1.1和miR-21-5p均参与TN的发生、发展,miR-21-5p可以通过结合KCNA13'-UTR来调控Kv1.1的表达,进而影响TN。

miR-21-5p调控MMP-9对急性缺血性卒中认知障碍的影响

目的探讨微小RNA-21-5p(miR-21-5p)调控基质金属蛋白酶-9(MMP-9)对急性缺血性卒中(AIS)后认知障碍的影响。方法选取2020年10月至2021年10月,河北医科大学第二医院神经内科收治住院的AIS患者58例。入院后收集患者的人口学、既往史、美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分等资料,对血清MMP-9、miR-21-5p进行检测。6个月后对患者进行随访,使用蒙特利尔认知评定量表(MoCA)评估认知功能,并将其分为两组:卒中后认知障碍组(PSCI)和卒中后非认知障碍组(N-PSCI)。探讨急性期miR-21-5p、MMP-9的关系,以及MMP-9在卒中后认知障碍中的作用。结果血清miR-21-5p与MMP-9存在相关性(r=-0.426,P=0.001),线性回归分析结果:β=-0.15,P=0.001。PSCI患者miR-21-5p低于N-PSCI组患者(P<0.05);PSCI发病率62.1%(36/58)。两组患者年龄、受教育年限比较差异有统计学意义(P<0.05)。采用受试者工作特征(ROC)曲线绘制图形,通过计算约登指数,寻找MMP-9最佳预测点。结果曲线下面积(AUC)为0.728,95%CI为0.591~0.866,最佳分界点为140.70,敏感度为0.594,特异性为0.850(P=0.006)。结论AIS患者miR-21-5p抑制血清MMP-9的表达。急性期MMP-9水平升高与PSCI相关,对PSCI有一定的预测价值。

血清lncRNA p21表达水平与PCI治疗急性心肌梗死患者预后的关系

目的研究血清lncRNA p21表达水平与经皮冠状动脉介入术(PCI)治疗急性心肌梗死患者预后的关系。方法选取2018年1月至2020年12月沭阳县中医院收治的102例PCI治疗的急性心肌梗死患者,患者术后随访1年,根据急性生理与慢性健康评分(APACHE-Ⅱ)将患者分为预后良好组和预后不良组,预后良好组72例,预后不良组30例。比较两组患者性别、身体质量指数(BMI)、高血压等一般临床资料,比较两组入院时肌钙蛋白(c Tnl)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平以及治疗前后血清lncRNA p21表达情况,分析血清lncRNA p21表达与患者预后的关系。结果预后良好组患者合并慢性阻塞性肺疾病(COPD)、早发冠心病、合并自身免疫疾病百分比低于预后不良组,差异有统计学意义(P<0.05)。预后良好组入院时cTnl、CK-MB水平均低于预后不良组,差异有统计学意义(P<0.05)。治疗前预后良好组lncRNA p21表达水平高于预后不良组,治疗后两组lncRNA p21表达水平升高且预后良好组高于预后不良组,差异有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析结果显示:高水平lncRNA p21与糖酵解酶的比值(lncRNA p21/GAPDH)表达是PCI治疗急性心肌梗死患者预后的保护因素,预后>60岁、合并COPD、早发冠心病、合并自身免疫疾病以及高水平CK-MB是PCI治疗急性心肌梗死患者预后的危险因素(P<0.05)。结论LncRNA-p21低表达可以加重心肌细胞及内皮细胞受损程度,内皮细胞损伤可能加重冠脉狭窄,不利于急性心肌梗死患者预后,血清高水平lncRNA p21表达水平是PCI治疗急性心肌梗死预后的保护因素。

miR-21-5p对川崎病内皮细胞焦亡的作用及其机制研究

目的探究miR-21-5p对川崎病(KD)内皮细胞焦亡的作用及其机制。方法采用随机数字表法将16只C57BL/6小鼠分为KD组和PBS组,每组8只。利用干酪乳杆菌细胞壁提取物(LCWE)腹腔注射小鼠,构建KD模型。利用LCWE处理小鼠冠状动脉内皮细胞(MCAECs),构建KD体外细胞模型。在使用LCWE处理的基础上,根据转染miR-21-5p抑制剂(miR-21-5p inhibitor)或inhibitor阴性对照物(inhibitor-NC)、miR-21-5p模拟物(miR-21-5p mimics)或mimics阴性对照物(miR-NC)、用或不用含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)抑制剂MCC950,将MCAECs分组为:(1)LCWE组和对照组;(2)LCWE+inhibitor-NC组和LCWE+miR-21-5p inhibitor组;(3)LCWE组、LCWE+MCC950组、LCWE+MCC950+miR-NC组和LCWE+MCC950+miR-21-5p mimics组。采用HE染色观察小鼠冠状动脉组织病理学变化;采用qRT-PCR法检测miR-21-5p表达变化;采用Western blot检测焦亡相关蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1)、caspase-1前体(pro-caspase-1)、消皮素D蛋白(GSDMD)p30、IL-1β、IL-18的蛋白表达;采用细胞计数盒法检测细胞活力;采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH活性。结果与PBS组相比,KD组小鼠冠状动脉组织病变明显,冠状动脉组织中NLRP3介导的细胞焦亡、miR-21-5p表达水平均升高(均P<0.01)。与对照组相比,LCWE组MCAECs细胞活力明显降低并且miR-21-5p表达水平明显升高(均P<0.01)。与LCWE+inhibitor-NC组相比,LCWE+miR-21-5p inhibitor组细胞miR-21-5p表达水平、NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD p30、IL-1β、IL-18的蛋白表达以及LDH活性均明显降低(均P<0.01),而细胞活力明显升高(P<0.05)。与LCWE组相比,LCWE+MCC950组NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD p30、IL-1β、IL-18的蛋白表达以及LDH活性均明显降低(均P<0.01),且细胞活力明显升高(P<0.01),而进一步转染miR-21-5p mimics明显逆转了以上变化(均P<0.01)。结论在KD中,miR-21-5p通过激活NLRP3炎症小体调节血管内皮细胞焦亡,从而加剧血管内皮细胞损伤。提示抑制miR-21-5p可以部分改善KD期间的血管内皮细胞损伤,miR-21-5p可以作为治疗KD的潜在干预靶点。