BVDV与BRV二温式多重PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛轮状病毒(BRV)的保守基因设计了两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为2个温度梯度,建立了用于同时检测BVDV和BRV的二温式多重PCR方法,扩增长度分别为244和385 bp。特异性试验和敏感性试验结果表明,该方法只对BVDV和BRV模板进行扩增,而对其他对照病毒的检测均为阴性;检测灵敏度高,最低能检测到BVDV和RBV各1 pg病毒RNA。建立的BVDV和BRV二温式多重PCR方法,是一种快速、特异、敏感的检测方法。

新生牛小肠粘膜细胞轮状病毒受体的研制Ⅱ、抗BRV受体McAb对MA104细胞的保护试验

在生长成单层的MA104细胞中加入抗BRV受体McAb,及用抗-BRV中和后的抗BRV受体McAb,37℃作用1小时,再感染BRV。结果表明抗BRV受体McAb既能保护MA104细胞不受BRV的感染,又能代替BRV和抗-BRV发生抗原抗体的特异性结合反应。同时表明我室建立的筛选杂交瘤细胞的ELISA法的可靠性。

BVDV、BRV和BCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛轮状病毒(BRV)和牛冠状病毒(BCoV)的快速检测方法,根据GenBank中登录的BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因序列设计特异性引物和探针,通过优化反应体系和条件,建立了同时检测上述3种病毒的TaqMan三重RT-qPCR方法。该方法仅对BVDV 5'-UTR、BRV NSP5和BCoV N基因扩增呈阳性,而对牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒、魏氏梭菌(A型、B型和D型)、多杀性巴氏杆菌(A型和B型)等犊牛腹泻相关病原扩增均呈阴性;最低检出限为10拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。利用本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法对29份临床样品进行检测,获得BVDV、BRV、BCoV的4种混合感染型,其中BVDV与BCoV的混合感染率最高(27.6%);与已有单重RT-qPCR方法比较,发现两种方法检测BVDV、BRV和BCoV的符合率分别为100%、96.5%、100%。结果表明,本研究建立的TaqMan三重RT-qPCR方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、可行性高等优点,可为今后BVDV、BRV和BCoV共感染引起的牛腹泻性疾病的鉴别诊断和流行病学调查提供新技术手段。

Reliability Based Optimization of Composite Laminates for Frequency Constraint

The reliability based optimization （RBO） issue of composite laminates trader fundamental frequency constraint is studied. Considering the tmcertainties of material properties, the frequency constraint reliability of the structure is evaluated by the combination of response surface method （RSM） and finite element method. An optimization algorithm is developed based on the mechanism of laminate frequency characteristics, to optimize the laminate in terms of the ply amount and orientation angles. Numerical examples of composite laminates and cylindrical shell illustrate the advantages of the present optimization algorithm on the efficiency and applicability respects. The optimal solutions of RBO are obviously different from the deterministic optimization results, and the necessity of considering material property uncertainties in the composite structural frequency constraint optimization is revealed.

北京地区规模化奶牛场三种病毒性腹泻病的血清学调查

为了解近年北京地区奶牛腹泻性疾病的流行情况,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对北京地区密云、怀柔和昌平3个区县的未免疫接种牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV)和牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)疫苗的31个规模化奶牛场的1 650份血清样品进行了BVDV、BCV、BRV感染抗体检测。结果显示,BVDV抗体平均阳性率为48.2%,BCV抗体平均阳性率为57.2%,BRV抗体平均阳性率为52.2%,BVDV、BCV及BRV感染在密云、怀柔和昌平3个区县的牛群中普遍存在,需进一步加强奶牛腹泻性疾病的综合防控。

新生牛小肠粘膜细胞轮状病毒受体的研制——Ⅰ.新生牛肠粘膜轮状病毒受体抗体的制备

利用新生牛小肠粘膜细胞为抗原,免疫纯系 Balb/C 鼠。获得鼠抗牛小肠粘膜细胞血清。用提纯的抗 BRV-IgG,建立 ELISA 方法,用以检测以上抗血清。结果表明,抗血清中含有抗 BRV 受体抗体,这种抗体可以在体外模拟 BRV 和兔抗 BRV-IgC 发生特异性结合。该方法可用于抗 BRV 受体单克隆抗体的筛选。

牛轮状病毒TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测方法的建立

本研究按照牛轮状病毒（BRV）结构蛋白VP6基因序列,设计合成引物和探针,经各反应条件的优化,建立了BRVTaqMan实时荧光定量RT-PCR技术。对BRV进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明,TaqMan实时荧光RT-PCR最低可检测到100个拷贝病毒RNA;与牛病毒性腹泻病毒（BVD）、猪瘟病毒（CSFV）、牛结核杆菌（MB）和牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）不发生交叉反应;所制作的标准曲线在102~109拷贝/μL浓度范围内有极好的线性关系且线性范围宽,相关系数为0.997;与常规的RT-PCR相比,该方法具有快速、特异、敏感、重复性好、可同时检测大量样品等优点。可对样品中微量BRV进行准确检测,对BRV的诊断有重要意义。

2017-2018年山东省奶牛场犊牛腹泻相关病毒病原学检测

为了解山东省奶牛养殖场中引起犊牛腹泻相关病毒的流行情况,2017-2018年,在全省13个地区51家规模化奶牛养殖场,采集624份犊牛腹泻病料样品,进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、牛冠状病毒(BCo V)和牛轮状病毒(BRV)PCR检测,并对检测结果采用SPSS 20.0软件进行数据统计以及显著性差异分析(Pearson卡方检验)。结果显示:BVDV、BEV、BCo V、BRV个体检出率分别为34.58%、11.78%、8.84%、17.70%,群体检出率分别为47.83%、38.89%、35.71%、33.33%,BVDV检出率显著高于其他3种病毒(P<0.01),且有流行加重趋势;鲁西北、鲁中、鲁西南、半岛地区4种病毒的检出率有差异,其中鲁中地区的BVDV检出率明显高于其他地区(P<0.01)。结果表明,BVDV、BEV、BCo V、BRV 4种病原在山东省奶牛场中流行广泛,以BVDV流行最为严重,尤其是鲁中地区,且有流行加重趋势,成为导致奶牛场犊牛腹泻的主要病毒性因素,建议有针对性地开展防控与净化。本检测初步摸清了山东省不同地区引起奶牛犊牛腹泻相关病毒的感染情况,可为山东省制定奶牛腹泻病综合防控措施提供数据支撑。

河北省唐山市奶犊牛病毒性腹泻流行病学调查

试验旨在掌握河北省唐山市13个县(市、区)奶牛场奶犊牛病毒性腹泻病原的流行状况,有效防控奶犊牛腹泻。采集唐山市不同地区38个奶牛场腹泻犊牛粪便样品788份,提取腹泻粪便样品中的基因组RNA。根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)E2基因、牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)VP6基因、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCV)N基因序列,利用Primer Premier 5.0软件分别设计特异性引物,采用PCR方法检测粪便样品中这3种基因,利用Excel 2007对不同地区、不同季节和混合感染病原检测结果进行汇总分析。在采样范围内的788份犊牛腹泻粪便样品中,BVDV、BRV和BCV阳性检出率分别为29.82%(235/788)、29.44%(232/788)和18.02%(142/788);在所有被检地区,滦南县BVDV感染率最高,阳性检出率为45.38%(59/130),汉沽区BRV和BCV感染率最高,阳性检出率分别为55.00%(22/40)和37.50%(15/40);从采样季节来看,春季、夏季和秋季BRV感染率最高,阳性检出率分别为27.71%(46/166)、39.58%(114/288)和19.89%(39/196),冬季则以BVDV感染为主,阳性检出率为52.17%(72/138);从混合感染情况来看,以BRV+BCV二重混合感染为主,感染率为8.37%(66/788)。河北省唐山市各地区腹泻犊牛群中均存在BVDV、BRV和BCV感染,以BVDV、BRV单一感染为主。

牛轮状病毒RT-LAMP检测方法的建立

建立一种适用于牛轮状病毒(BRV)的反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)的快速检测方法。根据GenBank中登录的BRV VP7基因序列,针对其保守区设计了4条引物,利用RT-LAMP方法进行检测,并优化了反应体系与反应时间,检测了该方法的特异性和灵敏度。结果表明,该方法在等温条件下只需要50min就能检测出结果,与普通RT-PCR相比,具有较短的检测时间、良好的特异性和较高的灵敏度。论文针对BRV建立的RT-LAMP快速检测方法操作简便、无需昂贵设备、结果可视,适用于BRV在基层的快速检测。

牛轮状病毒抗原捕获ELISA方法的建立与应用

为建立牛轮状病毒(BRV)抗原检测方法,本研究以BRV VP6蛋白的多克隆抗体为捕获抗体、VP7蛋白的G6/G10共享型单克隆抗体(MAb)为检测抗体,建立了BRV抗原捕获ELISA方法。特异性试验结果显示,该ELISA方法与牛肠道病毒、牛呼肠孤病毒、牛细小病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒以及阿卡斑病毒无交叉反应。敏感性试验结果显示,本研究建立的ELISA方法最低可以检出10^(4.2) TCID_(50)病毒,而商品化ELISA试剂盒和RT-PCR方法的最低检出限分别为10^(4.86) TCID_(50)和10^(3.36) TCID_(50)病毒。该方法组内和组间的变异系数均小于10%,表明重复性良好。应用该ELISA方法对67份牛腹泻粪便样品进行检测,结果显示BRV阳性率为18%,与商品化试剂盒和RT-PCR方法的符合率均为100%。本研究建立的抗原捕获ELISA方法可以用于BRV的规模化检测,为BRV的病原流行病学调查研究提供了有效的技术手段。

抗牛轮状病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

以从黑龙江省腹泻犊牛粪便中分离的牛轮状病毒(bovine rotavirus)为抗原,免疫6～8周龄BALB/_c小鼠,取血清抗体阳性小鼠的脾细胞与SP_(2/0)骨髓瘤细胞融合。用ELISA间接法检测抗体,通过有限稀释法,克隆出一株分泌抗牛轮状病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经鉴定,此杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为IgM,轻链为K链。通过连续传代证明,此杂交瘤细胞株具有稳定分泌单克隆抗体的性质。杂交瘤细胞诱生BALB/_c小鼠腹水的单克隆抗体滴度可达1:10000以上。

上海世博会美国馆与委内瑞拉馆的建声设计

详细介绍了上海世博会美国国家馆和委内瑞拉玻利瓦尔共和国国家馆的建筑特色、主场馆音质指标及建声设计技术措施。

牛轮状病毒NSP5基因SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立检测牛轮状病毒(BRV)快速特异的荧光定量RT-PCR方法,本研究针对BRV NSP5基因设计了一对特异性引物经PCR扩增目的片段,并克隆于pCI载体作为重组质粒标准品(pCI-NSP5),经优化反应条件,建立了基于NSP5基因的BRV荧光定量RT-PCR方法,并对其进行了特异性、敏感性及重复性试验。结果显示,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法最佳引物浓度为10μmol/L,模板为2μL,退火温度为58℃;特异性试验结果显示,该方法除对BRV的检测结果为阳性外,对牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对重组质粒标准品的最低检测限为12拷贝/μL,对BRV的最低检测限为1×102TCID50/反应;批内和批间重复性试验的变异系数均小于2%。利用该方法检测30份BRV接种犊牛的粪便样品,结果 25份呈阳性,而利用VP7基因的常规RT-PCR和病毒分离方法检出的阳性样品分别为20份和25份,表明本研究建立的检测方法的敏感性高于VP7基因的常规RT-PCR方法,而与病毒分离方法的符合率为100%。以上结果表明,本研究建立的BRV NSP5基因荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以用于BRV的快速检测、病原流行病学调查以及疫苗免疫攻毒试验的病毒载量定量等研究。

牛A群轮状病毒G10型XJ-2022株分离鉴定及基因型分析

【目的】试验旨在对新疆某规模牛场患腹泻疾病的犊牛进行病原学鉴定及基因型分析。【方法】采用抗原诊断试剂盒方法对在新疆某牛场随机采集的15份腹泻犊牛粪便样品进行检测,对抗原检测结果为阳性的样品进行反复冻融和过滤处理,然后将样品接种于Marc-145细胞进行病毒的分离和传代。对分离毒株进行间接免疫荧光试验(IFA)和负染电镜观察进一步确定病原。对分离株的VP6和VP7基因进行PCR扩增测序,并对其进行基因相似性比对和进化树分析。【结果】抗原诊断试剂盒结果显示,3份粪便样品呈牛轮状病毒(Bovine rotavirus, BRV)抗原阳性。将阳性粪便样品分别接种于Marc-145细胞,仅有1份样品连续盲传至第9代出现明显的细胞病变效应(CPE)。IFA结果显示,接种该分离株的Marc-145细胞有亮绿色荧光,对照组未见荧光。电镜观察可见约65 nm的圆形病毒粒子,并命名为XJ-2022株。经PCR扩增获得VP6和VP7基因的目的条带,长度分别为1 356和342 bp。基因相似性比对和遗传进化分析表明,VP6基因与人源A群轮状病毒参考株DB2015-066(LC367318.1)相似性最高且遗传进化亲缘关系最近;VP7基因与牛源G10轮状病毒参考株XJX2(MN937506.1)相似性最高,遗传进化亲缘关系最近,确定该分离株为A群G10型轮状病毒。【结论】试验成功分离到基因型为A群G10型BRV XJ-2022株,该毒株为新疆地区首次发现的多宿主来源的基因重配病毒。

重庆肉牛腹泻相关病毒的检测及遗传进化分析

为了解重庆市肉牛病毒性腹泻的病原流行情况,本研究对重庆市8个肉牛养殖场的81份腹泻粪便样本中牛病毒性腹泻—黏膜病病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、牛冠状病毒(bovine coronavirus,BCV)、牛轮状病毒(bovine rotavirus,BRV)和牛星状病毒(bovine astrovirus,BAstV)4种致腹泻病毒进行了RT-PCR检测,对PCR产物进行测序,用Mega 6.0软件进行系统发育分析。结果显示,BRV、BAstV和BVDV检出率分别为66.7%、8.6%和7.4%,BCV未检出。遗传进化分析结果表明,测序的5个BRV单独聚为一小支,与GenBank中其他VP6序列有明显的遗传距离;BVDV与中国株和丹麦株聚为一支,遗传关系最近;5个BAstV单独聚为一支,与中国香港株遗传关系最近,但仍有明显的遗传距离。本试验结果表明,重庆地区肉牛腹泻主要发生在6月龄以下犊牛,BRV是该地区肉牛腹泻的重要原因,BRV、BAstV和BVDV 3种病毒的遗传多样性值得进一步关注。

牛轮状病毒VP4、VP6、VP7基因分子生物学研究进展

轮状病毒是引起幼龄动物急性胃肠炎和腹泻的主要病因.犊牛感染轮转病毒会对集中饲养的牛群造成严重的经济损失,制约养牛产业的发展.轮状病毒的11个节段基因分别编码了6种结构蛋白(VP1-VP4,VP6,VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6),其中VP4和VP7与病毒的毒力密切相关,分别决定了病毒的P型和G型.VP6是病毒的特异性抗原,也是决定轮状病毒分组的重要蛋白.通过综述VP4、VP6、VP7的分子特征及研究进展,对目前开发的疫苗产品进行了简述.

卧式干法厌氧消化技术在秸秆发酵中的应用

厌氧发酵技术是秸秆类农业废弃物极好的资源化处置方式,为了避免大量的沼液产生,干式厌氧发酵越来越受到重视.本文介绍了BRV卧式干法厌氧消化技术,该技术从欧洲林德公司引进,属于卧式平推流干法反应器.结合国外干法和湿法的应用情况,分析了BRV干法厌氧技术特点及处理秸秆的适用性,可实现规模化,全自动控制、连续化生产,特别适合工厂化集中处理秸秆等农业废弃物,具有广阔的应用前景。

灯盏花素自微乳化释药系统的制备及特性研究

目的研究灯盏花素自微乳化释药系统的处方及特性。方法通过溶解度试验、处方配伍和伪三相图的绘制,筛选油相、表面活性剂、助表面活性剂的最佳搭配和配比。并对灯盏花素自微乳化释药系统的理化性质、体外溶出度和大鼠在体肠吸收情况进行了测定。结果灯盏花素自微乳化最终优化处方为:Maisine 35-1、Cremo-phor RH40、PEG400、TEA比例为25∶40∶35∶7。灯盏花素自微乳化释药系统的粒径为88.6 nm,在1 h时体外溶出率达到97.8%,约是灯盏花素原料药的8.0倍,是灯盏花素片剂的5.1倍。大鼠在体肠吸收灯盏花素自微乳化释药系统的肠壁通透系数分别是灯盏花素原料的3.4倍,灯盏花素片剂的3.3倍。结论所制备的灯盏花素自微乳化释药系统促进了灯盏花素的溶出和吸收,为灯盏花素的新制剂开发提供了实验依据。

可视化多重荧光LAMP鉴别诊断牛轮状病毒和产肠毒素性大肠杆菌的研究

本研究旨在建立一种同时检测牛轮状病毒(BRV)和产肠毒大肠杆菌(ETEC)的多重荧光LAMP检测方法。根据GenBank中BRV和ETEC的基因保守区域设计3套LAMP引物,在每条内引物FIP的5’端标记荧光基团,在同一体系中进行多重LAMP扩增,对各反应条件进行优化,应用该方法对采集自广西各地牛场的56份样品进行检测。结果显示,该方法能特异地鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌,并与其他对照病原不发生交叉反应;每个反应的检测灵敏度均为100拷贝。对56份腹泻样品的检测结果显示,BRV的感染率为14.3%,ETEC的感染率为57.1%,2种病原的混合感染率为8.9%;与荧光PCR和常规PCR检测方法相比,此多重LAMP方法敏感性为100%,符合率为100%。建立的方法可快速、准确地检测2种犊牛腹泻病原体,为病原学诊断和分子流行病学调查提供了有效技术支持。