CDC42基因的激活和抑制对烟曲霉极性生长影响的初步探究

目的构建烟曲霉CDC42基因显性激活性(dominant active,DA)和显性抑制性(dominant negative,DN)点突变菌株,初步了解这两种点突变对烟曲霉极性生长以及RAC1基因表达的影响。方法运用分子生物学方法构建CDC42基因激活性(CDC42^(G14V))和抑制性(CDC42^(T19N))菌株;光学显微镜观察点突变菌落特征;RT-PCR方法检测Ku80、DA Cdc42和DN Cdc42菌株中RAC1的表达量。结果成功构建烟曲霉CDC42显性激活性(DA)和显性抑制性(DN)点突变菌株并经测序确认;烟曲霉DA Cdc42和DN Cdc42菌株的菌落生长直径、形成分生孢子数和各时间点孢子发芽率较对照株Ku80都明显降低,且差异均有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果表明DA Cdc42和DN Cdc42菌株中的RAC1的表达量均较对照株Ku80有所上升(P<0.05)。结论CDC42的激活和抑制都会对烟曲霉的极性生长产生负面影响;且会影响RAC1基因的表达。

Cdc42在舌鳞状细胞癌中的表达及其对细胞增殖、迁移、侵袭的影响

目的:观察细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)在舌鳞癌中的表达及与临床病理特征和预后的关系,探讨体外沉默Cdc42基因对舌鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭及上皮-间质转化(EMT)的影响及作用机制。方法:通过免疫组织化学法检测Cdc42基因在舌鳞癌及癌旁组织中的表达,分析Cdc42表达与舌鳞癌临床病理学参数的相关性及对预后的影响。将人舌鳞状细胞癌CAL27和SCC-4细胞随机分为3组,分别为Cdc42-siRNA组、阴性对照组和空白对照组。设计并构建针对人Cdc42基因序列的3条小干扰RNA(siRNA),应用脂质体介导转染方法分别将Cdc42-siRNA和NCsiRNA转染至Cdc42-siRNA组和阴性对照组,空白对照组仅加入转染试剂。通过实时荧光定量反转录PCR(qRTPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测各组细胞Cdc42的mRNA及蛋白表达,将沉默效率最高的Cdc42-siRNA转染组作为后续实验组。Western blot检测EMT及MAPK JNK/p38通路相关蛋白的表达,CCK-8、细胞划痕实验和Transwell侵袭实验分别检测各组细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果:Cdc42在44例舌鳞癌患者中的阳性表达率为70.5%(31/44),在癌旁组织中的阳性率为38.6%(17/44),差异具有统计学意义(P<0.05)。Cdc42表达与不同颈淋巴结转移、临床分期、浸润深度相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,Cdc42阳性表达的舌鳞癌患者预后与阴性表达患者无显著差异(P>0.05)。体外实验中,Cdc42-siRNA组细胞Cdc42 mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05),EMT相关蛋白间叶标志物N-cadherin、Vimentin表达显著降低(P<0.05),MMP-9表达显著降低(P<0.05),而上皮标记物E-cadherin相对表达量显著增加(P<0.05);MAPK JNK/p38通路相关蛋白p38-MAPK和JNK蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05),而p-p38-MAPK、p-JNK蛋白表达水平显著下降(P<0.05),Cdc42-siRNA组细胞增殖、侵袭和迁移能力显著下降(P<0.05)。结论:舌鳞癌患者中Cdc42表达增加,并且其表达与颈淋巴结转移、临床分期及浸润深度相关。沉默Cdc42可能通过阻断MAPK JNK/p38通路抑制舌鳞癌细胞EMT过程,进而抑制侵袭迁移,同时可负向调节舌鳞癌细胞增殖。

CDC42基因在成人和脐带血网织红细胞中差异表达的潜在价值

目的 本研究旨在通过分析GSE6236、GSE17639和GSE35102数据集的转录组数据,探索血红蛋白转换过程中的关键调控基因。方法 从GEO数据库下载3个数据集的mRNA表达谱并使用AnnoProbe包进行基因注释。Limma包的removeBatchEffect函数用于去除批次效应。加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)用于探索网织红细胞的最相关模块基因。受试者曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)用以评估差异基因区分脐带血和成人外周血网织红细胞的价值。GSE35102数据集用于验证差异基因在血红蛋白转变过程中的表达量变化。最后,实时荧光定量PCR用于验证差异基因在脐带血和成人外周血网织红细胞中的表达。结果 12个基因在脐带血和成人外周血的网织红细胞中呈现差异性表达(|logFC|≥1.5,P<0.05)。WGCNA分析发现蓝色模块的基因与网织红细胞相关性最强(相关系数=0.76,P<0.001)。二者重叠的5个基因中只有CDC42在合并的数据集中呈现差异性表达(t=3.776,P<0.001),且能较好的区分脐带血和成人外周血中的网织红细胞。CDC42基因表达量在血红蛋白转变过程中变化显著(Z=-2.908,P<0.01)。与脐带血中的网织红细胞相比,成人网织红细胞中CDC42基因的表达量显著降低(t=7.824,P<0.001)。结论 CDC42基因参与网织红细胞的血红蛋白转换,可作为镰状细胞病的潜在治疗靶点。

CHI3L1、Cdc42在胃癌组织中的表达及临床意义

目的 研究壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)、Cdc42蛋白(Cdc42)在胃癌组织中的表达及临床意义。方法 选取80例原发性胃癌患者的研究对象,患者均未接受放疗或化疗,手术提取患者胃癌组织及癌旁5 cm处正常组织,进行相应实验室检测,比较CHI3L1、Cdc42在胃癌组织及癌旁组织中的表达差异,对胃癌患者性别、年龄、肿瘤部位、直径、浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期等临床病理参数进行比较,分析CHI3L1、Cdc42的阳性表达与其临床病理参数的关系,分析CHI3L1、Cdc42在胃癌组织中的表达及临床意义。结果 CHI3L1、Cdc42在胃癌及癌旁组织中均有阳性表达,胃癌组织中CHI3L1、Cdc42的阳性表达率显著高于癌旁组织(P<0.05)。CHI3L1的阳性表达与胃癌患者肿瘤浸润深度、淋巴结转移呈正相关(P<0.05);Cdc42的阳性表达与胃癌患者肿瘤浸润深度、淋巴结转移、肿瘤分期呈正相关(P<0.05)。结论 CHI3L1、Cdc42在胃癌组织中不同程度的表达与胃癌的发生、发展关系密切,胃癌浸润深度、淋巴结转移越严重,CHI3L1、Cdc42阳性表达越高,临床可根据CHI3L1、Cdc42在胃癌组织中的阳性表达,为胃癌诊断、治疗及预后提供有利依据。

非小细胞肺癌组织中p120^(ctn)与RhoA和Cdc42表达的相关性及意义

背景与目的p120ctn可以通过改变RhoGTP酶的状态进而调节细胞的黏附和肿瘤的转移。本研究通过观察p120ctn与RhoGTP酶中RhoA、Cdc42在非小细胞肺癌中的表达及其对临床病理特征的影响,为探索p120ctn在肿瘤中的生物学功能提供依据。方法采用S-P免疫组化法检测124例非小细胞肺癌标本中p120ctn、RhoA和Cdc42的表达。结果正常支气管粘膜细胞p120ctn为细胞膜强阳性表达,在非小细胞肺癌出现胞膜表达减弱和胞浆表达等异常表达,其异常表达率为79.8%(99/124),异常表达与组织类型无明显关系,与肿瘤细胞的分化、TNM分期和淋巴结转移有明显关系(P<0.05)。RhoA和Cdc42在正常支气管粘膜中均正常表达,在癌组织中表达明显增强(62.9%,78/124;56.5%,70/124)。RhoA、Cdc42在非小细胞肺癌中的表达增强与临床病理特征无明显关系。非小细胞肺癌中p120ctn的异常表达与RhoA和Cdc42的表达增强有较好的一致性和相关性(Kappa=0.523,P<0.001;Kappa=0.493,P<0.001)。结论p120ctn的异常表达可能是导致RhoA和Cdc42表达增强的重要因素。

哈萨克族食管癌中cdc42启动子区CpG岛及全基因共构建真核表达载体

目的构建cdc42基因启动子区CpG岛及全基因共构建真核表达载体,研究cdc42基因启动子区的甲基化状态对该基因表达及功能的影响。方法采用PCR方法从新疆哈萨克族食管癌的cDNA表达阳性的标本中扩增出cdc42基因,以阳性组织基因组DNA扩增出cdc42基因启动子区CpG岛,cdc42基因经双酶切后与真核表达载体pEGFP-N1相连,并转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌E.coliER1793中扩增。经测序成功后,将重组质粒及cdc42基因启动子区CpG岛用HindⅢ酶切,连接后再次转入E.coliER1793中扩增。将重组质粒转染至食管癌细胞株Eca-109中,荧光显微镜观察结果。结果 DNA测序证明获得了包含ORF全长的cdc42基因及其启动子区CpG岛,并将双序列成功克隆入真核表达载体pEGFP-N1中。转染后荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白。结论成功构建真核表达载体,为进一步探讨cdc42基因启动子区CpG岛甲基化状态对该基因在哈萨克族食管癌细胞株中的表达及功能的影响奠定了基础。

透骨消痛胶囊对凋亡软骨细胞Rac1和Cdc42表达的影响

背景:透骨消痛胶囊治疗早、中期骨性关节炎有较好疗效,但作用机制尚未完全阐明。小GTP酶Rho能够抑制软骨细胞肥大分化,促进软骨细胞的凋亡。目的:观察透骨消痛胶囊对体外培养凋亡大鼠关节软骨细胞Rac1和Cdc42的影响,并初步探讨其防治骨性关节炎的作用机制。方法:采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立稳定的软骨细胞体外培养体系,采用甲苯胺蓝染色法对第3代软骨细胞进行鉴定。用20μg/L的肿瘤坏死因子α诱导体外培养软骨细胞的凋亡,诱导成功后,给予透骨消痛胶囊(500,100,20 mg/L)孵育24 h后,分别用MTT法检测各组软骨细胞的存活率,用流式细胞仪检测各组软骨细胞的线粒体膜电位情况,Western Blot检测各组软骨细胞Rac1,Cdc42,Bcl-2及Bax蛋白表达。结果与结论:透骨消痛胶囊能够减少肿瘤坏死因子α所致的软骨细胞凋亡,提高线粒体膜电位,提高细胞的存活率,同时能够下调Rac1,Cdc42,Bax蛋白的表达,上调Bcl-2蛋白表达,差异均有显著性意义(P<0.05)。提示透骨消痛胶囊可能通过下调Rac1,Cdc42和Bax蛋白表达,增加凋亡抑制基因Bcl-2蛋白表达,从而抑制软骨细胞的凋亡,而起到治疗骨性关节炎的疗效。

miR-206抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞Cdc42蛋白表达及其对细胞骨架的影响

目的探讨miR-206对MDA-MB-231乳腺癌细胞Cdc42表达的调控及对细胞骨架的影响。方法采用Li-pofectamineTM2000转染miR-206进入MDA-MB-231细胞,48h后Western blot检测转染后乳腺癌细胞Cdc42、MMP-2和MMP-9蛋白质表达。用免疫荧光显微镜观察细胞丝状伪足的改变,进一步用侵袭迁移实验检测转染前后细胞侵袭力和迁移力的变化。结果Western blot检测Cdc42、MMP-2和MMP-9在转染前后的表达结果,其条带灰度值与阴性对照组相比明显下降(P<0.05);细胞免疫荧光计数每个细胞平均丝状伪足数,空白对照组为(14.99±5.53),表皮生长因子(EGF)组为(23.59±3.92),miR-206转染组为(9.45±3.59),miR-206+EGF组为(11.77±2.85)。与空白对照组和EGF组比较,miR-206转染组或miR-206+EGF组细胞丝状伪足明显减少(P<0.05)。侵袭实验结果显示,小室膜下的细胞数量空白对照组为(311.7±23.5),miR-206转染组为(65.0±13.9),二者差异有统计学意义(P<0.01)。迁移实验结果显示,小室膜下的细胞数量空白对照组为(793.0±76.3),而miR-206转染组为(415.3±20.0),二者差异有统计学意义(P<0.01)。结论miR-206能抑制MDA-MB-231细胞Cdc42的表达和细胞丝状伪足的形成,并且能抑制细胞的侵袭迁移能力。

慢性脑缺血大鼠海马区Cdc42表达及其与认知功能障碍的相关性

目的研究慢性脑缺血大鼠海马组织中细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)表达的变化,探讨其在慢性脑缺血所致认知功能障碍中可能发挥的作用。方法大鼠40只,随机分为假手术组、持久性双侧颈总动脉结扎(2VO)8、10、12 w组,每组各10只。应用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力,用免疫组织化学及Western印迹两种方法检测各组大鼠海马区Cdc42的表达。结果 Morris水迷宫显示手术组大鼠较假手术组大鼠逃避潜伏期明显延长(P<0.05);免疫组化及Western印迹均显示手术组大鼠海马区Cdc42表达明显低于假手术组(P<0.05)。结论 Cdc42表达量的降低可能参与了慢性脑缺血所致认知功能障碍的形成。

细胞极性相关蛋白CDC42和PAR3在小鼠牙胚发育过程中的表达

目的:研究细胞极性相关蛋白CDC42和PAR3在小鼠牙胚发育过程中的表达,探讨其在牙胚发育中的可能作用。方法:取13.5、14.5、16.5和18.5d(E13.5、E14.5、E16.5和E18.5)的小鼠胚胎以及出生后1和5d(PN1和PN5)的小鼠,分离头部,固定、脱钙、脱水、石蜡包埋、切片,HE染色观察牙胚的组织形态表现,采用免疫组织化学染色方法观察CDC42及PAR3在牙胚发育过程中的表达。结果:HE染色观察,E13.5~E18.5分别为小鼠牙胚发育的蕾状期、帽状期、钟状早期和钟状晚期,PN1小鼠的牙胚中可见分化成熟的成牙本质细胞和成釉细胞,PN5小鼠牙胚可见牙冠部发育完成。免疫组织化学染色,CDC42在E13.5、E14.5和E16.5小鼠牙胚中有广泛表达,在E18.5小鼠牙胚中表达较E13.5、E14.5和E16.5减少,在PN1和PN5小鼠牙胚中主要表达于成牙本质细胞和成釉细胞的分泌端;PAR3弱表达于E13.5和E14.5小鼠牙胚,在E16.5和E18.5小鼠牙胚上皮处表达明显增强,在PN1和PN5小鼠牙胚中表达较E18.5减弱。结论:CDC42和PAR3参与小鼠牙发育的过程,在牙胚发育早期可能参与小鼠牙胚的增殖及迁移,在牙胚发育晚期可能参与了成牙本质细胞和成釉细胞的分化,尤其在成牙本质细胞和成釉细胞极性的形成与维持中可能具有重要作用。

稻瘟菌Cdc42若干推测互作蛋白的结构和表达特点

目的已有研究表明稻瘟菌Cdc42(MgCdc42)与酵母Cdc42(ScCdc42)高度同源,参与调控其形态分化和侵染过程,通过分析可能的MgCdc42互作蛋白,以明确这些蛋白结构和功能。方法用ScCdc42互作蛋白经BLAST搜索获得了稻瘟菌基因组中的相应同源物,分析了这些同源物的结构,并通过半定量RT-PCR分析MgCdc42不同突变情况下这些可能的调控蛋白及效应蛋白的表达情况。结果MgCdc42正显性突变后,导致所有推测互作蛋白表达量均有所提高;MgCdc42负显性突变,除MgBem1、Chm1、MgGic1表达量未见明显变化外,其余表达量均有所降低;当MgCdc42失活后,所有可能的MgCdc42调控蛋白及效应蛋白之表达量均有所降低。结论稻瘟菌可能存在酵母Cdc42相似的信号途径,MgCdc42在其中起着重要的调控作用。

Rac1和Cdc42在鼻咽癌组织中的表达及预后相关性研究

目的观察鼻咽癌组织中Rac1和Cdc42的表达,探讨Rac1和Cdc42细胞信号分子可能参与鼻咽癌侵袭转移过程的机制。方法采用免疫组织化学S-P法检测鼻咽癌标本肿瘤组织与鼻咽正常上皮组织中Rac1和Cdc42的表达,并探讨其表达与临床指标的关系,以及标志物之间的相互关系及其在鼻咽癌侵袭转移中的作用,分析Racl和Cdc42各分子表达情况与鼻咽癌患者预后的关系。结果 (1)鼻咽正常上皮组织Rac1和Cdc42表达显著低于鼻咽癌组,两者差异有统计学意义(P<0.05)。(2)Rac1和Cdc42与患者的年龄、性别以及肿瘤原发部位和大小均无关(P>0.05),而在分化程度浸润深度和TNM分期等临床病理指标之间的差异比较则显示统计学意义显著(P<0.05)。(3)通过相关分析,Rac1和Cdc42之间为正相关。(4)Rac1的低表达组5年总生存率和无瘤生存率明显高于高表达组,其差异具有统计学意义(P<0.05)。Cdc42的低表达组和高表达组5年总生存率和无瘤生存率的差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Racl和Cdc42在鼻咽癌的恶性表型及侵袭和转移中起促进作用,他们的表达同TNM分期呈正相关,Racl的表达水平可以作为鼻咽癌患者预后判断的生物学指标。

血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠与非基因敲除小鼠在急性肺损伤肺组织病理改变以及肺微血管通透性变化的比较

目的比较血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠与非基因敲除小鼠在急性肺损伤肺组织病理改变和肺微血管通透性变化的差异。方法 cdc42flox/flox小鼠与血管内皮细胞特异性表达cre重组酶的小鼠杂交,取其基因型为cdc42flox/+Cre+/-的子代小鼠与cdc42flox/flox小鼠回交,得到基因型分别为Cdc42flox/+Cre+/-、Cdc42flox/+Cre-/-、Cdc42flox/floxCre-/-的小鼠,其中Cdc42flox/+Cre+/-为血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠,其余两种同一窝出生的非基因敲除小鼠作为对照组,在各组小鼠气道内滴入LPS,制成急性肺损伤模型,比较各组小鼠在肺组织病理改变、病理评分、肺湿干重比值、肺微血管通透系数等指标变化的差异。结果血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因的杂合子小鼠急性肺损伤模型在肺组织病理改变、病理评分、肺湿干重比值、肺微血管通透系数等方面与对照组小鼠比较无明显统计学差异。结论血管内皮细胞特异性敲除cdc42基因杂合子小鼠与非基因敲除小鼠比较,在急性肺损伤中肺组织病理改变和肺微血管通透性的变化无明显差异。

利用Cre/loxp技术构建血管内敲除cdc42基因杂合子小鼠

目的:利用Cre/loxp条件性基因敲除技术构建血管内敲除cdc42基因杂合子小鼠,并进行鉴定,为进一步在整体动物水平研究cdc42在维持微血管屏障中的作用提供研究平台。方法:将引进的cdc42flox/flox小鼠和血管内皮细胞特异性表达Cre重组酶的小鼠分别进行繁殖和鉴定,然后两种小鼠进行杂交,并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Cdc42flox/+Cre+的小鼠即为本实验所构建的血管内敲除/-cdc42基因杂合子小鼠。结果:从引进这两种小鼠开始繁殖5个月,共繁殖cdc42flox/flox小鼠40只,取其21只进行鉴定,均为cdc42flox纯合的子小鼠。血管内皮细胞特异性表达Cre重组酶的小鼠和野生型C57小鼠杂交后繁殖,共得到子代小鼠36只,其中表达Cre重组酶的小鼠17只,基因型为cdc42flox/flox与表达Cre重组酶的杂合子小鼠杂交并繁殖,得到基因型为Cdc42flox/+Cre+的小鼠10只,基因型为Cdc42/-flox/+Cre-13只。这/-两种基因型小鼠其身高、体重无明显差异。结论:本研究利用Cre/loxp技术成功构建了血管内敲除cdc42基因杂合子小鼠,为进一步构建血管内敲除cdc42基因小鼠奠定基础,为在整体动物水平研究cdc42在维持微血管屏障中的作用提供研究平台。

δ-catenin与Cdc42在非小细胞肺癌中表达的相关性

背景与目的:δ-catenin是p120 catenin亚家族中的成员,可与细胞膜上的E-cadherin直接结合,形成E-cadherin/catenin复合体。δ-catenin还可以通过调节Cdc42(Small GTP酶)活性以影响细胞骨架装配。该研究检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中δ-catenin及Cdc42的表达情况并探讨了二者表达的相关性。方法:采用免疫组织化学方法检测122例NSCLC标本中δ-catenin与Cdc42的表达。采用蛋白[质]印迹法(Western blot)及逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法检测肺癌组织中δ-catenin及Cdc42的蛋白及m RNA表达情况。在肺癌细胞系中,分别上调或干扰δ-catenin的表达后,利用G-LISA及Transwell小室法检测Cdc42活性以及肺癌细胞侵袭能力的改变。结果:δ-catenin和Cdc42在肺癌组织中其蛋白及m RNA表达明显高于正常肺组织。而在122例NSCLC病例中,δ-catenin阳性表达率为65.57%(80/122),Cdc42过表达率为68.03%(83/122)。δ-catenin阳性表达和Cdc42的过表达具有较好的相关性(P<0.001)。δ-catenin和Cdc42的协同表达与肺癌的高临床分期、低分化、病理类型为腺癌和淋巴结转移相关(P<0.05),并且与肺癌患者的不良预后明显相关。在肺癌细胞系中通过调节δ-catenin表达,改变Cdc42的表达及活性,影响肺癌细胞的侵袭能力。结论:在肺癌组织中δ-catenin和Cdc42的表达具有相关性,而二者协同表达与患者不良预后相关。

海南黄牛Cdc42 cDNA的克隆、表达及鉴定

试验以构建的海南黄牛外周血白细胞cDNA文库为材料,采用菌落PCR的方法筛选出海南黄牛细胞分裂周期蛋白42(cell division cycle 42,Cdc42)全长cDNA,构建pET28a-Cdc42重组质粒,经IPTG诱导表达后,进行可溶性分析和蛋白纯化,并应用Western blotting对其进行鉴定。结果显示,海南黄牛Cdc42 cDNA的编码框由576个碱基组成,编码191个氨基酸,融合蛋白分子质量约为30 ku,该蛋白主要以包涵体形式存在;纯化后的蛋白经Western blotting检测,发现对应大小的特异性条带,表明本试验成功克隆Cdc42并表达。

Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达分布及对其成熟的影响

【目的】探明Cdc42蛋白在牛卵母细胞成熟过程中的表达及分布规律,并且研究抑制Cdc42活性对于牛卵母细胞成熟的影响。【方法】首先通过收集体外成熟不同时间(0—24 h)的牛卵母细胞,用Western blotting的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达量变化情况,通过免疫细胞化学的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的分布及定位情况。根据GenBank公布的牛Cdc42基因(GenBank登录号:NM_001046332.1)的mRNA序列设计引物,并在正向和反向引物的末端分别加上KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点,用PCR的方法扩增牛Cdc42基因的CDS区,将PCR产物和pMD19T载体连接得到野生型的克隆载体pMD19T-Cdc42WT。用定点突变引物以pMD19T-Cdc42WT为模板进行PCR反应,得到Cdc42的显性负性突变体Cdc42T17N的克隆载体pMD19T-Cdc42T17N。将pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N分别酶切后,将Cdc42WT(775 bp)和Cdc42T17N(775 bp)片段分别连接到pcDNA3.1(+)的多克隆位点区域,得到相应的原核表达载体pcDNA3.1(+)-Cdc42WT和pcDNA3.1(+)-Cdc42T17N。用体外转录的方法分别得到Cdc42WT和Cdc42T17N的cRNA,用显微注射的方法将相应的cRNA分别注入到牛GV期卵母细胞质内,检测其成熟率的变化。【结果】①Cdc42蛋白分别在牛卵母细胞中成熟培养0、4、8、12、16、20以及24 h时表达量没有明显差异,但是其分布规律随着减数分裂的进行发生着动态的变化:Cdc42蛋白在卵母细胞皮质区域集中分布的模式在生发泡(germinal vesicle,GV)期卵母细胞中很少出现,而在第一次减数分裂中期(metaphaseⅠ,MⅠ)卵母细胞中出现得最多也最为明显;Cdc42蛋白在染色体附近的皮质富集的现象开始出现于前中期(pro-metaphaseⅠ,pMⅠ),并且出现频率从pMⅠ期到第2次减数分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)逐渐增多;Cdc42蛋白和纺锤体重叠定位的现象在第1次减数分裂后期(anaphaseⅠ,AⅠ)到末期(telophaseⅠ,TⅠ)的卵母细胞中占有有很高比例,而到MⅡ期时这种现象又很少出现。②从牛卵母细胞的总cDNA中扩增Cdc42基因得到785 bp的片段,构建的牛Cdc42的野生型及其显性负性突变体的克隆载体pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N经酶切鉴定和以及测序比对后,符合预期结果,即成功克隆了牛野生型Cdc42基因并得到其显性负性突变体Cdc42T17N;③构建的相应的原核表达载体pcDNA3.1(+)-Cdc42WT和pcDNA3.1(+)-Cdc42T17N经酶切鉴定和测序比对,符合预期结果,经过体外转录均得到一个3079 bases和987 bases的RNA片段,符合预期结果,即成功构建了相应的原核表达载体并获得相应的cRNA;④与正常成熟培养组和注射Cdc42WTcRNA的牛卵母细胞相比,注射Cdc42T17NcRNA的成熟率显著降低(P<0.05)。【结论】卵母细胞在卵泡发育过程中就已经积累了足够的Cdc42蛋白,而在减数分裂过程中Cdc42可以在卵母细胞的皮质以及纺锤体的位置发挥作用,而且正常的Cdc42活性是牛卵母细胞完成成熟过程并排出第一极体所必需的。

HK2通过Akt1/p-Akt1上调Cdc42表达促进宫颈癌细胞迁移和侵袭

目的:探究己糖激酶2(HK2)通过Akt1/p-Akt1/Cdc42促进宫颈癌细胞迁移和侵袭的作用机制。方法:G418压力筛选并获取稳定表达HK2蛋白的HeLa和SiHa细胞系;Western blot和细胞免疫化学鉴定HK2蛋白在HeLa和SiHa细胞系中的表达水平;细胞划痕实验检测HK2对HeLa和SiHa体外划痕愈合能力的影响;Transwell迁移、侵袭实验检测HK2对HeLa和SiHa细胞体外迁移和侵袭能力的影响;GEPIA数据库分别分析宫颈癌中HK2的表达与Akt1、Cdc42表达的相关性;Western blot检测Akt1、p-Akt1、Cdc42蛋白在HK2过表达的HeLa细胞和SiHa细胞中的表达情况;在HK2过表达的HeLa、SiHa细胞中应用Akt1/p-Akt1抑制剂MK2206观察Cdc42的表达及细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:成功构建HK2稳定表达的HeLa、SiHa细胞系;过表达HK2促进了HeLa、SiHa细胞的划痕愈合能力,促进了HeLa、SiHa细胞的体外迁移和侵袭;GEPIA在线数据库结果显示在宫颈癌中HK2表达与Akt1、Cdc42表达均呈正相关;过表达HK2上调了Akt1、p-Akt1、Cdc42蛋白在HeLa、SiHa细胞中的表达;在HK2过表达HeLa、SiHa细胞中,MK2206的使用抑制了HK2对Cdc42表达上调及细胞迁移和侵袭的促进作用。结论:HK2可能通过Akt1/p-Akt1途径上调Cdc42蛋白的表达促进HeLa和SiHa细胞的迁移和侵袭。

微小RNA-924靶向调控Cdc42表达及对肝癌细胞迁移和侵袭的影响

目的探讨微小RNA-924(miR-924)对细胞分裂周期蛋白42(Cdc42)表达的靶向调控及肝癌SK-Hep-1细胞迁移和侵袭的影响。方法采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测肝癌细胞株SK-Hep-1和正常肝细胞株LO2中miR-924的表达情况。采用Lipofectamine 2000向SK-Hep-1细胞转染miR-924模拟物(mimics组)和阴性对照序列(NC组),以不行任何转染的细胞为对照组。采用QPCR检测各组细胞的miR-924水平以评价转染效率,MTT法检测增殖活性,Transwell小室实验和划痕实验评价侵袭和迁移情况,QPCR和Western blotting法检测Cdc42水平,双荧光素酶报告基因实验验证miR-924对Cdc42的靶向调控作用。结果 QPCR检测显示,SK-Hep-1细胞中miR-924的水平为0.198±0.095,低于LO2细胞的1.025±0.135(P<0.05)。对照组、NC组和mimics组的miR-924水平为1.019±0.109、1.078±0.126和2.235±0.265,mimics组的miR-924水平高于对照组和NC组(P<0.05)。与其余两组相比,mimics组SK-Hep-1细胞增殖活力明显减弱,其中转染48～72 h的差异有统计学意义(P<0.05)。对照组、NC组和mimics组的划痕愈合率分别为(50.2±2.6)%、(52.4±3.7)%和(27.1±2.7)%,穿膜细胞数分别为(165.9±8.4)、(172.0±11.2)和(67.5±7.4)个,mimics组的划痕愈合率和穿膜细胞数均低于其余两组(P<0.05)。双荧光素酶报告基因检测实验证实Cdc42是miR-924的直接作用靶点。与其余两组相比,mimics组的Cdc42 mRNA和蛋白水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论低表达的miR-924参与了肝癌的发生、发展,上调其水平可抑制肝癌细胞的增殖活性及侵袭、迁移能力,可能是通过靶向下调Cdc42水平来完成的。

Cdc42参与脐带间充质干细胞向炎性因子的趋化

背景:间充质干细胞移植后的归巢能力关系到细胞移植的疗效,研究其趋化和迁移的调控将有助于提高间充质干细胞临床应用的价值。目的:观察Cdc42在人脐带间充质干细胞定向迁移中的作用。方法:首先以组织块法分离培养人脐带间充质干细胞,与炎性因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、转化生长因子β共培养后Western检测Cdc42表达变化。化学合成Cdc42的干扰RNA,转染细胞后分别采用Transwell和Matrigel胶观察细胞迁移和黏附能力。应用Western检测Cdc42下游靶分子ERK1/2的变化。结果与结论:与炎性因子共培养后的人脐带间充质干细胞中Cdc42表达明显增加,接近无因子对照组的2倍水平。siRNA下调Cdc42的表达能够显著抑制人脐带间充质干细胞的迁移和黏附,且其下游信号分子ERK1/2的表达以及磷酸化水平均相应受到抑制。提示体外培养环境下Cdc42参与了人脐带间充质干细胞的趋化过程。