基于FRET构建A型肉毒毒素活性检测的高通量方法

目的利用荧光共振能量转移(FRET)构建针对A型肉毒毒素酶活性检测的高通量体外方法。方法构建只识别A型肉毒毒素的基于双荧光标记底物的重组表达质粒,将其构建的质粒转入大肠杆菌表达系统进行表达,对表达后的荧光标记底物重组蛋白进行纯化和透析并保存备用;利用A型肉毒毒素轻链(ALc)对重组蛋白进行酶切检测活性;对本检测方法的条件进行优化;ALc切割荧光标记底物测定其酶动力学参数K_(m)与K_(cat)值。结果重组表达质粒构建成功,通过大肠杆菌表达系统表达后检测明显出现目的条带,对其纯化后获得的重组蛋白纯度在90%左右,命名重组蛋白为CYA。对CYA通过酶ALc、B型肉毒毒素轻链(BLc)进行酶切鉴定,结果显示CYA只能被ALc酶切产生与预期相符的两个蛋白片段,不能被BLc酶切。对基于FRET底物的条件优化得到:设定滤光片灵敏度在65~110之间;实时动态检测间隔为2 min/次,动态检测时间为30~120 min,底物CYA合适的浓度范围0.5~32μmol/L。CYA在ALc酶作用下随时时间的变化与荧光值528与485的比值作图最小在0.5左右,最大时约为0.9。酶动力学参数测定ALc切割CYA的值K_(cat)值为(5±0.4)s^(-1)和K_(m)为(2.33±0.21)μmol/L。结论成功构建了基于FRET技术的A型肉毒毒素活性检测的高通量体外分析方法。

基于FRET成像探究棕榈酰化修饰调节Fyn激酶活性

目的探讨棕榈酰化修饰调节非受体酪氨酸激酶Fyn活性的分子机制。方法利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术实时检测细胞中的Fyn活性,并结合棕榈酰化位点缺失和共转染蛋白质酪氨酸激酶(C-terminal Src kinase,CSK)表达质粒研究其分子机制。结果实验发现,(C3,C6)任一位点的棕榈酰化缺失能引起Fyn的高活性表达,且C6位点影响更显著。已知CSK激活后发生膜转移,FRET检测证实其对细胞中的Fyn活性有下调作用,但不能有效调控(C3,C6)棕榈酰化位点缺失的Fyn(GSS)活性。结论本文结果初步支持了Fyn活性受细胞内的物理空间定位分布的一种调控机制假设,即棕榈酰化缺失的Fyn(GSS)受细胞膜上CSK抑制性的调节作用被减弱,从而促进了组成性的高活性表达。

利用FRET技术检测不同力学条件下T细胞中ERK活性的脉冲现象

目的探索Jurkat T细胞中胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)活性动力学以及基质刚度对ERK活性的影响。方法利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术实时观测Jurkat细胞中ERK活性的变化,或细胞处于I型胶原基质胶中检测其影响。结果部分Jurkat细胞中存在ERK活性脉冲现象,频率约为3次/h,FRET振幅变化约为20%。在抗体激活T细胞抗原受体(T-cell receptor,TCR)的条件下,ERK脉冲依然存在,频率和振幅无显著变化。当细胞处于I型胶原水凝胶中,随着胶基质刚度增加,脉冲频率有所下调。结论Jurkat T细胞中存在自发的ERK活性脉冲现象,初步实验显示其频率受基质刚度影响。而该信号波动的生理意义和分子机制仍有待探索。

用于血清胰岛素测定的荧光共振能量传递(FRET)免疫检测法的建立

目的研究探讨新型荧光染料Dylight(DL)和金纳米颗粒(AuNP)间荧光共振能量转移(FRET)效应,并将其与免疫竞争法结合构建一种新型胰岛素荧光免疫检测方法。方法分别将胰岛素抗原(Ag)和胰岛素抗体(Ab)与DL和AuNP进行偶联,形成DL-Ag偶联物和AuNP-Ab偶联物。利用它们间产生的FRET效应以及免疫竞争反应,建立针对胰岛素的新型荧光免疫检测方法。然后对该检测方法的检测性能进行评估和实际样品的应用研究。结果该荧光免疫检测方法不仅表现出较高的检测灵敏度(0.015 ng/mL),较快的检测时间(4 min)以及较好的检测特异性,而且成功地用于血清胰岛素的检测,回收率在96.9%~121.1%之间。结论新型荧光染料DL和AuNP间FRET效应可应用于血清胰岛素的荧光免疫检测。

SLM成形IN738LC合金的微动磨损行为及磨损机理

本文通过高精度微动摩擦磨损试验机(SRV-V),以球/平面点接触模式对选区激光熔化(SLM)技术制备的IN738LC合金进行切向微动磨损实验,系统研究了恒定载荷条件下(50 N),不同位移幅值(50、100、150、200μm)试样的微动磨损行为及其磨损机理。结果表明:随着位移幅值增加,试样的摩擦因数和磨损体积逐渐增大,微动磨损运行状态由混合区逐渐转变为完全滑移区,50μm试样的磨损机理为轻微氧化磨损和疲劳磨损,200μm试样的磨损机理转变为氧化磨损、疲劳磨损和磨粒磨损。此外,磨痕中的微裂纹分布强烈依赖于微动区类型,即微裂纹出现在黏着区域和滑移区域的交界位置及完全滑移区域内。由于磨痕边缘存在犁削作用,磨痕形状由圆形变为椭圆形。

钢绳环式无级变速器钢丝磨痕几何特征研究

摩擦磨损分析对钢丝绳的寿命预测和可靠性理论具有关键意义。以6×7+IWS钢绳环为研究对象,利用ABAQUS软件对其内部钢丝间的微动磨损进行仿真。在接触载荷为1N和循环次数为50000的情况下,研究了交叉角度为30°、45°、60°、90°时下钢丝试样的磨痕深度、面积和体积的演变规律。仿真结果表明,在θ=30°时,磨痕深度和磨痕体积最小,分别为0.0034mm、1037.483×10^(-5)mm^(3);在θ=90°时,磨痕深度和磨痕体积最大,分别为0.0082mm、1040.831×10^(-5)mm^(3)。在相同交叉角度下,上钢丝的磨痕深度小于下钢丝的磨痕深度,上钢丝的接触面积总是大于下钢丝的接触面积。当上、下钢丝总磨痕深度达到报废标准时,30°、45°、60°和90°交叉试样所需的循环次数依次为608696、509091、466667和437500次。本研究为钢绳环在微动磨损下的磨痕几何特征和寿命预测提供了理论依据。

涂层锆合金包壳管切向微动磨损数值预测模型研究

为建立涂层锆合金包壳微动磨损的有限元计算分析模型,预测切向工况下的最大磨损深度,基于包壳-格架的实际几何特征建立了涂层锆合金包壳-刚凸接触系统的有限元模型,采用Archard磨损模型计算磨损量,结合ABAQUS的ALE功能和UMESHMOTION子程序模拟磨损过程。根据微动磨损试验结果分析磨损系数随磨损周次的变化情况,并拟合其函数关系。有限元计算的最大磨损深度和最大深度的位置与试验结果相符,表明所建立的模型可用于涂层锆合金包壳切向微动磨损最大深度的预测。

磁控溅射与电镀工艺制备镀银层的微动磨损性能对比

采用电镀与中频-直流磁控溅射技术分别在钢基体表面制备银镀层,利用显微硬度计、微米划痕仪和疲劳试验机等对两种镀银样品的硬度、结合力及微动磨损等性能进行了表征,并利用扫描电镜、激光共聚焦显微镜等对微动磨损后样品的磨损形貌和磨损机理进行了分析。结果表明:磁控溅射工艺制备的镀银样品的显微硬度、表面粗糙度要优于电镀工艺制备的镀银样品;磁控溅射工艺制备的镀银样品的结合力比电镀样样品的结合力高1.5倍,有利于提高镀层的耐磨性;经过300 h的有效微动磨损实验,发现磁控溅射工艺制备的镀银层相比于电镀工艺制备的镀银层的磨损深度下降了33.3%,这与磁控溅射工艺制备的镀银层表面光整度好和粒子尺寸更细小有关。磁控溅射工艺制备的镀银样品的磨损机理是磨粒磨损,而电镀工艺制备的镀银层是粘着磨损。

织构化钛合金表面MoS_(2)薄膜的制备及其微动摩擦学性能研究

钛合金作为1种性能优异的轻金属结构材料,其较差的耐磨性限制了钛合金在摩擦学领域的应用.本文中通过将表面织构化与固体润滑薄膜相结合在钛合金表面制备了MoS_(2)复合润滑薄膜,考察了织构参数以及摩擦对偶材料对其微动摩擦学行为的影响.研究表明:当摩擦对偶为GCr15球时,表面织构化与固体润滑剂相结合能显著减小材料的磨损和延长润滑寿命,织构密度为20%的样品表面容易形成转移膜,润滑寿命最长.而当摩擦对偶为TC4球时,在相同测试条件下,表面复合结构的抗磨寿命远低于摩擦对偶为GCr15球时的寿命.摩擦对偶材料影响着复合润滑结构的润滑寿命,表面织构能够起到补充固体润滑剂和捕获磨屑的作用,从而达到抗磨减摩的目的,同时适宜的织构密度能明显延长复合润滑结构的微动寿命.

FRET技术及其在蛋白质-蛋白质分子相互作用研究中的应用

简要综述了FRET方法在活细胞生理条件下研究蛋白质 蛋白质间相互作用方面的最新进展 .蛋白质 蛋白质间相互作用在整个细胞生命过程中占有重要地位 ,由于细胞内各种组分极其复杂 ,因此一些传统研究蛋白质 蛋白质间相互作用的方法 ,例如酵母双杂交、免疫沉淀等可能会丢失某些重要的信息 ,无法正确地反映在当时活细胞生理条件下蛋白质 蛋白质间相互作用的动态变化过程 .荧光共振能量转移 (fluorescenceresonanceenergytransfer ,FRET)是近来发展的一项新技术 ,此项技术的应用 ,为在活细胞生理条件下对蛋白质 蛋白质间相互作用进行实时的动态研究 。

31CrMoV9钢离子渗氮层的微动摩擦磨损特性研究

针对31CrMoV9钢基体及其渗氮层,采用切向微动磨损试验机开展球/平面接触模式下的切向微动磨损试验探究了在法向载荷为20 N时,不同位移幅值下(D=5、10、50μm)的切向微动损伤机制和损伤演变规律.采用X射线衍射仪(XRD)对试样表层物相进行分析,扫描电子显微镜(SEM)和白光干涉仪对试样磨损区进行形貌表征,能谱仪(EDS)和电子探针显微分析仪(EPMA)进行化学元素分析.结果表明:离子渗氮处理后在基体表面形成了化合物层和扩散层,显著提高了表面硬度.在法向载荷F_(n)=20 N时,随着微动位移幅值的增大,31CrMoV9基体及其渗氮层的微动运行区均由部分滑移区逐渐向混合、完全滑移区转变,磨损体积增大,磨损更加严重,稳定阶段的摩擦系数逐渐增大.在部分滑移区和完全滑移区,渗氮层较基体在稳定阶段的摩擦系数更小,而在混合区基体的摩擦系数更小在混合区和完全滑移区时,基体及渗氮层的损伤机制均为剥层、磨粒磨损和氧化磨损.离子渗氮生成的化合物层能提高材料的抗微动磨损性能,在D=10和50μm时,磨损率分别降低了约38.5%和70.2%.研究结果可为轨道交通等领域结构件的选材和抗微动磨损设计提供参考.

20Cr13不锈钢高温微动摩擦磨损特性研究

高温是汽轮机不锈钢叶片服役面临的最基本挑战之一.本文中开展了环境温度对典型微动位移下20Cr13不锈钢微动摩擦磨损特性的影响研究,分析了不同温度影响下的摩擦系数时变特性,探讨了不同温度影响下的微动运行工况、磨损形貌特征、磨屑运动行为和主要损伤机制.结果表明:温度上升并未改变小位移工况下的界面微动运行状态,但磨斑边缘出现明显的磨粒磨损和材料剥落特征.温度大于100℃促使中等位移工况的微动磨损由混合态转变为完全滑移态,且摩擦系数与材料磨损先上升后下降.高温诱使微动滑移区界面松散磨屑形成特殊的“釉质层”,虽有效缓解不锈钢材料磨损,但其对摩擦副上试样的磨粒磨损与黏着磨损问题不容忽视.

基于SPHD及FRET技术的蛋白质传感器

蛋白质传感器作为一种分析蛋白质与其他分子之间作用力的有效手段已经越来越显示出其优点,但是蛋白质在基底表面的变性问题对于研究者来说仍然是一个挑战.作者介绍了一种具有高灵敏度的蛋白质传感器,即利用DNA引导固定(DDI)方法,将DNA-蛋白质复合物通过DNA双链特异性杂交固定在硅基底表面,从而有效保持了蛋白质的活性,并且引入荧光共振能量传递(FRET)技术以及电势扫描发卡去杂交(SPHD)技术降低非特异性吸附带来的荧光信号.这种蛋白质传感器在蛋白质识别以及DNA杂交方面具有显著区分不同体系荧光信号的能力.

利用FRET技术在活细胞内观察EGF对PKA作用的时空成像

cAMP依赖的蛋白激酶(protein kinase A, PKA)在细胞生长与分化过程中扮演重要角色,特别是在调节Ras信号通路引起的细胞增殖效应中起着重要作用。为了在活细胞内动态观察表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)对PKA的作用,采用一种可以检测PKA酶活性的报告蛋白(A-kinase activity reporter, AKAR)——这种报告蛋白是利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理设计的,使其在人类肺癌细胞(ASTC-a-1)中稳定表达。加入EGF刺激因子后,随时间变化的成像分析显示出在活细胞生理条件下被EGF作用的PKA酶活性变化的时空信息。这些资料为EGF作用PKA提供了直接的实时证据。

微动磨蚀及表面防护技术回顾

系统讨论了微动磨损及其与腐蚀耦合的失效机理和表面防护技术,为提高机械零部件的可靠性和延长使用寿命提供理论支持和实践指导。重点分析了固体自润滑涂层、液体润滑膜、树脂基涂层等低摩擦表面技术在减轻微动磨损方面的应用效果及其作用机理,并且对比了一系列微动磨损与腐蚀防护技术的利与弊,揭示了防护手段对腐蚀磨损性能的优化机理。此外,还讨论了低摩擦表面腐蚀防护设计的策略,包括基于表面工程的正向设计和基于失效分析的逆向推演,并对耐磨蚀涂层设计进行了深入探讨。最后,总结了微动磨蚀防护技术的研究进展,并对其未来的发展方向进行了展望。通过以上综合性的研究和分析,为提高机械零部件在复杂工况下的耐磨性和抗腐蚀能力提供了重要的理论依据和技术参考。

在活细胞中应用FRET技术研究TGFβ/TβRI信号传导

转移生长因子β(TGFβ)信号传导通路参与调节细胞的增殖、分化、凋亡、细胞迁移等一系列细胞过程,与骨代谢疾病的发病机制密切相关.本研究根据荧光共振能量转移(FRET)技术原理,构建包含CFP-TβRI-YFP融合蛋白的TβRI生物传感器,转染293T细胞,观察转染效率.以TGFβ1为诱导剂,激活TGFβ/TβRI信号传导通路,在活细胞生理条件下,动态监测TβRI生物传感器的FRET效应.结果表明,成功构建了TβRI生物传感器,转染细胞效率达50%,在TGFβ1诱导刺激6min后,FRET效率增加并达到最大值,该过程经历9 min后,随时间的延长,FRET效率下降.研究结果表明:在活细胞生理条件下,TGFβ1/TβRI信号转导过程存在一定的时间特异性.

激光熔覆MoNbTaVW难熔高熵合金涂层微动磨损性能

研究了采用激光熔覆技术制备的MoNbTaVW难熔高熵合金涂层在不同载荷(10N、20N、30N)、不同微动磨损幅值(50μm、150μm、250μm)、不同循环次数(5000、10000、15000)下的微动磨损性能及微动磨损机制。结果表明:所制备的MoNbTaVW难熔高熵合金涂层由Fe_(7)Ta_(3)型HCP固溶体相、FCC固溶体相及(Fe,Ni)基体相组成,其中FCC相为未熔的高熵合金粉末。根据正交实验极差分析可知,微动磨损幅值对磨损体积的影响最大,微动磨损载荷对磨损体积的影响次之,微动磨损循环次数对磨损体积的影响最小,其中MoNbTaVW难熔高熵合金涂层在15000次、20N、250μm微动磨损条件下的磨损体积达到最大值;微动磨损载荷对摩擦系数的影响最大,微动磨损幅值对摩擦系数的影响次之,微动磨损循环次数对摩擦系数的影响最小,其中MoN bTaVW难熔高熵合金涂层在10000次、30 N、150μm微动磨损条件下的摩擦系数达到最大值。MoNbTaVW难熔高熵合金涂层的微动磨损机制主要为氧化磨损和黏着磨损,磨损产生的磨损碎片主要为Ta、W的氧化物。

基于螺[口恶]嗪光异构化的多功能荧光染料及应用

合成了键合萘酰亚胺单元的螺嗪类化合物,通过核磁共振谱和高分辨质谱确证了其结构。紫外光照射后,化合物能发生从浅黄色到绿色开环体的异构化反应,同时萘酰亚胺单元的荧光强度有所降低。化合物在H^(+)存在时经紫外光照射后发生从浅黄色变为橙色或红色的颜色改变(生成MCH+),其最大吸收波长与萘酰亚胺单元的荧光发射波长具有很好的交叠,发生明显的荧光共振能量转移(FRET),可见光能使逆过程发生伴随着颜色和荧光的恢复,这些结果赋予化合物紫外光/可见光交互作用下的可逆荧光分子开关功能。化合物在滤纸上氢离子存在或缺失条件下的颜色及荧光改变的区别,显示了化合物在多重防伪领域中的应用潜力。

镀银铜材料在大电流条件下的载流微动磨损特性

利用化学电镀方法在T2紫铜管表面镀银制备镀银铜试样,采用自主研制的切向微动磨损试验设备在圆柱/圆柱的正交点接触模式下进行室温载流切向微动磨损试验,探究了镀银铜试样在5 A电流以及不同法向载荷(5,10,15 N)和位移幅值(30,50,70,100μm)下的载流微动磨损行为及其磨损机制。结果表明:随着位移幅值的增加,镀银铜试样的载流微动磨损程度加剧,随着循环次数的增加,不同位移幅值下的摩擦因数整体呈先减小后增大最后趋于稳定的趋势,而接触电阻呈相反趋势,不同位移幅值下稳定阶段的摩擦因数相差不大;随着载荷的增加,载流微动磨损程度先变大后变小,当载荷为10 N时,磨损程度最大,此时有效接触面积较大,接触电阻较低;随着载荷的增加,稳定阶段的摩擦因数增大。镀银铜试样在磨损初期的磨损机制主要黏着磨损和氧化磨损,在磨损后期主要为磨粒磨损、氧化磨损和剥层,且随着循环次数的增加,氧化磨损程度加剧。

基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法

目的利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法。方法构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TLc)分别对目的蛋白进行酶切反应。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化。酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值。结果设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒。表达并纯化后获得纯度为90%左右的重组蛋白,命名为CYVAMP。利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割。对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2~32μmol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65~110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适。CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图最大时在1.5左右,最小在0.5左右。酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16±0.28)s-1。TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1。结论成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需。