传染性法氏囊病病毒（IBDV）人工感染SPF鸡的病理学观察

取３２０只３０～４０Ｈ龄ＳＰＦ鸡，经滴鼻和点眼接种传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ），接种后２４～７２ｈ出现死亡，病死率５１．２５％，死亡鸡剖检变化主要为法氏囊肿胀、出血，甚至呈紫葡萄样，脾脏肿大、出血，骨骼肌出血，腺胃肌胃交界处出血。病理组织学变化，呈现以法氏囊淋巴滤泡内髓质淋巴细胞坏死为主的特征性病变，并可在巨噬细胞浆内发现病毒包涵体。电镜观察，在法氏囊内淋巴细胞、异染性细胞、巨噬细胞浆内，见大量晶格状排列的病毒粒子和包涵体，表明ＩＢＤＶ首先损害法氏囊淋巴滤泡髓质内未成熟的Ｂ淋巴细胞，病毒在淋巴细胞内以包涵体方式增殖。

淫羊藿多糖的硫酸化修饰及其对IBDV感染细胞的影响

按正交试验设定氯磺酸-吡啶法的9种修饰条件,对淫羊藿多糖(EPS)进行硫酸化修饰,得到9种硫酸化淫羊藿多糖(sEPS),用MTT法比较了9种sEPS抵抗鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)感染鸡胚成纤维细胞(CEF)的作用。结果表明,硫酸化修饰后sEPS较未修饰的EPS显著提高了CEF抵抗IBDV感染的作用,以sEPS2和sEPS5的效果较好,且与sEPS的硫酸基取代度和糖含量有一定的相关性,反应温度80℃、氯磺酸与吡啶的配比1∶8、反应2h为最佳修饰条件。

雏鸡在感染IBDV后红细胞免疫功能变化的研究

在经ＩＢＤ弱毒苗免疫和未免疫的３０～５９日龄ＡＡ鸡研究了感染ＩＢＤＶ后红细胞免疫功能的变化。结果表明：从以ＩＢＤＶ攻毒前１天到攻毒后头５天内，未免疫攻毒鸡（Ａ组）和免疫攻毒鸡（Ｂ组）ＲＢＣ－ＣＲ１花环率降低或显著降低，而未免疫未攻毒鸡（Ｃ组）没有类似变化，高于Ｂ组，明显高于Ａ组，以后Ａ和Ｂ组逐渐回升到攻毒前水平。Ａ和Ｂ组ＲＢＣ－ＩＣ花环率在ＩＢＤＶ攻毒后第５天明显降低，均显著低于Ｃ组水平，以后Ａ组仍处于较低水平上变动，Ｂ组即逐渐回升，三组比较，Ａ组仍低于Ｃ组，同时也低于Ｂ组。

黄芪多糖对人工感染IBDV雏鸡红细胞免疫功能的影响

将由未免疫接种腔上囊病疫苗鸡的种蛋孵化而来的160只1日龄海兰白雏鸡随机分为A、B、C和D共4组。A组为对照组，B、C和D组于26日龄时按每只0．3mL的剂量用IBDV攻毒。A、B组未用黄芪多糖（APS）处理，C、D组从攻毒当日起连续胸肌注射APS6d，剂量分别为每只鸡5mg和10mg。分别在21、29、32、35、38日龄时心脏采血1～3mL，测定E—C3bRR、E—ICRR、ERER和ERIR。结果显示，雏鸡感染IBDV后可使E-C3bRR和ERER显著降低（P〈0．01）；APS处理组E-C3bRR、E-ICRR、ERER均高于A、B组（P〈0．01），其中D组最高，而ERIR则与A组相似。证实，雏鸡感染IBDV后红细胞免疫功能低下，而APS可显著提高其红细胞免疫功能。

传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的

IBDV VP3结构蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

应用RT-PCR技术从鸡IBDV总RNA中克隆出893bp的VP3基因,并将其进一步克隆于pET-28a载体T7启动子的下游,构建了pETVP3原核表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3)中成功表达了35.5,33kDa的鸡IBDVVP3蛋白。经SDS-PAGE和Westernblotting分析,VP3表达产物以包涵体形式存在,并与鸡IBDV抗血清特异性反应。

雏鸡混合感染IBDV与CAV的研究

实验分为 4组 :空白对照组、CAV感染组、IBDV感染组、IBDV_CAV混合感染组。选择IBDV发病严重期 (6日龄 )与CAV发病严重期 (13日龄 )测定并计算各组鸡的法氏囊、胸腺和体重的比值 ;分离外周血、法氏囊和胸腺中的淋巴细胞 ,加入适量的刀豆蛋白 (ConA)和商陆凝集素 (PAM)作为有丝分裂刺激原 ,利用MTT法检测实验鸡免疫细胞的功能变化 ;统计死亡率 ,绘制死亡曲线。研究发现 ,IBDV与CAV的混合感染较单独感染严重降低了感染鸡免疫活性细胞的增殖功能 ,并同时增强了IBDV或CAV的致病力 ,出现两次死亡高峰 ,病死率达 10 0 %。

不同时期8株IBDV地方株VP2基因变异分析

对分离于洛阳地区1991和2001年前后间隔达10年之久的两个时期的8株IBDV进行了VP2基因的克隆与序列分析。结果发现,8个地方株虽均属于IBDV超强毒株,但各个毒株间也有一定的差异。根据它们的核苷酸和氨基酸同源性高低可明显分为3群,分别位于系统进化树上超强毒区的3个小分支上。第1群包括1991年分离的L912、L914和L916三株;第2群包括L913、L017和L018三株;第3群包括2001年分离的L015和L016二株。群内各毒株间同源性较高,在98.3%～100%之间;群间各毒株的同源性则相对较低,在95%～97.9%之间,其中最低的为L015和L017、L016和L018二对,同源性均只有95%。进一步的序列分析表明,8个地方分离株均具有vvIBDV所具有的特征。其中,1991年的4株在各亲水区和七肽区的氨基酸和经典株及传统的超强毒株相比均无明显的变化;而2001年的4个分离株虽仍符合超强毒株的特点,但在相应亲水区均有1～2个氨基酸发生替换,特别是L015和L016株还出现了4个其它各毒株均没有的氨基酸位点变化。

硫酸化黄芪多糖对CEF生长及抵抗IBDV感染的影响

采取一步醇沉和分步醇沉法提取4种黄芪多糖APSt、APS40、APS50和APS60,用氯磺酸-吡啶法进行硫酸化修饰,得到4种硫酸化黄芪多糖(sAPS)sAPSt、sAPS40、sAPS50和sAPS60,用MTT法比较了4种硫酸化黄芪多糖对鸡胚成纤维细胞(CEF)的生长及抵抗鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)感染的影响,以未修饰的APSt为对照。结果显示,APSt显著促进CEF生长,细胞毒性较低,但抵抗鸡传染性法氏囊病毒感染细胞的作用较弱;sAPS抵抗鸡传染性法氏囊病毒感染的作用显著增强,显效浓度降低,但安全浓度也降低。表明通过硫酸化修饰可以提高黄芪多糖的抗病毒活性,但高浓度sAPS的细胞毒性增强。

IBDV强毒株感染SPF鸡后法氏囊淋巴细胞的凋亡及调控机制

为探究IBDV强毒BC6 / 85株感染SPF鸡后 1～ 9d内法氏囊淋巴细胞中Bcl 2和Bax蛋白的动态表达与淋巴细胞凋亡的关系 ,通过透射电镜观察及TUNEL法检测凋亡的淋巴细胞 ,用免疫组织化学方法检测Bcl 2和Bax蛋白。研究结果表明 :感染后 3～ 5d可见到大量凋亡的淋巴细胞 ,Bcl 2和Bax蛋白表达量显著高于同时点的对照组 (P <0 0 1) ;Bcl 2 /Bax(Bcl 2与Bax比率 )显著低于同时点的对照组 (P <0 0 1)。BC6 / 85株感染SPF雏鸡3～ 5d后法氏囊淋巴细胞会发生大量凋亡 ,Bcl 2 /Bax能准确反映淋巴细胞的凋亡程度。

雏鸡在感染IBDV后血浆cAMP、cGMP和IL-2水平变化

在经ＩＢＤ弱毒苗免疫和未免疫的３０～５９日龄ＡＡ鸡研究了感染ＩＢＤＶ后血浆ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ和ＩＬ２水平动态变化。结果表明：未免疫攻毒鸡（Ａ组）、免疫攻毒鸡（Ｂ组）和未免疫未攻毒鸡（Ｃ组）在ＩＢＤＶ攻毒前１天血浆ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ水平Ｂ组明显高于Ａ和Ｃ组，ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值同样是Ｂ组高于或明显高于Ａ和Ｃ组，ＩＬ２水平三组之间无明显差异。在攻毒后的头５天内，Ｂ和Ｃ组ｃＡＭＰ明显升高，而Ａ组没有类似的变化，第５天明显低于Ｂ和Ｃ组，以后Ｂ和Ｃ组仍高于或显著高于攻毒前和同期Ａ组水平。在攻毒后Ａ和Ｂ组ｃＧＭＰ均呈波动性上升趋势，第７天明显高于攻毒前水平并高于Ｃ组，以后Ａ、Ｂ、Ｃ三组均下降，但Ａ组比Ｂ和Ｃ组下降更快。在攻毒后２８天内，Ａ组ｃＡＭＰ／ｃＧＭＰ比值无明显变化，Ｂ组波动上升，Ｃ组处于高水平上，Ｂ和Ｃ组均高于或明显高于Ａ组。血浆ＩＬ２水平Ａ和Ｂ组在ＩＢＤＶ攻毒后的头７天内呈逐渐下降趋势，但Ａ组下降的更剧烈，Ｃ组无明显差异性变化，三组相比，Ｂ和Ｃ组均高于或明显高于Ａ组，以后Ａ和Ｂ组逐渐回升。

转化型桔梗皂甙抗IBDV、AIV和NDV的研究

为探索中药桔梗的主要活性成分桔梗总皂甙及其转化型桔梗皂甙的生物学活性和抗IBDV、A IV(H9)、NDV的作用,采用M TT法和间接免疫荧光检测试验,分别研究桔梗总皂甙与转化型桔梗皂甙的细胞毒性、对CEF生长和活性的影响以及抗病毒活性。结果表明:桔梗总皂甙和转化型桔梗皂甙对细胞毒性作用的IC50分别为128.74和53.48μg.mL-1,对CEF细胞生长和活性具有最大促进作用的浓度分别为80和25μg.mL-1。桔梗总皂甙阻断IBDV、A IV(H9)、NDV感染CEF细胞的作用分别为66.3%、55.4%和36.9%,抑制三者增殖的作用分别为69.4%、60.8%和26.2%;转化型桔梗皂甙阻断三者感染CEF细胞的作用分别为84.7%、63.5%和45.5%,抑制三者增殖的作用分别为77.8%、63.5%和41.9%,表明桔梗总皂甙经化学处理转变成转化型桔梗皂甙,可明显提高其生物学活性和抗病毒用。

高亲和力抗IBDV单克隆抗体的产生与免疫学鉴定

目的：生产高亲和力的抗IBDV不同抗原决定簇的单克隆抗体，为IBD的快速检测准备试剂。方法：用IBDV抗原诱导Balb/c小鼠产生最强最适当的反应，将免疫脾细胞与NSO瘤细胞融合，通过对大量的杂交细胞培养上清进行检测和鉴定，筛选出分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果：获得分泌高亲和力单克隆抗体的杂交瘤21株，其中4株YNZ-1、YNZ－12、YNZ-8和YNZ-26的间接ELISA效价分别为：1：2560、1：1280、1：2560、1：640；腹水间接ELLSA效价分别为：1×10－6、5×10－5、1×10－6和1×10-5。结论：单抗YNZ－1和YNZ-18、YNZ－12和YNZ－26亲和力高，识别IBDV不同的抗原决定簇，可作为制备快速诊断IBD的特异单克隆抗体。

鸡传染性法氏囊病病毒VP5的原核表达、多抗制备及初步应用

传染性法氏囊病(infectious bursal disease virus,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种主要危害雏鸡的急性传染病。在IBDV编码的5个蛋白中,VP5是IBDV唯一可以缺失基因的蛋白。本研究克隆了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白编码基因,利用原核表达系统表达了VP5蛋白,通过免疫BALB/c小鼠制备VP5多抗,并对多抗进行了鉴定和检测不同IBDV毒株的应用。结果显示,IBDV优势流行毒株的VP5蛋白实现了可溶性表达,分子质量约为17 kDa;制备的VP5多抗特异性良好,ELISA效价可达1:64000;VP5多抗可通过IFA和Western Blot检测识别IBDV rHLJ0504-HT株,不识别VP5基因缺失株。结果表明:试验成功表达了IBDV优势流行毒株的VP5蛋白,并制备了VP5多抗;VP5多抗可对IBDV及其VP5编码基因缺失毒株进行鉴别检测。本研究对于IBDV检测方法的建立以及VP5编码基因功能的进一步研究提供了物质基础。

IBDV VP2/VP243基因DNA疫苗表达质粒的构建与表达

将传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) VP2 /VP2 4 3插入真核表达载体 pc DNA中 ,置于 CMV启动子的调控之下 ,构建成 DNA疫苗表达质粒 pc DNA VP2和 pc DNA VP0。分别转染 CEF细胞后 ,于 2 4、4 8、72 h取细胞裂解液进行 ELISA、SDS-PAGE和 Western blot检测 ,pc DNA VP2于转染后 2 4 h呈阳性反应 ,4 8h表达量高于 2 4 h;pc DNA VP0于转染后 4 8h呈阳性反应 ,72 h表达量高于 4

感染IBDV雏鸡血液激素水平和ANAE阳性淋巴细胞动态变化

为探讨内分泌活动及细胞免疫反应在鸡抗传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）感染中的调节作用机制而进行了本研究。结果表明，攻毒后１～５ｄ内，未免疫攻毒鸡（Ａ组）、免疫攻毒鸡（Ｂ组）血浆皮质酮均明显上升，而未免疫未攻毒鸡（Ｃ组）则否。Ａ、Ｂ、Ｃ３组血浆Ｔ４水平攻毒前后无明显变化，Ｔ３除在攻毒后第３天Ａ组明显高于Ｂ、Ｃ组外，其他时间无明显差异性变化。血液ＡＮＡＥ阳性淋巴细胞（％）在攻毒后的１～５ｄ内，Ａ组和Ｂ组明显下降，以后回升，至２８ｄ回复到攻毒前水平，并接近于Ｃ组。Ａ组的ＡＮＡＥ阳性淋巴细胞（％）与皮质酮呈显著负相关，与Ｔ３和Ｔ４无明显相关性。

外源性核酸对感染IBDV雏鸡免疫功能和抗氧化能力的影响

300只20日龄健康海兰白雏鸡随机分为6组,Ⅰ组为对照组,Ⅱ～Ⅵ为试验组,Ⅱ、Ⅴ组饲料中分别添加0.1%核酸,Ⅲ和Ⅵ组分别添加0.2%核酸,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组于27日龄感染传染性法氏囊病毒(IBDV),分别于30,33,36,39,42日龄心脏采血测定T淋巴细胞转化率,白细胞的吞噬率,SOD、GSH-Px和CAT活性,用流式细胞仪测定鸡脾脏T淋巴细胞亚群的变化;同时处死雏鸡,测定免疫器官法氏囊和脾脏指数,观察其组织结构。结果表明,日粮中添加不同剂量的核酸均可提高T淋巴细胞转化率和T淋巴细胞数,法氏囊和脾脏的相对质量均明显增加,并能促进法氏囊和脾脏的快速发育,提高脾淋巴细胞中CD3+、CD4+和CD8+T细胞百分率,改变CD4+/CD8+比值促进对机体免疫系统的调控,增强白细胞的吞噬功能;并可显著提高鸡血清中SOD、GSH-Px和CAT活性。IB-DV感染组与病毒感染加核酸组之间上述指标差异显著,感染IBDV组可使上述指标明显下降,感染IBDV加核酸组的上述指标接近正常对照组,说明核酸能补偿IBDV对雏鸡免疫系统的抑制作用,具有一定的抗氧化能力,而且能促进雏鸡修复组织损伤。

IBDV逆转录-聚合酶链反应和核酸杂交检测方法的研究

以建立的传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和核酸杂交检测方法，检测了细胞培养物、病理组织、粪便和饲料中的ＩＢＤＶ，并与ＩＢＤＶ夹心ＥＬＩＳＡ、琼脂扩散试验（ＩＤ）和病毒分离方法进行了平行比较试验。结果表明，ＲＴ－ＰＣＲ和核酸杂交检测方法具有高度的敏感性和特异性，是深入研究ＩＢＤ流行病学。

鸡IL-18对IBDV多聚蛋白DNA疫苗的免疫增强作用研究

为进一步评价鸡IL-18的免疫增强作用,用鸡白细胞介素18(IL-18)的真核表达质粒(pCI-IL-18)与传染性法氏囊病病毒(IBDV)多聚蛋白DNA疫苗分别免疫SPF鸡,14日龄时首免,2周后二免,二免后5周用IBDV标准强毒株BC6/85攻击.研究发现,鸡IL-18能显著促进T、B淋巴细胞的增殖反应,增强IBDV多聚蛋白DNA疫苗诱导的中和抗体水平及其对强毒攻击的保护力.结果提示,鸡IL-18(200μg)对IBDV多聚蛋白DNA疫苗具有显著的免疫增强作用(P<0.05).

IBDV南京野毒株VP2结构蛋白基因克隆与表达

用微机辅助设计合成了一对引物，用于扩增传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）中国地方株ＶＰ２基因片段。ＲＴＰＣＲ扩增出一１３２１ｂｐ的目的片段，分子杂交鉴定为ＶＰ２基因。扩增产物经双酶切后插入含噬菌体ＰＲＰＬ双强启动子的ｐＣＹＴＥＸＰ１表达质粒，构建了ＶＰ２基因克隆ｐＣＶＰ２１，经ＤｏｔＥＬＩＳＡ筛选出４个ＶＰ２表达阳性克隆。ＳＤＳＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示有一约３２０００的目的蛋白带，且能与ＩＢＤＶ阳性血清结合。