叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

基于JNK通路探讨补肾活血方对大鼠骨关节炎软骨细胞凋亡的影响

目的 探讨补肾活血方(Bushen Huoxue Formula,BSHXF)通过c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信号通路对大鼠骨关节炎(Osteoarthritis,OA)软骨细胞凋亡的影响。方法 采用白细胞介素-1β (interleukin-1β,IL-1β)诱导体外分离培养的大鼠软骨细胞构建体外OA模型,并使用不同浓度的BSHXF干预处理。使用MTT法测定细胞活力;CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术评估细胞凋亡情况;Western bolt检测凋亡相关蛋白裂解的胱天蛋白酶-3(Cleaved Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)水平和JNK、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)蛋白水平。试剂盒检测细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平;ELISA法检测细胞上清液中促炎因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)含量。结果 (1)与对照组相比,模型组软骨细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著升高(P<0.01);模型组Cleaved Caspase-3、Bax、p-JNK蛋白表达水平显著升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与模型组相比,BSHXF治疗组软骨细胞活力升高(P<0.05),凋亡率显著降低(P<0.01);BSHXF治疗组Cleaved Caspase-3、Bax、p-JNK蛋白表达水平显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.01)。(2)与对照组相比,模型组细胞中ROS和MDA的相对含量显著升高(P<0.01),GSH的相对含量显著降低(P<0.01);模型组细胞中TNF-α和IL-6的含量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比,BSHXF治疗组细胞中ROS和MDA的相对含量显著降低(P<0.01),GSH的相对含量显著升高(P<0.01);BSHXF治疗组细胞中TNF-α和IL-6的含量均显著降低(P<0.01)。(3)与溶剂对照组相比,激活剂对照组的p-JNK、Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平显著上调(P<0.05),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01),细胞增殖能力下降(P<0.05),细胞凋亡率显著增加(P<0.01);BSHXF治疗组和溶剂对照组两组间细胞增殖、凋亡率和凋亡相关蛋白表达(Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2)情况差异均无统计学意义(P>0.05)。(4)与溶剂对照组相比,激活剂对照组的ROS和MDA水平显著升高(P<0.01),而GSH水平显著降低(P<0.01),TNF-α、IL-6含量升高(P<0.05);BSHXF治疗组和溶剂对照组两组间ROS相对含量、MDA、GSH水平差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 BSHXF通过抑制JNK信号通路激活抑制IL-1β诱导的OA软骨细胞凋亡,改善氧化应激和炎症反应。

“脾肾相赞”理论探讨不同治法对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化中TNF-α、JNK含量影响

目的在“脾肾相赞”理论指导下,比较不同中医治法对大鼠BMSCs成肌分化及过程中TNF-α、JNK蛋白表达的影响,分析中医治疗骨质疏松症的机制。方法将大鼠分为正常组、诱导组、补肾组、健脾组、补肾健脾组(随机数字表法),制备含药血清,选取第4代BMSCs进行实验,运用免疫荧光法分析各组成肌分化情况,酶联免疫吸附法检测TNF-α、JNK蛋白表达量。结果①BMSCs经诱导15d后,通过免疫荧光化学染色法检测MyoG荧光平均强度,结果显示:各组均显著高于正常组(P<0.01),补肾健脾组最高。②TNF-α蛋白检测:补肾组、补肾健脾组显著低于正常组(P<0.01)。③JNK蛋白检测:各组显著低于正常组(P<0.01)。结论①各治法中,补肾健脾法对大鼠BMSCs成肌分化的促进效果最佳,为通过脾肾、肌骨双方向治疗OP提供可能。②各中医治法均对大鼠BMSCs的成肌分化存在促进作用,这可能与降低TNF-α、JNK水平有关。

苦杏仁苷通过抑制JNK信号通路改善卒中后抑郁

目的研究苦杏仁苷通过抑制JNK信号通路对卒中后抑郁的改善作用。方法将56只健康SD大鼠随机分为假手术组(n=8)、造模1组(n=8)、造模2组(n=40),造模1组大鼠制备卒中模型,造模2组大鼠制备卒中后抑郁模型。造模成功后,卒中后抑郁模型大鼠随机分为卒中+抑郁组、卒中+抑郁+苦杏仁苷低剂量组(40 mg·kg^(-1))、卒中+抑郁+苦杏仁苷中剂量组(80 mg·kg^(-1))、卒中+抑郁+苦杏仁苷高剂量组(120 mg·kg^(-1))、卒中+抑郁+氟西汀组(1.8 mg·kg^(-1))。随后按相应剂量给药,连续给药30 d。观察大鼠Zea Longa评分,测定蔗糖水消耗量;H&E染色观察海马组织病理变化;TUNEL染色观察海马组织神经元细胞凋亡;透射电镜观察海马组织超微结构变化;Western blot检测海马组织PSD95、SYN、BDNF及JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、cleaved-caspase 3、Bcl-2蛋白表达。结果与假手术组比较,卒中组、卒中+抑郁组大鼠Zea Longa神经行为学评分,细胞凋亡百分率,以及海马组织p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、cleaved-caspase 3蛋白表达明显升高(P<0.05);蔗糖水消耗量,海马组织PSD95、SYN、BDNF、Bcl-2蛋白表达明显降低(P<0.05)。与卒中+抑郁组比较,卒中+抑郁+苦杏仁苷低剂量组、卒中+抑郁+苦杏仁苷中剂量组、卒中+抑郁+苦杏仁苷高剂量组、卒中+抑郁+氟西汀组大鼠Zea Longa神经行为学评分,细胞凋亡百分率,以及海马组织p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、cleaved-caspase 3蛋白表达明显降低(P<0.05),蔗糖水消耗量、海马组织PSD95、SYN、BDNF、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。与卒中+抑郁+氟西汀组比较,卒中+抑郁+苦杏仁苷高剂量组大鼠Zea Longa神经行为学评分,细胞凋亡百分率,以及海马组织p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、cleaved-caspase 3蛋白表达明显降低(P<0.05),海马组织PSD95、SYN、BDNF、Bcl-2蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论苦杏仁苷改善卒中后抑郁样行为,可能与抑制海马JNK信号通路有关。

酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路的影响

目的基于内质网应激(ERS)肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)/凋亡信号调节激酶1(ASK1)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路探讨酸枣仁-合欢花对孤养结合慢性不可预见性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型大鼠的干预作用。方法将144只大鼠随机分为正常组、模型组及酸枣仁-合欢花高、中、低剂量组和文拉法辛组。除正常组外,其他各组进行21 d的孤养结合CUMS制备大鼠抑郁模型。用旷场实验和Morris水迷宫实验观察大鼠行为学变化;用透射电镜观察海马神经细胞超微结构变化;用TUNEL染色法观察海马神经细胞凋亡情况;用Western Blot法检测海马组织IRE1α、磷酸化(P)-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达水平;用Real-Time PCR法检测海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平。结果与正常组比较,模型组旷场实验中水平运动和垂直运动得分下降(P<0.01);水迷宫实验中逃避潜伏期增加、跨越原平台次数减少(P<0.01);海马神经细胞凋亡数增加(P<0.01);海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平升高、Bcl-2蛋白及mRNA表达水平降低(P<0.01)。与模型组比较,酸枣仁-合欢花各组及文拉法辛组旷场实验中水平运动和垂直运动得分升高(P<0.01);水迷宫实验中逃避潜伏期缩短、跨越原平台次数增加(P<0.01);海马神经细胞凋亡数减少(P<0.01);海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达水平降低,Bcl-2蛋白及mRNA表达水平升高(P<0.05,P<0.01),且酸枣仁-合欢花中剂量组较高、低剂量组效果更好。结论酸枣仁-合欢花可能通过调节内质网应激IRE1α/ASK1/JNK通路发挥抗抑郁作用。

槲皮素通过介导JNK信号通路抑制线粒体凋亡途径的神经保护作用

目的研究槲皮素(quercetin,Que)通过调节JNK信号通路抑制Aβ25-35引起PC12细胞线粒体损伤的作用机制。方法培养PC12细胞,使用Aβ25-35诱导其构建阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)受损模型,Que、17β-雌二醇(17β-E2)和金雀异黄素(genistein,Gen)进行干预,并设定SP600125(JNK特异性抑制剂)预处理组。Fluo-4 AM染料荧光检测PC12细胞钙离子;Rhodamine123染色液检测PC12细胞线粒体膜电位;Caspase-3活性检测Caspase-3酶活性;免疫荧光检测p-JNK蛋白表达;Western blot法检测ERα、ERβ、p-JNK、JNK、Bcl-W、Bim和Cytochrome C蛋白表达。并使用雌激素受体α/β拮抗剂MPP/PHTPP和SP600125进行干预,探讨Que发挥神经保护介导的分子机制。结果与Aβ25-35组相比,Aβ25-35+Que组能提高线粒体膜电位(P<0.01);降低钙离子浓度(P<0.01)。免疫荧光、Caspase-3检测和Western blot结果显示,与Aβ25-35组相比,Que可以逆转Aβ25-35诱导的ERα表达降低(P<0.01),当加入MPP抑制Que与雌激素受体α结合后,Caspase-3表达增加(P<0.05);Que抑制p-JNK表达(P<0.01);降低促凋亡蛋白Bim的表达(P<0.01),减少Cyt C的释放(P<0.01),促进抗凋亡蛋白Bcl-W的表达(P<0.01),当加入SP600125后,Que对Bcl-W、Bim和Cyt C的作用和SP600125对Aβ25-35诱导PC12细胞线粒体凋亡途径的保护作用机制相同(P<0.01)。结论Que可通过介导JNK信号通路抑制线粒体凋亡,进而发挥神经保护作用。

姜黄素通过抑制JNK介导的炎症缓解慢性束缚应激诱导的大鼠心脏功能障碍

目的:探讨姜黄素对慢性束缚应激抑郁模型大鼠心功能障碍的影响。方法:将32只重(200±20)g的6周龄雄性Wister大鼠分为对照组、模型组、低剂量姜黄素组和高剂量姜黄素组,每组8只。模型组和给药组大鼠每天随机时段给予慢性束缚应激5 h,对照组大鼠正常条件饲养;在每天的应激结束后,低、高剂量姜黄素组大鼠分别给予100和200 mg/kg的姜黄素灌胃,对照组和模型组大鼠则给予等体积的生理盐水。上述实验操作均连续28 d。实验期间每周称量一次体重;在第14和28天进行蔗糖偏好实验和测量血清皮质酮含量来评价大鼠的抑郁状况;HE和Masson染色法观察心肌组织学变化;超声心动图检查各组大鼠心脏功能;RT-qPCR检测炎症因子和纤维化因子的mRNA表达;Western blot检测相关蛋白的表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠体重增长显著减缓(P<0.05),蔗糖偏好率显著降低(P<0.01),血浆皮质酮水平显著升高(P<0.01);HE染色结果显示,与对照组相比,模型组大鼠心肌细胞肥大;Masson染色发现,模型组大鼠心脏纤维化显著高于对照组(P<0.01);免疫组化结果也表明,I型胶原阳性表达显著增加(P<0.01);RT-qPCR结果显示,与对照组相比,模型组大鼠心肌组织中炎症因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6和白细胞介素1β)和纤维化因子(α-平滑肌肌动蛋白、I型胶原和III型胶原)表达水平均显著升高(P<0.05或P<0.01);Western blot结果显示,与对照组相比,模型组大鼠心肌组织中c-Jun氨基末端激酶(JNK)蛋白的磷酸化水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比,低、高剂量姜黄素均可逆转上述指标。结论:姜黄素能抑制慢性束缚应激大鼠的心脏炎症和纤维化,其机制可能是通过抑制JNK信号通路实现的。

隐丹参酮通过TLR4/NF-κB/JNK信号通路减轻脂多糖对肺泡上皮细胞炎性损伤的作用研究

目的 本研究旨在探讨隐丹参酮(CTS)对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞(MLE-12)的影响。方法 通过CCK-8法检测细胞活力,酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q-PCR)检测IL-1β、IL-6、TNF-α含量及基因表达水平,筛选出具有最佳造模效果的LPS浓度;之后通过CCK-8考察CTS对细胞的非毒性剂量范围;将试验分为对照组、LPS组和CTS+LPS组3个组,ELISA检测细胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,qPCR检测细胞内IL-1β、IL-6、TNF-α、Bax和Bcl-2基因表达水平,Western Blot检测Bax、Bcl-2、TLR4、p-p65和p-JNK蛋白水平。结果 与对照组相比,LPS浓度≥1.0μg/mL时细胞活力显著下降(P<0.01);2.0和5.0μg/mL LPS组IL-1β、IL-6和TNF-α含量及基因表达水平显著上升(P<0.05);CTS浓度为0~5.0μM时,细胞活力无显著变化(P>0.05),即药物的无毒范围。与LPS组相比,CTS+LPS组IL-1β、IL-6和TNF-α含量及基因表达水平显著下降(P<0.05);CTS+LPS组Bax蛋白及基因表达水平显著下降(P<0.01)、Bcl-2蛋白及基因表达水平显著上升(P<0.05)。另外,与对照组相比,LPS组TLR4、p-p65、p-JNK蛋白水平显著上升(P<0.01);与LPS组相比,CTS+LPS组TLR4、p-p65、p-JNK蛋白水平显著下降(P<0.01)。结论 CTS可能通过抑制TLR4/NF-κB/JNK信号通路减轻LPS诱导的MLE-12细胞炎性损伤作用。

肉苁蓉苷A通过JNK/MAPK通路抑制破骨细胞活性

背景:研究证实肉苁蓉苷A具有抗炎、抗氧化和抗骨质疏松的作用,但其对破骨细胞分化和功能的影响及潜在的机制尚缺少研究。目的:探讨肉苁蓉苷A对核因子κB受体活化因子配体诱导的体外破骨细胞分化和骨吸收功能的影响及作用机制。方法:提取与培养4-6周龄C57BL/6小鼠股骨和胫骨中的骨髓巨噬细胞,采用CCK-8毒性实验检验不同浓度的肉苁蓉苷A(5,10,20,40,80,160μmol/L)对骨髓巨噬细胞的毒性,抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察不同浓度的肉苁蓉苷A干预破骨细胞的分化情况,确定药物的有效干预浓度。将实验分为阳性对照组、肉苁蓉苷A低、中、高剂量组(40,80,160μmol/L),细胞贴壁后各组均加入50 ng/mL的核因子κB受体活化因子配体诱导破骨细胞分化,肉苁蓉苷A低、中、高剂量组分别加入相应剂量的肉苁蓉苷A进行干预。采用肌动蛋白环鬼笔环肽染色和DAPI染色检测肉苁蓉苷A对破骨细胞形成的影响;骨磨片甲苯胺蓝染色观察肉苁蓉苷A对破骨细胞骨吸收功能的影响;Western blot检测JNK/MAPK通路上下游蛋白的表达情况;RT-qPCR检测抗酒石酸酸性磷酸酶、DC-STAMP、Nfatc-1、Ctsk和c-Fos等破骨细胞分化和骨吸收功能相关基因的表达情况。结果与结论:①抗酒石酸酸性磷酸酶染色、肌动蛋白环染色和骨陷窝甲苯胺蓝染色结果表明,与阳性对照组相比,肉苁蓉苷A对核因子κB受体活化因子配体诱导的体外破骨细胞的分化和骨吸收功能具有呈剂量依赖性的显著抑制作用;②RT-qPCR结果表明,与阳性对照组相比,肉苁蓉苷A高剂量组和低剂量组的抗酒石酸酸性磷酸酶、DC-STAMP、Nfatc-1、Ctsk和c-Fos等的mRNA表达量均显著降低,且肉苁蓉苷A高剂量组的降低效果更加显著;③Western blot结果显示,高剂量肉苁蓉苷A干预10,20,30和60 min时显著抑制p-JNK蛋白的表达;与阳性对照组相比,肉苁蓉苷A低、中、高剂量组显著抑制Nfatc1和c-Fos蛋白的表达,且呈剂量依赖性;④结果说明,肉苁蓉苷A能够通过降低p-JNK蛋白水平,抑制MAPK通路的激活和破骨细胞关键基因的表达,进而抑制破骨细胞的形成和骨吸收功能。

地红方通过miR-133b/DUSP1/JNK通路干预糖尿病肾病氧化应激损伤

目的研究地红方对糖尿病肾病细胞模型氧化应激损伤的影响。方法地红方含药血清制备,小鼠肾小球系膜细胞常规培养、传代。按以下分组:对照组(5.5mmol/L葡萄糖+正常血清)、高糖组(30mmol/L葡萄糖+正常血清)、地红方低剂量组(30mmol/L葡萄糖+5%地红方含药血清)、地红方中剂量组(30mmol/L葡萄糖+10%地红方含药血清)、地红方高剂量组(30mmol/L葡萄糖+20%地红方含药血清)。采用实时荧光定量PCR检测miR-133b、DUSP1 mRNA表达。Western blotting检测DUSP1、p-JNK、Drp1、Fis1蛋白表达。Elisa检测SOD、MDA表达。结果与高糖组比较,地红方组miR-133b、MDA、p-JNK、Drp1、Fis1表达明显下降(P<0.05),而DUSP1、SOD表达显著升高(P<0.05)。结论地红方可通过miR-133b/DUSP1/JNK通路调控线粒体分裂改善糖尿病肾病氧化应激损伤。

金雀根、黄芪及其配伍对糖尿病肾脏疾病大鼠JNK/SAPK信号通路的影响

目的探究金雀根、黄芪及其配伍对糖尿病肾脏疾病(DKD)模型大鼠肾脏保护作用及机制。方法将60只SD大鼠随机分为正常组、模型组、恩格列净组(10 mg/kg)、金雀根组(3.1 g/kg)、黄芪组(3.1 g/kg)、金雀根加黄芪组(6.2 g/kg),除正常组外,各组大鼠行左侧肾摘除手术并腹腔注射链脲佐菌素(STZ,35 mg/kg)建立DKD模型,各组分别给予相应药物灌胃8周。期间定期检测FBG、24 h尿微量蛋白(24 h U-mAlb)。给药8周后处死大鼠,检测Scr、BUN、Cystatin C水平,HE、PAS、Masson染色观察肾组织病理改变,免疫组织化学法检测巨噬细胞标志蛋白CD68、iNOS表达,Western blot法检测肾组织JNK/SAPK通路蛋白JNK、p-JNK和TNF-α、IL-1β、ICAM-1表达,ELISA法检测血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平。结果与正常组比较,模型组大鼠FBG、24 h U-mAlb、BUN、Scr、Cystatin C水平均升高(P<0.01),肾组织出现病理损伤,肾组织和血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平升高(P<0.01),肾组织JNK和p-JNK蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠FBG、24 h U-mAlb、BUN、Scr、Cystatin C水平均降低(P<0.05,P<0.01),肾组织病理损伤减轻,肾组织和血清TNF-α、IL-1β、ICAM-1水平降低(P<0.01),肾组织JNK和p-JNK蛋白表达降低(P<0.01);金雀根组与黄芪组比较各指标均无明显变化(P>0.05);与金雀根组或黄芪组比较,金雀根加黄芪组各指标均有不同程度的改善(P<0.05,P<0.01)。结论金雀根、黄芪及其配伍可改善DKD大鼠肾功能,抑制M1型巨噬细胞,减少炎症因子分泌,减轻肾脏病理损伤,其机制可能与抑制JNK/SAPK信号通路激活有关,金雀根与黄芪配伍药效较好。

Tip60-FOXO调节果蝇JNK信号通路介导的细胞凋亡

JNK信号通路参与并调控了一系列重要的生理活动,包括细胞增殖、分化、迁移、凋亡及应激反应等,其失调与发育缺陷和肿瘤等多种重大疾病的发生与发展密切相关。筛选鉴定JNK信号通路的新成员,丰富完善该通路网络,对预防和治疗相关癌症具有重要的科学意义和临床价值。本研究利用模式动物果蝇(Drosophila),结合遗传学、发育生物学、生物化学和分子生物学等手段,探究了Tip60与JNK信号通路的互作关系,并揭示了其调控机制。结果表明,Tip60的乙酰基转移酶功能缺失导致JNK信号通路激活,并能诱发JNK依赖的细胞凋亡;遗传上位性分析实验表明,Tip60作用于JNK蛋白的下游,与转录因子FOXO平行;生化结果证明Tip60可以结合FOXO,并将其乙酰化。在果蝇中引入人Tip60,发现其能够很好地挽救果蝇JNK信号激活造成的细胞凋亡表型,证明Tip60对JNK信号的调控从果蝇到人高度保守。本研究进一步完善了JNK信号网络,揭示了Tip60在JNK依赖的细胞凋亡中的作用及机制,为相关癌症的预防和治疗提供了新的思路和潜在的药物靶点。

JNK/CCl2通路诱导巨噬细胞募集并促进PM(2.5)颗粒物暴露诱导的幼年大鼠过敏性气道炎症

目的:基于JNK/CCl2信号通路诱导的巨噬细胞募集探讨PM(2.5)暴露对幼年大鼠气道炎症的作用及其机制。方法:幼年SD大鼠50只,随机分为5组(n=10),其中对照组不进行任何处理,PM(2.5)组幼年大鼠接受PM(2.5)颗粒物暴露,PM(2.5)+茴香霉素组幼年大鼠接受PM(2.5)暴露以及静脉注射JNK的激活剂茴香霉素,PM(2.5)+SP600125组幼年大鼠接受PM(2.5)暴露以及静脉注射JNK拮抗剂SP600125,PM(2.5)+吡非尼酮组幼年大鼠接受PM(2.5)暴露以及静脉注射CCl2拮抗剂吡非尼酮。安乐死幼年大鼠取肺组织,Western blot法检测JNK、磷酸化的JNK(p-JNK)和CCl2的蛋白表达水平变化,用苏木精-伊红(HE)染色检测肺部气道组织的病理变化并进行肺支气管炎症评分。流式细胞术分析肺泡灌洗液中巨噬细胞含量的变化。ELISA检测各组幼年大鼠的肺泡灌洗液中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。结果:各组间JNK、p-JNK、CCl2的表达水平(F=205.296、950.408、260.019;均P<0.001),巨噬细胞含量(F=48.414;P<0.001),肺支气管炎症评分(F=101.703;P<0.001)以及IL-6(H=44.890;P<0.001)、IL-1β(H=42.071;P<0.001)、TNF-α(F=297.154;P<0.001)的水平差异均有统计学意义。与对照组相比,PM(2.5)组JNK/CCl2通路蛋白JNK、p-JNK、CCl2的表达上调(均P<0.05),同时巨噬细胞含量增加(P<0.05),肺支气管炎症评分升高(P<0.05),IL-6、IL-1β、TNF-α水平上调(均P<0.05)。与PM(2.5)组相比,PM(2.5)+茴香霉素组中巨噬细胞含量均上调(P<0.05),肺支气管炎症评分升高(P<0.05),另外IL-6、IL-1β、TNF-α的水平升高(均P<0.05),且JNK、p-JNK、CCl2的表达水平升高(均P<0.05)。与PM(2.5)组相比,PM(2.5)+SP600125组、PM(2.5)+吡非尼酮组的巨噬细胞含量均下调(P<0.05),且肺支气管炎症评分降低(P<0.05),另外IL-6、IL-1β、TNF-α的水平均下调(均P<0.05)。与PM(2.5)组相比,PM(2.5)+SP600125组的JNK、p-JNK、CCl2的表达水平下调(均P<0.05),PM(2.5)+吡非尼酮组的CCl2的表达水平下调(均P<0.05)。结论:JNK/CCl2通路诱导巨噬细胞募集促进PM(2.5)颗粒物暴露诱导的幼年大鼠过敏性气道炎症。

青藤碱在JNK/c-Jun信号通路中对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡和自噬的影响

目的:探究青藤碱(SIN)通过JNK/c-Jun信号通路对LPS诱导的肺上皮细胞凋亡和自噬的影响。方法:培养肺上皮细胞MLE-12,通过CCK-8检测SIN的毒性。流式细胞术检测细胞凋亡,免疫荧光检测自噬体形成数量,Western blot检测细胞中凋亡、自噬以及JNK/c-Jun信号通路相关蛋白表达水平。结果:LPS造模后,细胞凋亡率和自噬体数量升高,Cleaved caspase-3、Bax和Beclin-1蛋白水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p-JNK/JNK和p-c-Jun/c-Jun均升高(P<0.05);Bcl-2、P62蛋白水平均降低(P<0.05)。SIN处理可明显改善LPS对细胞凋亡和自噬的影响,以及对JNK/c-Jun信号通路的调控(P<0.05)。细胞自噬抑制剂3-MA或JNK激动剂ANISO处理均可部分逆转SIN对LPS诱导的肺上皮细胞的保护作用(P<0.05)。结论:SIN可通过调控JNK/c-Jun信号通路相关蛋白提高细胞自噬,保护被LPS损伤的肺上皮细胞。

转染DPP-4 siRNA或(和)加入SP600125的小鼠肺泡巨噬细胞极化及JNK/AP-1信号通路激活情况观察

目的观察转染二肽基肽酶-4(DPP-4)siRNA或(和)加入c-Jun N-末端激酶(JNK)抑制剂(SP600125)的小鼠肺泡巨噬细胞极化情况、JNK/AP-1信号通路激活情况。方法体外培养小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S),并随机分组:Control组转染空载siRNA、siDPP-4组转染DPP-4 siRNA、LPS组转染空载siRNA+LPS、siDPP-4+LPS组转染DPP-4 siRNA+LPS、LPS+SP600125组转染空载siRNA+LPS联合SP600125、siDPP-4+LPS+SP600125组转染DPP-4 siRNA+LPS联合SP600125。采用Western boltting法检测巨噬细胞中M1型和M2型极化标志物CD86、CD206蛋白及JNK、激活蛋白-1(AP-1)转录蛋白(c-Jun、c-Fos)磷酸化,RT-qPCR法检测巨噬细胞中M1型标志物(CD86、TNF-α、iNOS、IL-1β)和M2型标志物[CD206、精氨酸激酶-1(ARG-1)、IL-4、IL-10]mRNA,一氧化氮(NO)测定试剂盒、免疫荧光检测巨噬细胞上清液中M1型促炎因子NO和细胞内活性氧(ROS)生成情况。结果与Control组比较,LPS组M1型促炎型因子NO、ROS生成含量及M1型极化标志物(CD86蛋白及CD86、TNF-α、iNOS、IL-1βmRNA)表达升高,M2型极化标志物(CD206蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA)表达降低,P均<0.05。与LPS组比较,siDPP-4+LPS组M1型促炎型因子NO、ROS生成含量及M1型极化标志物(CD86蛋白及CD86、TNF-α、iNOS、IL-1βmRNA)表达升高,M2型极化标志物(CD206蛋白及CD206、ARG-1、IL-4、IL-10 mRNA)表达降低,P均<0.05。与LPS组比较,siDPP-4+LPS组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相对表达量升高,P均<0.05。与siDPP-4+LPS组比较,siDPP-4+LPS+SP600125组p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos蛋白磷酸化相对表达量降低,P均<0.05。结论转染DPP-4 siRNA可促进LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化,抑制肺泡巨噬细胞M2型极化,并增加JNK、c-Jun、c-Fos蛋白磷酸化表达;加入JNK抑制剂后,可降低由转染DPP-4 siRNA引起的JNK、c-Jun、c-Fos蛋白磷酸化表达升高。转染DPP-4 siRNA促进LPS诱导的小鼠肺泡巨噬细胞M1型极化的作用机制可能与激活JNK/AP-1信号通路有关。

JNK信号通路在过敏性鼻炎中研究现状

过敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是一种主要由免疫球蛋白E(IgE)诱导以鼻塞、流鼻涕和鼻痒为主要症状的鼻部炎症反应性疾病。机制是特应性个体接触变应原后,由IgE介导的介质释放,并在多种免疫活性细胞和细胞因子等参与后,导致鼻黏膜出现非感染性炎症反应。c-Jun氨基末端激(c-Jun N-terminal kinase,JNK)家族是MPK家族中的一部分,JNK信号转导通路可以在多种环境条件,比如细胞因子、生长因子和压力等情况下被激活。JNK对应激反应、细胞凋亡、细胞增殖与分化等方面起到关键作用。经研究证实JNK和许多疾病之间存在紧密的关系。JNK的信号转导通路能够促进大量炎症细胞产生,在哮喘的发病过程中起着关键作用,研究表明,哮喘和AR属于“一气一道”疾病,所以JNK的信号通路在AR中也可能发挥着重要作用。经过探索,AR模型小鼠体内的JNK磷酸化水平在AR小鼠体内呈现出高度的增长,这提示JNK信号通路对AR的发展起到了调控作用。该文就近年来JNK信号通路参与AR机制研究进展及中医药干预AR的研究进展进行综述。

益生菌通过调节ROS/JNK信号通路在代谢相关脂肪性肝病治疗中的作用及机理研究

目的探讨益生菌通过调节ROS/JNK信号通路在代谢相关脂肪性肝病治疗中的作用和机制。方法选取18只C57BL/6雄性小鼠,随机分成模型组(n=6)、对照组(n=6)及益生菌组(n=6)。给予模型组及益生菌组小鼠MCD饮食来构建代谢相关脂肪性肝病(MAFLD)小鼠模型,对照组小鼠喂养MCS饮食,益生菌组小鼠以益生菌灌胃,每天灌胃一次,每次0.5 mL,模型组和对照组予以等量生理盐水灌胃,连续灌胃4周。益生菌治疗4周后将小鼠麻醉处死,检测各组小鼠血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)、血浆D-乳酸(D-Lac)、血清及小肠二胺氧化酶(DAO)水平变化情况。选取肝脏及回肠组织切片后行HE染色。同时检测各组小鼠肝组织中活性氧(ROS)水平。使用免疫印迹技术检测各组小鼠ROS/JNK信号通路相关蛋白表达情况,如磷酸化c-Jun氨基末端激酶(P-JNK)、B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白(Bax)、紧密连接蛋白ZO-1、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(Caspase-3)。使用免疫组化技术检测各组小鼠ROS/JNK信号通路相关蛋白表达情况,如P-JNK、Caspase-3、Bax的表达水平。使用PCR检测各组小鼠Bax、Caspase-3的mRNA表达。结果肝脏HE染色病理学结果分析:喂养C57BL/6小鼠MCD饮食4周后通过HE染色观察肝小叶结构紊乱,肝细胞内可见脂滴沉积并伴有严重的炎性细胞浸润,证明成功建立MAFLD动物模型。益生菌治疗4周后,与模型组相比,益生菌组小鼠肝小叶结构变得完整,肝细胞内脂肪变性和炎性细胞浸润减少。生化结果分析:C57BL/6小鼠喂养MCD饮食后,模型组小鼠血清中血脂(TC、TG)及转氨酶(ALT、AST)、血浆D-Lac、血清及小肠DAO和肝组织中ROS水平较对照组明显增高。而在使用益生菌治疗4周后,与模型组小鼠相比,益生菌组小鼠的血清TC、TG、ALT、AST、血浆D-Lac、血清及小肠DAO和肝脏中ROS水平均明显下降(P<0.05)。Western blot结果分析:C57BL/6小鼠喂养MCD饮食后,与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏P-JNK、Caspase-3、Bax表达水平明显增加,肠道ZO-1的表达水平明显降低;而使用益生菌治疗4周后,与模型组小鼠相比,益生菌组小鼠肝脏P-JNK、Caspase-3、Bax的表达水平降低,而ZO-1的表达水平增加(P<0.05)。PCR结果分析:C57BL/6小鼠喂养MCD饮食后,模型组小鼠Bax、Caspase-3的mRNA表达水平较对照组明显增加;而益生菌治疗后,与模型组相比,益生菌组小鼠Bax、Caspase-3的mRNA表达降低(P<0.05)。免疫组化结果分析:C57BL/6小鼠喂养MCD饮食后,模型组小鼠肝脏P-JNK、Caspase-3、Bax的表达水平较对照组升高;在使用益生菌治疗后,与模型组相比,益生菌组小鼠肝脏P-JNK、Caspase-3、Bax的表达水平降低(P<0.05)。小肠HE染色病理学结果分析:对照组小鼠的回肠粘膜结构正常,无充血水肿、溃疡、剥脱。与对照组相比,模型组小鼠的回肠粘膜结构严重破坏,肠粘膜出现水肿、溃疡、剥脱现象。使用益生菌干预后,益生菌组小鼠肠粘膜结构变得较为完整,肠粘膜无明显水肿、溃疡、剥脱,见图。相较于对照组,模型组小鼠回肠黏膜Chiu氏病理评分更高。使用益生菌干预后,相较于模型组,益生菌组小鼠回肠黏膜Chiu氏病理评分降低(P<0.05)。结论ROS、P-JNK、Caspase-3、Bax在MAFLD中表达增加,表明其与MAFLD的发病有关。使用益生菌治疗后可以明显改善MAFLD的组织学及血清学相关指标。Western blot、PCR及免疫组化结果都证实益生菌能通过调节ROS/JNK信号通路相关因子表达,减轻氧化应激从而抑制细胞凋亡达到治疗MAFLD的目的。

SFRP5通过抑制Wnt5a/JNK通路减轻缺血性心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡和心肌纤维化

目的探讨分泌卷曲相关蛋白5(SFRP5)对缺血性心力衰竭(IHF)大鼠心肌细胞凋亡和心肌纤维化的影响及相关作用机制。方法40只SD雄性大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(IHF组)、SFRP5组、SFRP5+Wnt5a激动剂组(SFRP5+Foxy-5组),每组10只。采用超声心动图检测大鼠心功能指标;HE染色、Masson染色观察大鼠心肌病理学改变;TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡;免疫组织化学染色观察大鼠心肌组织纤连蛋白(Fn)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)阳性表达情况;Western blot法检测大鼠心肌组织SFRP5蛋白、无翅型MMTV整合位点家族成员5a(Wnt5a)/c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路蛋白表达。结果与Sham组比较,IHF组大鼠心功能指标左室舒张末期内径(LVEDd)、左室收缩末期内径(LVDs)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)均增加,左室射血分数(LVEF)和左心室短轴缩短率(LVFS)均下降(P<0.05);心肌组织存在明显病理改变,心肌纤维化面积增加,心肌细胞凋亡率升高,心肌组织Fn、α-SMA和Cleaved Caspase-3阳性表达均增多(P<0.05);心肌组织SFRP5蛋白表达下降,Wnt5a蛋白表达、p-JNK/JNK比值均升高(P<0.05)。与IHF组相比,SFRP5组大鼠心功能指标和心肌损伤均得到改善,心肌纤维化面积减少,心肌细胞凋亡率降低,心肌组织Fn、α-SMA和Cleaved Caspase-3阳性表达均减少(P<0.05);心肌组织SFRP5蛋白表达升高,Wnt5a蛋白表达、p-JNK/JNK比值均下降(P<0.05)。与SFRP5组比较,SFRP5+Foxy-5组大鼠心功能指标异常,心肌损伤加重,心肌纤维化面积增加,心肌细胞凋亡率升高,心肌组织Fn、α-SMA和Cleaved Caspase-3阳性表达均增多(P<0.05);心肌组织Wnt5a蛋白表达、p-JNK/JNK比值均升高(P<0.05)。结论SFRP5可能通过抑制Wnt5a/JNK信号通路减轻心肌细胞凋亡和心肌纤维化,从而改善大鼠IHF。

基于JNK/p38 MAPK信号通路探讨黄芪对阿尔茨海默病大鼠认知功能的影响

目的:基于JNK/p38 MAPK信号通路探讨黄芪对阿尔茨海默病大鼠认知功能的影响。方法:将60只Wistar大鼠作为本研究对象,以其中的15只列为对照组,剩余大鼠分为模型组(15只)、西药治疗组(15只)、黄芪治疗组(15只),各予以0.9%NaCl用药处理、盐酸多奈哌齐治疗、黄芪甲苷治疗。对比四组大鼠各方面的变化情况。结果:对照组JNK、p38 MAPK表达量均低于其余三组,且黄芪治疗组JNK、p38 MAPK表达量均低于模型组和西药治疗组,差异具有显著性(P<0.05);对照组各炎性因子水平均低于其余三组,且黄芪治疗组各炎性因子水平均低于模型组和西药治疗组(P<0.05);对照组Morris水迷宫实验第2、3、4d的结果均优于其他三组,且黄芪治疗组Morris水迷宫实验第2、3、4d的结果均优于模型组和西药治疗组,差异具有显著性(P<0.05);对照组新物体识别(NOR)实验中的测试期总探索时间均短于其他三组,新物体偏爱指数均高于其他三组;且黄芪治疗组新物体识别(NOR)实验中的测试期总探索实践均短于模型组和西药治疗组,新物体偏爱指数均高于模型组和西药治疗组,差异具有显著性(P<0.05)。结论:黄芪治疗对于改善阿尔茨海默大鼠的认知功能具有优势,其药物作用机制与JNK/p38 MAPK信号通路存在一定联系。

白藜芦醇抑制海马组织NF-κB/JNK通路改善严重烧伤大鼠认知功能

目的探讨白藜芦醇(RSV)对严重烧伤大鼠认知功能的改善作用及其可能的机制。方法将雄性SD大鼠,随机分为对照组、模型组和RSV组,每组6只。建模成功后,RSV组大鼠每日灌胃20 mg/kg的RSV,对照组和模型组每日灌胃等体积的生理盐水溶液。4周后,跳台实验检测大鼠认知功能;ELISA检测大鼠血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)含量;实时定量PCR和Western blot法分别检测海马组织中TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白的表达;原位末端转移酶标记技术(TUNEL)检测海马神经细胞凋亡情况;Western blot法检测海马组织中核因子κB/c-Jun N-氨基末端激酶(NF-κB/JNK)通路相关蛋白表达情况。结果与模型组大鼠相比,RSV组大鼠认知功能提高,大鼠血清TNF-α和IL-6含量明显降低,海马组织中TNF-α、IL-6 mRNA及蛋白表达降低,海马神经元凋亡率降低,磷酸化的NF-κB p65/NF-κB p65(p-NF-κB p65/NF-κB p65)、p-JNK/JNK比值降低。结论RSV通过阻断NF-κB/JNK信号通路,抑制炎症反应和海马神经元凋亡,从而改善严重烧伤大鼠认知功能。