基于MEK/ERK通路研究桂枝茯苓丸改善慢性阻塞性肺疾病小鼠气道重塑的作用与机制

目的:研究桂枝茯苓丸通过丝裂原活化细胞外信号调节蛋白激酶(MEK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路改善慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠气道重塑的作用与机制。方法:采用烟熏的方法建立COPD小鼠模型,将32只造模成功小鼠随机分为模型组、桂枝茯苓丸组、PD98059组和桂枝茯苓丸+PD98059组,每组8只。另取8只未烟熏的小鼠为空白组。各组予相应药物灌胃14 d。采用小动物肺功能仪测定小鼠每分钟通气量(MV)、呼气峰值流速(PEF)和吸气峰值流速(PIF),HE染色评估肺组织炎症,Masson染色观察气道重塑改变,Western blotting检测COL1A1、COL3A1、MEK1、p-MEK1、ERK(1/2)和p-ERK(1/2)蛋白相对表达量。结果:模型组小鼠MV、PIF和PEF水平均低于空白组(P<0.05)。与空白组比较,模型组小鼠肺组织出现明显炎症和气道重塑,且肺组织COL1A1、COL3A1、p-MEK1、p-ERK(1/2)、p-MEK/MEK和p-ERK(1/2)/ERK(1/2)均高于空白组(P<0.05)。桂枝茯苓丸组、PD98059组和桂枝茯苓丸+PD98059组小鼠MV、PEF、PIF水平均高于模型组(P<0.05),肺组织COL1A1、COL3A1、p-MEK1、p-ERK(1/2)、p-MEK/MEK和p-ERK(1/2)/ERK(1/2)均低于模型组(P<0.05)。与模型组比较,桂枝茯苓丸组、PD98059组和桂枝茯苓丸+PD98059组小鼠的肺组织炎症和气道重塑改善。桂枝茯苓丸+PD98059组小鼠MV、PIF、PEF水平高于桂枝茯苓丸组和PD98059组(P<0.05)。桂枝茯苓丸组小鼠MV、PIF和PEF水平与PD98059组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。桂枝茯苓丸组小鼠肺组织COL1A1和COL3A1蛋白相对表达量低于PD98059组(P<0.05),高于桂枝茯苓丸+PD98059组(P<0.05)。PD98059组小鼠肺组织COL1A1和COL3A1蛋白相对表达量高于桂枝茯苓丸+PD98059组(P<0.05)。桂枝茯苓丸组小鼠肺组织p-MEK1、p-ERK(1/2)、p-MEK1/MEK1和p-ERK(1/2)/ERK(1/2)低于PD98059组(P<0.05),高于桂枝茯苓丸+PD98059组(P<0.05)。PD98059组小鼠肺组织p-MEK1、p-ERK(1/2)、p-MEK1/MEK1和p-ERK(1/2)/ERK(1/2)高于桂枝茯苓丸+PD98059组(P<0.05)。结论:桂枝茯苓丸能显著改善COPD小鼠气道重塑过程,抑制MEK/ERK通路可能是其作用机制之一。

连翘脂素调节Ras/Raf/MEK/ERK信号通路对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 探究连翘脂素(PG)对结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及上皮间质转化的影响及机制。方法 培养HCT116结直肠癌细胞,采用10~200μmol/L的连翘脂素处理细胞,检测细胞存活率,筛选最佳实验浓度。将细胞分为对照组(Control组),连翘脂素低、中、高浓度组(PG-L组、PG-M组、PG-H组),连翘脂素高浓度+转染慢病毒阴性对照组(PG-H+NC组),连翘脂素高浓度+Ras慢病毒组(PG-H+Ras组)。平板克隆形成实验检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;Transwell小室法检测细胞侵袭;流式细胞术以及Hoechst33258染色法检测细胞凋亡;Western blot法检测上皮间质转化(EMT)标志蛋白E型钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)以及信号通路相关蛋白p-Raf、p-MEK、p-ERK表达;建立荷瘤小鼠模型评价连翘脂素对结直肠癌肿瘤生长的影响。结果 10~200μmol/L的连翘脂素处理HCT116结直肠癌细胞,可以显著抑制细胞存活率,经计算IC50值为(140.4±2.147)μmol/L,选择10、50、100μmol/L连翘脂素进行后续实验;与Control组比较,PG-L组、PG-M组、PG-H组HCT116细胞克隆形成率、划痕愈合率、细胞侵袭个数以及Vimentin、p-Raf、p-MEK、p-ERK表达显著降低,细胞凋亡率以及E-cadherin表达显著升高,且呈浓度依赖性(P<0.05);与PG-H+NC组比较,PG-H+Ras组HCT116细胞克隆形成率、划痕愈合率、细胞侵袭个数以及Vimentin、p-Raf、p-MEK、p-ERK表达显著升高,细胞凋亡率以及E-cadherin表达显著降低(P<0.05);连翘脂素可以显著抑制结直肠癌移植瘤的生长。结论 连翘脂素可以抑制结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及上皮间质转化,其作用机制可能与抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路激活有关。

基于Raf-MEK-ERK信号通路探究梓醇对蛛网膜下腔出血大鼠脑组织损伤的影响

[目的]通过考察梓醇对蛛网膜下腔出血(SAH)大鼠脑组织丝/苏氨酸蛋白激酶(Raf)-丝裂原活化蛋白激酶(MEK)-细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路的影响,探讨其抗SAH脑损伤的作用机制。[方法]将大鼠随机分为假手术组、SAH组、梓醇组、梓醇+U0126组(梓醇+Raf-MEK-ERK信号通路抑制剂U0126)。采用血管内穿孔法构建大鼠SAH模型,评估大鼠神经功能和SAH分级,伊文思蓝(EB)检测血脑屏障通透性,苏木素-伊红(HE)染色观察脑组织病理变化,免疫荧光染色检测神经元细胞凋亡及微管连接蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)、p-ERK阳性细胞表达,蛋白免疫印迹(Western blot)检测脑组织Raf、MEK、磷酸化(p)-MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、自噬基因Beclin-1、LC3-Ⅱ表达。[结果]与假手术组相比,SAH组神经元细胞排列松散,数目减少,SAH分级、脑组织含水量、EB渗出量、原位末端标(TUNEL)阳性细胞数显著增加,凋亡率、LC3-Ⅱ、p-ERK阳性表达、Bax、Beclin-1、LC3-Ⅱ、Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2表达显著升高,神经功能评分减少,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05);与SAH组相比,梓醇组神经元损伤明显减轻,细胞死亡较少,SAH分级、脑组织含水量、EB渗出量、TUNEL阳性细胞数显著减少,凋亡率、Bax显著降低,神经功能评分、Bcl-2表达升高,LC3-Ⅱ、p-ERK阳性表达及Beclin-1、LC3-Ⅱ、Raf、p-MEK/MEK、p-ERK1/2/ERK1/2表达进一步升高(P<0.05);Raf-MEK-ERK通路抑制剂U0126可逆转梓醇对脑组织损伤的改善作用(P<0.05)。[结论]梓醇可能通过激活Raf-MEK-ERK信号通路,促进神经细胞自噬,改善SAH大鼠脑损伤。

木蝴蝶苷A通过调控MEK/ERK信号通路对肝癌细胞增殖侵袭和上皮间质转化的机制研究

目的:探究木蝴蝶苷A通过调控MEK/ERK信号通路对肝癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化的机制。方法:将肝癌细胞HepG2分为Control组、OAL组、OAM组、OAH组、PD98059组和ML-099组。MTT法检测细胞增殖能力;Transwell小室法检测细胞侵袭能力;流式细胞仪检测细胞凋亡能力;蛋白质印迹法检测细胞中MEK.p-MEK、ERK.p-ERK蛋白及EMT相关蛋白表达。结果:OAL组、OAM组和OAH组细胞增殖和侵袭能力(82.34±2.43)、(61.04±1.61)、(32.44±1.04)均明显低于Control(110.42±3.86)组,细胞凋亡率(6.81±0.62)、(11.74±0.94)、(18.36±1.05)明显高于Control组(5.01±0.53)(F侵袭=1068,F凋亡=323.1,P<0.0001);细胞中上皮间质转化蛋白E-cadherin蛋白(0.42±0.04)、(0.58±0.05)、(0.97±0.09)高于Control组(0.23±0.03)(F=181.1,P<0.0001);上皮间质转化蛋白N-cadherin(0.63±0.06)、(0.51±0.05)、(0.38±0.03)、Vimentin蛋白(1.23±0.11)、(0.98±0.09)、(0.51±0.05)及p-MEK/MEK(0.72±0.07)、(0.51±0.05)、(0.32±0.03)和p-ERK/ERK(0.92±0.09)、(0.68±0.06)、(0.41±0.04)比值低于Control组(F_(N-cadherin)=39.04,F_(Vimentin)=111.0,F_(p-MEK/MEK)=107.8,F_(p-ERK/ERK)=82.68,P<0.0001)。PD98059组细胞增殖和侵袭能力(30.86±1.01)均明显低于Control组(t=48.84,P<0.0001),细胞凋亡能力(17.95±0.98)明显高于Control组(t=28.45,P<0.0001),细胞中上皮间质转化蛋白E-cadherin蛋白(0.92±0.09)明显高于Control组(t=17.82,P<0.0001),上皮间质转化蛋白N-cadherin(0.37±0.04)(t=9.585)、Vimentin蛋白(0.41±0.04)(t=19.99)及p-MEK/MEK(0.30±0.03)(t=16.78)、p-ERK/ERK(0.39±0.04)(t=14.65)比值均明显低于Control组(P<0.0001)。ML-099组细胞增殖和侵袭能力(100.86±2.68)均明显高于OAH组(t=12.54,P<0.0001),细胞凋亡能力(5.15±0.86)明显低于OAH组(t=23.84,P<0.0001);和OAH组相比,ML-099组细胞中上皮间质转化蛋白E-cadherin蛋白(0.25±0.03)明显减少(t=18.59,P<0.0001),上皮间质转化蛋白N-cadherin(0.69±0.07)(t=0.971,P<0.0001)、Vimentin蛋白(1.50±0.12)(t=18.65,P<0.0001)及p-MEK/MEK(0.94±0.09)(t=16.01,P<0.0001)、p-ERK/ERK(1.05±0.10)(t=2.367,P=0.0395)比值均明显升高。结论:木蝴蝶苷A可抑制肝癌细胞增殖、侵袭和上皮间质转化,诱导肝癌细胞凋亡,其机制和抑制MEK/ERK信号通路有关。

高三尖杉酯碱对白血病细胞凋亡、增殖的影响及对Ras/Raf/MEK通路的抑制作用

目的探讨高三尖杉酯碱(HHT)对白血病细胞凋亡、增殖的影响及对Ras/Raf/MEK通路的抑制作用。方法取对数生长期K562、Kasum-1细胞进行研究,分别用0、10、20、50 ng/ml的HHT处理。采用MTT检测相对细胞活力,计算24、48、72 h时细胞IC50,采用克隆形成实验检测检测细胞克隆数量,采用流式细胞仪检测细胞凋亡水平,采用蛋白质印迹法检测Ras/Raf/MEK通路蛋白和凋亡相关蛋白相对水平。结果24、48、72 h时HHT对K562细胞IC50分别为80.69、65.28、50.76 ng/ml,HHT对Kasum-1细胞IC50分别为85.16、70.11、51.14 ng/ml。培养24、48、72 h时,10、20、50 ng/ml HHT细胞存活率均低于0 ng/ml,20、50 ng/ml HHT细胞存活率均低于10 ng/ml,50 ng/ml HHT细胞存活率均低于20 ng/ml HHT,差异有统计学意义(P<0.05)。10、20、50 ng/ml HHT细胞克隆数均低于0 ng/ml,20、50 ng/ml HHT细胞克隆数均低于10 ng/ml HHT,50 ng/ml HHT细胞克隆数均低于20 ng/ml HHT,差异有统计学意义(P<0.05)。10、20、50 ng/ml HHT细胞凋亡率均高于0 ng/ml HHT,20、50 ng/ml HHT细胞凋亡率均高于10 ng/ml HHT,50 ng/ml HHT细胞凋亡率均高于20 ng/ml HHT,差异有统计学意义(P<0.05)。10、20、50 ng/ml HHT RAS、p-cRAF、p-MEK蛋白表达量均低于0 ng/ml HHT,20、50 ng/ml HHT RAS、p-cRAF、p-MEK蛋白表达量均低于10 ng/ml HHT,50 ng/ml HHT RAS、p-cRAF、p-MEK蛋白表达量均低于20 ng/ml HHT,差异有统计学意义(P<0.05)。10、20、50 ng/ml HHT Survivan蛋白表达量均低于0 ng/ml HHT,Cleaved caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达量均高于0 ng/ml HHT;20、50 ng/ml HHT Survivan蛋白表达量均低于10 ng/ml HHT,Cleaved caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达量均高于10 ng/ml HHT、50 ng/ml HHT Survivan蛋白表达量均低于20 ng/ml HHT,Cleaved caspase-3、Cleaved PARP蛋白表达量均高于20 ng/ml HHT,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HHT可抑制Ras/Raf/MEK通路活性,抑制白血病细胞增殖和促进白血病细胞凋亡。

多西环素通过MEK/ERK信号通路促进MC3T3-E1细胞株体外成骨分化

目的:研究在体外条件下多西环素(doxycycline,DOX)对前成骨细胞株MC3T3-E1成骨分化的影响及可能机制。方法:在成骨诱导剂体外诱导MC3T3-E1细胞株成骨分化条件下,茜素红染色检测成骨细胞分化;实时定量PCR检测DOX对MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的影响;用DOX、MEK抑制剂(U0126)单独或联合处理MC3T3-E1细胞后,Western blot检测N-cadherin、p-MEK及p-ERK等蛋白的表达。结果:在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中,加入DOX可以增强茜素红染色阳性率。DOX上调MC3T3-E1细胞相关成骨基因OCN、Runx2的表达。DOX处理MC3T3-E1细胞后,其N-cadherin蛋白表达水平下降(P<0.05),p-MEK和p-ERK蛋白的表达增加(P<0.05)。而MEK拮抗剂(U0126)则显著上调N-cadherin蛋白表达水平,同时降低p-MEK、p-ERK水平。用U0126联合DOX处理MC3T3-E1细胞后,DOX对N-cadherin、p-MEK和p-ERK蛋白水平的影响可被U0126拮抗。在MC3T3-E1细胞株体外成骨诱导分化中,同时存在DOX和U0126时,茜素红染色阳性率低于单独DOX组。结论:DOX可以促进MC3T3-E1细胞株的体外成骨分化;而DOX的这一效应可能是通过MEK-ERK信号通路参与完成的。

桑寄生总黄酮通过MEK/ERK通路对子痫前期大鼠肾脏的保护作用及对血管内皮功能的影响

目的探讨桑寄生总黄酮对子痫前期(Preeclampsia,PE)大鼠肾脏的保护作用及对血管内皮功能的影响,以及对丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(Mitogen extracellular signal regulated kinase,MEK)/细胞外信号调节激酶(Extracellular signal regulated kinase,ERK)信号通路的调节作用。方法将60只健康清洁级成熟期受孕雌性大鼠按照随机数字表法分为正常组、模型组、桑寄生总黄酮低剂量组、桑寄生总黄酮中剂量组和桑寄生总黄酮高剂量组,每组各12只。从受孕第1天开始桑寄生总黄酮各剂量组分别给予90 mg/kg、180 mg/kg和360 mg/kg桑寄生总黄酮溶液灌胃,1次/d,连续21 d。从受孕第10天开始,除正常组外,其余组大鼠皮下注射左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)125 mg/(kg·d),直至妊娠第19天。检测各组大鼠血压和24 h尿蛋白水平,放射免疫法测定血清前列腺环素(Vascular endothelial growth factor,VEGF)、血栓烷(Thromboxane B2,TXB2)和血浆内皮素-1(En⁃dothelin-1,ET-1)水平,采用ELISA法检测白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,HE染色观察肾组织病理损伤,蛋白印迹法检测p-MEK1/2/MEK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2比值。结果正常组大鼠肾小管和肾小球结构完整,未见空泡化;模型组大鼠可见肾小管上皮细胞出现空泡化,可见上皮细胞脱落;桑寄生总黄酮低、中和高剂量组大鼠肾组织病理改变较模型组减轻。与正常组比较,模型组大鼠血压和24 h尿蛋白水平、TXB2和ET-1水平以及IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高,VEGF水平以及p-MEK1/2/MEK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2比值降低,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,桑寄生总黄酮低、中和高剂量组大鼠血压和24 h尿蛋白水平、TXB2和ET-1水平以及IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低,VEGF水平以及p-MEK1/2/MEK1/2和p-ERK1/2/ERK1/2比值升高,差异有统计学意义(P<0.05),其中以桑寄生总黄酮高剂量组各指标变化最明显,其次为中剂量组和低剂量组。结论桑寄生总黄酮可改善子痫前期大鼠肾组织病理损伤,降低炎症反应,减轻血管内皮损伤,其可能是通过调控MEK/ERK信号通路发挥作用。

脑胶质瘤患者MEK及ERK m RNA水平与病理特征及预后的关系

目的 探讨脑胶质瘤(BG)患者丝裂原活化细胞外信号调节激酶(MEK)、细胞外信号调节激酶(ERK)m RNA水平与病理及预后的关系。方法 选取2018-03—2019-03长沙市第四医院和中南大学湘雅医院的92例BG患者经手术切除的脑胶质瘤组织标本为研究对象(研究组),所有患者随访3 a,根据预后情况分为死亡组(n=35)及生存组(n=57),另取同期行颅内减压术切除治疗的60例脑损伤患者的正常脑组织标本为对照组,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MEK、ERK mRNA水平,比较不同临床病理特征BG患者组织MEK、ERK mRNA水平,采用ROC曲线分析组织MEK、ERK mRNA水平对BG患者预后的预测价值。结果 研究组MEK、ERK mRNA水平高于对照组(P<0.05)。MEK、ERK mRNA水平与BG患者WHO分级、肿瘤直径、瘤周脑水肿有关(P<0.05),WHO分级Ⅲ~Ⅳ级、肿瘤直径≥3 cm、瘤周脑水肿严重的BG患者组织MEK、ERK mRNA水平更高(P<0.05)。死亡组MEK、ERK mRNA水平高于生存组(P<0.05)。由ROC曲线可知,组织MEK、ERK mRNA水平联合预测BG患者预后的AUC为0.856,高于两者单独预测的0.779、0.763(P<0.05)。结论 BG患者组织MEK、ERK m RNA水平呈高表达,不同临床病理特征患者MEK、ERK mRNA水平存在差异,两者有望成为BG患者预后的预测指标。

miRNA-24靶向调控MEK/ERK信号通路对乳腺癌转移的作用

目的探讨miRNA-24(miR-24)靶向调控MEK/ERK信号通路对乳腺癌转移的作用。方法体外培养乳腺癌(BC)细胞系MCF-7、MDA-MB-231细胞以及非肿瘤性人乳房上皮细胞系H184B5F5/M10细胞,采用qPCR方法检测各细胞中miR-24的表达水平。将MCF-7细胞分为正常组、miRNA阴性对照组(miR-24-NC组)和miR-24抑制剂组,采用CCK8、伤口愈合试验和TUNEL检测细胞活力、迁移和凋亡情况,采用蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白和MEK/ERK通路相关蛋白的表达水平。结果miR-24在MCF-7和MDA-MB-231细胞中的表达水平显著高于H184B5F5/M10细胞(P<0.05)。与miR-24-NC组相比,miR-24抑制剂组抑制了细胞的活力和迁移(P<0.05),促进了细胞的凋亡(P<0.05);其凋亡蛋白Bcl-2显著降低(P<0.05),Bax、caspase-3和caspase-9显著升高(P<0.05);同时降低了MEK/ERK信号通路的表达(P<0.05)。结论乳腺癌细胞中miR-24表达升高,并且通过调控MEK/ERK信号通路促进乳腺癌的转移。

苁归益肾胶囊对糖尿病肾病大鼠肾纤维化及MEK/ERK信号通路的影响

目的:探讨苁归益肾胶囊对糖尿病肾病(DKD)大鼠肾脏纤维化及丝裂原细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶(MEK/ERK)信号通路的影响。方法:高脂饲料联合小剂量链尿佐菌素(STZ)诱导DKD大鼠模型,造模成功后随机分为模型组、厄贝沙坦组及苁归益肾胶囊高、中、低剂量组,分别予0.9%氯化钠溶液5 ml/kg、厄贝沙坦15mg/kg及苁归益肾胶囊1080、540、270mg/kg灌胃,空白组大鼠予0.9%氯化钠溶液5ml/kg灌胃,连续灌胃12周后收集标本。检测大鼠空腹血糖(FPG)、尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、24h尿蛋白定量(24 hUP)水平,HE及Masson染色观察肾脏组织形态改变,Western blot检测肾脏组织转化生长因子β1(TGF-β1)、MEK、磷酸化丝裂原细胞外信号调节激酶(p-MEK)、ERK、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)蛋白水平。结果:药物干预12周后,模型组、厄贝沙坦组、苁归益肾胶囊各剂量组FPG、BUN、Scr和24hUP均比空白组高(P<0.05);相较于模型组,苁归益肾胶囊高、中剂量组FPG降低(P<0.05),厄贝沙坦组、苁归益肾胶囊各剂量组BUN、Scr、24 hUP降低(P<0.05);HE染色结果显示,相较空白组,各造模组大鼠肾脏组织均有病理改变,各药物干预组肾脏病理改变与模型组相比有不同程度的改善。Masson染色显示模型组与各药物干预组肾脏胶原纤维增生情况较空白组严重,经药物干预的各组肾脏组织纤维化程度比模型组轻。模型组及各药物干预组TGF-β1表达量,MEK、ERK磷酸化水平较空白组明显升高(P<0.05),厄贝沙坦组及苁归益肾胶囊高、中剂量组TGF-β1表达量,MEK、ERK磷酸化水平比模型组低(P<0.05)。结论:苁归益肾胶囊能够缓解肾脏纤维化程度,可能是通过抑制TGF-β1介导的MEK/ERK信号通路活化发挥作用。

祛风宣痹方对哮喘大鼠气道炎症及MEK/ERK信号通路的影响

目的观察祛风宣痹方对哮喘大鼠气道炎症及MEK/ERK信号通路的影响,探讨其改善哮喘的作用机制。方法将18只SD大鼠随机分为对照组、哮喘组和祛风宣痹方组,每组6只,采用卵清蛋白诱导哮喘模型,祛风宣痹方组予祛风宣痹方灌胃,对照组和哮喘组予等量生理盐水,连续14 d。HE染色观察大鼠肺组织病理变化,ELISA检测血清IgE、白细胞介素(IL)-6和肺泡灌洗液IL-6含量,Western blot检测肺组织MEK/ERK信号通路相关蛋白表达。将巨噬细胞RAW264.7分为对照组、脂多糖(LPS)组、祛风宣痹方组和U0126组,以LPS诱导细胞炎症反应,同时祛风宣痹方组和U0126组分别予祛风宣痹方或MEK通路抑制剂U0126干预,ELISA检测细胞培养液IL-6含量,Western blot检测细胞MEK/ERK信号通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,哮喘组大鼠气道壁增厚,支气管周围炎症细胞增多,血清IgE、IL-6和肺泡灌洗液IL-6含量显著增加(P<0.01),肺组织p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达显著升高(P<0.05);与哮喘组比较,祛风宣痹方组大鼠气道炎症细胞浸润减少,血清IgE、IL-6和肺泡灌洗液IL-6含量显著减少(P<0.01),肺组织p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达显著降低(P<0.05)。细胞实验结果显示,与对照组比较,LPS组细胞培养液IL-6含量显著增加(P<0.01),细胞p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达显著升高(P<0.01);与LPS组比较,祛风宣痹方组细胞培养液IL-6含量显著减少(P<0.05),p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论祛风宣痹方能够缓解哮喘气道炎症,抑制MEK/ERK信号通路可能是其作用机制之一。

ERK1/2、MEK1/2在盆腔器官脱垂患者子宫骶韧带组织中的表达

目的:研究ERK1/2、MEK1/2在盆腔器官脱垂(POP)患者子宫骶韧带组织中的表达及意义。方法:选择30例因POP行子宫切除术或盆底重建术的患者为POP组,POP定量分期评分均为Ⅲ~Ⅳ度;选择同时期33例因非盆底功能障碍性疾病行子宫切除术的患者为对照组,POP定量分期评分均为0~Ⅰ度。收集患者术中废弃的近宫颈处子宫骶韧带组织,采用HE及Masson染色评估其组织学表现,采用免疫组化法和Western blot法检测ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2的表达情况。结果:POP组子宫骶韧带组织学结构明显区别于对照组,且ERK1/2、p-ERK1/2、MEK1/2、p-MEK1/2的相对表达量及p-ERK/ERK、p-MEK/MEK比值均低于对照组(P<0.05)。结论:ERK1/2与MEK1/2在POP患者子宫骶韧带组织中表达减少以及p-ERK/ERK和p-MEK/MEK比值降低可能与POP的发生有关。

“三通针法”电针调控Rho/ROCK(Rho kinase)及MEK/ERK信号通路对脊髓损伤大鼠胞浆型磷脂酶A2的影响

背景:胞浆型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2,cPLA2)是治疗脊髓损伤的新型策略和靶标,其受RhoA/Rho kinase及MEK/ERK信号通路的调控。而电针可通过调控RhoA/Rho kinase和MEK/ERK信号通路治疗脊髓损伤。目的:探讨电针调控Rho/ROCK(Rho kinase)及MEK/ERK信号通路对脊髓损伤后cPLA2的影响。方法:90只雌性SD大鼠,随机取72只制备脊髓损伤模型,BBB评分后随机分为脊髓损伤组、电针治疗组、U0126治疗组(ERK阻断剂)和Y27632治疗组(ROCK阻断剂),另18只设为假手术组(只进行椎板咬除,但不进行脊髓撞击)。电针治疗组大鼠取大椎、腰阳关以及双侧次髎、足三里进行电针治疗,每天1次,每次20 min,共14次;U0126治疗组和Y27632治疗组分别予以U0126和Y27362隔天1次硬膜下腔注射。治疗结束经BBB评分后处死大鼠,收集脊髓组织,ELISA检测脊髓组织前列腺素E2、血小板活化因子的水平;TUNEL法检测脊髓神经细胞凋亡率;Western blot检测脊髓RhoA、ROCKⅡ、MEK、ERK1/2、p-ERK1/2、cPLA2、p-cPLA2蛋白的表达;qRT-PCR检测脊髓RhoA、ROCKⅡ、MEK、ERK1/2与cPLA2的基因表达。结果与结论:(1)与假手术组比较,脊髓损伤组大鼠BBB评分明显下降(P<0.01),脊髓组织细胞凋亡阳性细胞数、前列腺素E2和血小板活化因子水平、p-cPLA2蛋白和cPLA2基因的表达均明显升高(P<0.01);除电针治疗组大鼠cPLA2基因表达降低差异无显著性意义外,各治疗组大鼠上述指标均明显逆转(P<0.01);(2)与假手术组比较,脊髓损伤组大鼠脊髓组织RhoA及ROCKⅡ蛋白和基因的表达、MEK和ERK1/2基因的表达、MEK和p-ERK1/2蛋白的表达均明显升高(P<0.01),电针治疗组及其他两治疗组大鼠上述指标均明显降低(P<0.01或P<0.05);(3)结果说明,电针能下调Rho/ROCK和MEK/ERK信号通路相关因子表达,抑制cPLA2的活性,减少神经细胞凋亡、减轻炎症反应,最终达到治疗脊髓损伤的作用。

大豆皂苷Bb对牙槽骨成骨细胞增殖、凋亡及MEK/ERK通路的影响

目的探讨大豆皂苷Bb经丝裂原细胞外信号调节激酶/细胞外信号调节激酶(MEK/ERK)信号通路对牙槽骨成骨细胞增殖、凋亡的影响。方法培养人牙槽骨成骨细胞,Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)培养的细胞作为对照组(A组),以含400μg/mL雌二醇、400μg/mL和800μg/mL大豆皂苷Bb的DMEM培养的细胞分别作为雌二醇组(B组),大豆皂苷Bb低、高剂量组(C_(1)组和C2组)。采用MTT法测定细胞活力和计数细胞菌落数,采用流式细胞术测定细胞凋亡水平,采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法及蛋白印迹法测定细胞中MEK,ERK mRNA和蛋白表达水平。结果与A组比较,B组、C_(1)组、C2组光密度(OD)、细胞存活率、菌落数、MEK及ERK mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),且呈剂量依赖性;与B组比较,C_(1)组上述指标均明显降低(P<0.05),而C2组无明显差异(P>0.05)。与A组比较,B组、C_(1)组、C2组细胞凋亡率均明显降低(P<0.05),且呈剂量依赖性;与B组比较,C_(1)组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),C2组细胞凋亡率无明显差异(P>0.05)。结论大豆皂苷Bb能促进牙槽骨成骨细胞增殖,抑制凋亡。其作用机制可能与大豆皂苷Bb促进牙槽骨成骨细胞MEK,ERK mRNA和蛋白表达,以及激活MEK/ERK信号通路传导有关。

Hoxa1通过MEK/ERK信号通路促进低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移和表型转换的研究

背景 低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary arterial hypertension,HPH)是一种以血管阻力持续性升高和血管重塑为特征的进展性疾病。研究表明Hoxa1参与血管生成过程,但Hoxa1在调控肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中的作用尚不明确。目的 本研究旨在确定Hoxa1对PASMCs增殖、迁移和表型转化的调控作用。方法 使用Ⅱ型胶原酶消化分离培养原代大鼠PASMCs。采用1%低氧处理细胞构建低氧诱导的细胞模型,并检测24 h、48 h、72 h低氧处理的PASMCs中Hoxa1 mRNA和蛋白表达水平。采用干扰或过表达Hoxa1慢病毒下调或上调细胞中Hoxa1表达。慢病毒干扰实验分为常氧组(Normoxia)、低氧组(Hypoxia)、低氧空病毒组(Hypoxia+shRNA-NC)、低氧Hoxa1干扰病毒组(Hypoxia+shRNA-Hoxa1);慢病毒过表达实验分为对照组(Control)、过表达空病毒组(LV-NC)、过表达Hoxa1组(LV-Hoxa1)。采用EdU检测细胞增殖能力;RT-qPCR检测Hoxa1 mRNA表达;Western blot检测Hoxa1、表型转化标志蛋白、MEK/ERK信号通路蛋白表达;免疫荧光检测Hoxa1、α-actin表达;免疫共沉淀实验确定Hoxa1与MEK的相互作用。结果 成功分离培养PASMCs,并鉴定细胞表达α-SMA。低氧诱导下PASMCs中Hoxa1表达上调(P<0.05)。低氧下Hoxa1沉默抑制PASMCs增殖和迁移,而常氧下Hoxa1过表达促进PASMCs增殖和迁移(P均<0.05)。低氧下沉默Hoxa1导致Hypoxia+shRNA-Hoxa1组收缩型标志蛋白表达升高,合成型标蛋白表达降低(P<0.05)。而在常氧下过表达Hoxa1导致LV-Hoxa1组收缩型标志蛋白降低,合成型标志蛋白升高(P均<0.05)。此外,Hoxa1表达增加促进MEK/ERK信号通路激活。免疫共沉淀结果显示,Hoxa1与MEK存在相互作用。结论 Hoxa1可能通过激活MEK/ERK通路促进PASMCs增殖、迁移和表型转化。

麸炒苍术对脾虚大鼠结肠组织MEK/ERK信号通路的影响

目的探讨麸炒苍术对脾虚大鼠结肠组织丝裂原活化细胞外信号调节激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路的影响。方法将SD大鼠随机分为正常组、模型组、复方谷氨酰胺组(9 mg·kg^(-1))及麸炒苍术高、中、低剂量组(10.0、5.0、2.5 g·kg^(-1)),每组10只。采用慢性束缚、苦寒破气联合饥饱失常复制脾虚大鼠模型。观察动物的宏观表征、摄食情况,记录每日体质量增加情况,测定粪便含水率,对大鼠脾虚证进行评分。采用HE染色法及透射电镜观察结肠组织病理形态学改变;ELISA法检测结肠黏膜组织中密封蛋白2(Claudin-2)、Claudin-3、黏蛋白(MUC2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)的含量;免疫组化法检测结肠组织中磷酸化肌球蛋白轻链激酶(p-MLCK)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-Raf)蛋白表达水平;Real-time PCR法检测结肠组织中MEK、ERK、MLCK mRNA表达水平。结果与正常组比较,模型组大鼠的脾虚证积分、粪便含水率显著升高(P<0.01),每日体质量增加量显著降低(P<0.01);结肠组织黏膜层上皮细胞萎缩,结构疏松水肿,固有膜结构被破坏,炎性细胞浸润,杯状细胞减少;肠上皮细胞结构及体积明显异常,核固缩,染色质及核仁形态模糊不清,线粒体减少且结构异常;结肠黏膜组织中Claudin-3、MUC2含量显著降低(P<0.01),Claudin-2、MMP-9含量显著升高(P<0.01);结肠组织p-MLCK、p-Raf蛋白表达及MEK、ERK、MLCK mRNA表达显著上调(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠的脾虚证积分、粪便含水率明显降低(P<0.05,P<0.01),每日体质量增加量明显升高(P<0.05,P<0.01);结肠黏膜表面结构明显改善,水肿减轻,杯状细胞排列整齐、增多;结肠组织细胞超微结构有不同程度修复;结肠黏膜组织中Claudin-3、MUC2含量明显升高(P<0.05,P<0.01),Claudin-2、MMP-9含量明显降低(P<0.05,P<0.01);结肠组织p-MLCK、p-Raf蛋白表达及MEK、ERK、MLCK mRNA表达明显下调(P<0.05,P<0.01)。结论麸炒苍术能够修复脾虚大鼠受损的肠黏膜及其组织细胞超微结构,缓解肠黏膜炎性改变,可能与干预Raf/MEK/ERK信号通路,双相调节肠黏膜Claudin-2、MMP-9、Claudin-3等紧密连接蛋白及黏蛋白MUC2的表达,从而增强肠道屏障功能有关。

Raf/MEK/ERK及Ca^(2+)/CaN信号通路在双酚A影响巨噬细胞分泌IL-10中的作用

目的:探讨Raf/MEK/ERK和Ca^(2+)/CaN信号通路在双酚A (BPA)调控巨噬细胞分泌IL-10中的作用。方法:以小鼠单核白血病巨噬细胞(RAW264.7)为靶细胞,2μg/ml脂多糖(LPS)为激活剂,采用1、10、100μmol/L BPA染毒。以10、 30μmol/L钙离子通道阻断剂(Ver), 0.25、 0.5μmol/LCaN阻断剂(FK506)和10、 40μmol/LERK抑制剂(PD98059)作为干预剂加入100μmol/LBPA,分别作用细胞4、12、24h。采用实时定量PCR技术测定ARaf、CRaf、MEK、ERK1、ERK2、NFATp、NFATc及IL-10的基因表达,采用ELISA方法检测细胞上清液IL-10的蛋白含量。结果:与对照组(0μmol/L BPA)相比,2μg/ml LPS组IL-10基因和蛋白表达水平升高,CRaf、MEK、ERK1、ERK2、NFATp和NFATc基因表达水平升高;与LPS组比较,100μmol/LBPA组IL-10的基因与蛋白表达水平降低,ARaf、CRaf、MEK、ERK1、ERK2、NFATp和NFATc基因表达水平升高;与100μmol/LBPA组比较,Ver组和FK506组IL-10基因和蛋白表达水平升高,NFATp和NFATc基因表达水平降低,而高浓度PD98059组IL-10基因和蛋白表达水平降低,NFATc表达水平降低而NFATp表达水平升高,差异均有统计学意义。结论:本实验条件下,Raf/MEK/ERK和Ca^(2+)/CaN信号通路共同调控NFAT,进而介导了BPA对巨噬细胞分泌细胞因子IL-10的影响,具体机制还需进一步探讨。

雌激素及雌激素受体拮抗剂对乳腺癌信号传导通路中MEK-2和p-ERK病理形态的影响

目的:探讨乳腺癌中雌激素受体与细胞信号传导通路MAPK上游激酶MEK-2和下游激酶p-ERK的作用机制。方法:应用雌激素(雌二醇)与雌激素受体拮抗剂(三苯氧胺)诱导BCML-TA299小鼠原位移植乳腺癌组织,通过病理形态学、免疫组织化学法检测ERβ、MEK-2和p-ERK的表达。结果:雌二醇(E2)促进细胞增殖,核分裂多见,肿瘤有丰富的血管,第20天时肺组织中血管腔及心腔内可见大量瘤栓。E2可激活MEK-2,p-ERK明显上调,ERβ与其基因有协同作用;而三苯氧胺(TAM)抑制细胞增殖,癌细胞明显受到损伤,核碎裂、凋亡小体多见,可见多灶性变性坏死区。同时出现ERβ、MEK-2和p-ERK下调,亦有协同作用。三苯氧胺与环磷酰胺联合应用效应优于单药的应用(F=211.88,F=179.08,F=156.44;P<0.05)。结论:ERβ与MAPK信号途径中上游激酶MEK-2和下游激酶p-ERK关系密切,并有协同作用,是乳腺癌发展中重要的调节信号。

自分泌IL-6经Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt通路促进卵巢癌细胞黏附和侵袭功能的研究

目的探讨内源性IL-6表达改变对卵巢癌细胞黏附和侵袭功能的影响及相关信号转导通路。方法利用以往构建的内源性过表达IL-6的人卵巢癌A2780细胞系和内源性抑制IL-6表达的人卵巢癌SKOV-3细胞,分别采用细胞体外黏附实验、Transwell小室体外侵袭实验、免疫印迹技术等观察IL-6对卵巢癌细胞黏附、侵袭能力的影响,并对其可能的信号通路进行研究。结果与对照组相比,内源性过表达IL-6可促进卵巢癌细胞的体外黏附和侵袭功能;抑制IL-6表达则可抑制卵巢癌细胞的上述功能。过表达或抑制表达IL-6可增加或减少卵巢癌细胞磷酸化ERK、Akt的表达水平,应用ERK或Akt特异性信号阻断剂可显著抑制高表达IL-6的卵巢癌细胞黏附和侵袭作用,提示可能与其活化Ras/MEK/ERK、PI3K/Akt通路有关。结论卵巢癌细胞产生的IL-6可经Ras/MEK/ERK和PI3K/Akt通路增强自身的黏附和侵袭能力,调节IL-6表达及相关信号转导通路可能是未来临床控制卵巢癌进展的一种良好策略。

GMF-β与MEK信号通路cross-talk介导榄香烯的抗胶质瘤作用

目的探讨神经胶质成熟因子-β(Glia Maturation Factor-β,GMF-β)在榄香烯致人U87MG胶质瘤细胞增殖抑制中的作用。方法以不同浓度榄香烯作用于人U87MG胶质瘤细胞,噻唑蓝(Methyl Thiazolyl Tet-razolium,MTT)法检测细胞活性。免疫沉淀联合Western blot法检测经榄香烯处理的U87MG细胞中总GMF-β及磷酸化GMF-β(p-GMF-β)蛋白的表达水平。通过RNA干扰技术使GMF-β的表达沉默,然后以MTT法检测榄香烯的抗胶质瘤增殖能力。Western blot法检测榄香烯对丝裂原活化蛋白激酶激酶3/6(Mitogen-activated Protein Ki-nase Kinase 3/6,MEK3/6)的激活作用是否因GMF-β的沉默而受到影响。结果榄香烯显著抑制了人U87MG细胞的增殖,并可使GMF-β、MEK3和MEK6的磷酸化水平上调。沉默GMF-β的表达导致MEK3和MEK6的磷酸化水平下调,榄香烯的抗胶质瘤细胞增殖作用减弱。结论 GMF-β与MEK信号通路的交互作用(cross-talk)介导了榄香烯的抗人胶质瘤细胞增殖作用。