新型阿卡斑病毒NSs蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】对新型阿卡斑病毒(Akabane virus,AKAV)非结构蛋白(non-structura,NSs)进行生物信息学分析,进而制备抗多克隆抗体,为新型AKAV检测及功能研究提供必要材料。【方法】使用蛋白生物信息学在线分析网站,对新型AKAV NSs蛋白进行系统分析。克隆NSs全长基因,利用大肠杆菌表达系统表达NSs重组蛋白,优化蛋白诱导条件并分析重组蛋白的可溶性;收获破碎菌体,经8 mol/L尿素变性、Ni 2+-NTA亲和层析纯化、透析及浓缩后进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定;将纯化的重组NSs蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;应用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)测定多克隆抗体效价及特异反应性。【结果】生物信息学分析表明,NSs蛋白由91个氨基酸残基构成,等电点为12.10,属于碱性蛋白,不稳定指数约为79.04,平均亲水性为指数为―0.059,为不稳定的亲水蛋白;无跨膜区和信号肽,属于非分泌蛋白。试验成功构建了NSs蛋白原核表达载体pET-32a-NSs,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定显示,成功表达重组NSs蛋白,分子质量为29.3 ku,主要以包涵体形式存在,与生物信息学分析结果一致;制备的多克隆抗体效价可达1∶16384000,Western blotting和IFA结果表明所制备抗体能够与NSs蛋白发生特异性反应,具有较好的特异性。【结论】试验成功获得纯化的新型AKAV NSs蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性;制备获得效价高、特异性好的多克隆抗体,为后续新型AKAV疫苗开发、检测及NSs蛋白功能研究提供了基础。

不同电针刺激强度对急性脑缺血再灌注大鼠NSS与脑组织含水量的影响

目的研究不同电针刺激强度对急性脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分(NSS)与脑组织含水量的影响。方法将50只8周龄健康大鼠随机分为5组:正常组、假手术组、模型对照组、弱电针刺激组、强电针刺激组,每组10只,后3组建立大脑中动脉缺血(MCAO)再灌注模型,治疗组在缺血再灌注(I/R)6 h后开始针刺。24 h二次针刺后行神经功能缺损评分,然后断头取脑,采用干湿法测定脑组织含水量;对各指标进行统计学分析。结果(1)各干预组大鼠神经功能缺损情况均较前改善(P<0.01),但各组间无明显统计学差异(P>0.05)。(2)弱电针刺激组脑组织含水量较模型对照组无明显变化(P>0.05),强电针刺激组脑组织含水量较模型对照组明显降低(P<0.05),强电针刺激组与弱电针刺激组脑组织含水量无明显差异(P>0.05)。结论急性脑缺血再灌注大鼠神经功能缺损评分在24 h会有所改善,因此不能说明24 h大鼠NSS的改善是电针的作用效果。强电针刺激能通过降低MCAO再灌注模型大鼠脑组织含水量从而对急性脑缺血再灌注大鼠起保护作用。

基于代理技术的NSS设计与实现

谈判支持系统(negotiation support system,NSS)通常为两方人员提供一个协商服务平台。实际生活中常出现某方人员难以亲临参加谈判的情形,需要系统为其提供一个软件代理继续协商下去。提出一种基于代理技术的NSS以解决上述问题,给出了该系统的体系框架和逻辑结构,构建了买卖交易中的卖方代理,并设计了使其具有智能特性的两个重要方法。最后,在移动代理开发平台Aglets上开发了一个原型系统ANSS,对它的人机交互界面做了简要介绍。

番茄斑萎病毒属病毒非结构蛋白NSs的生物信息学分析

番茄斑萎病毒属(Tospovirus)病毒编码的非结构蛋白NSs,可能在病毒复制、转录、抑制RNA沉默中起重要作用,本文利用生物信息方法对21个Tospovirus病毒成员的NSs序列进行分析,为进一步研究NSs的功能提供参考信息。从GenBank数据库中下载NSs基因序列,用DNAMAN5.0做NSs相似性矩阵分析,发现一些Tospovirus病毒成员之间的NSs氨基酸序列相似性很低,最低仅为7.1%;用ClustalX2.1进行NSs的氨基酸多序列比对分析,发现Tospovirus病毒成员的NSs相对保守区主要位于NSs的C端的位置,高度保守的氨基酸位点共有9个;PROSITE对NSs进行模体预测分析,结果显示Tospovirus病毒NSs共有的蛋白修饰:C蛋白激酶磷酸化、酪蛋白激酶II磷酸化和N-酰基化。此外,不同种的Tospovirus病毒NSs模体也表现出了多样性的特点。预测结果为下一步研究NSs功能奠定了基础。

布尼亚病毒非结构蛋白NSs与RNA沉默

布尼亚病毒科含5个属,350多种病毒,寄主范围包括植物、动物和人类,主要通过节肢动物传播(仅有汉坦病毒属通过啮齿动物传播),其中大部分病毒危害严重,影响农业生产,威胁人类和动物健康,造成重大经济损失。NSs蛋白是布尼亚病毒S RNA编码的非结构蛋白质,可以抑制RNA沉默,在侵染介体和寄主的过程中起时发挥重要作用。在植物寄主中,NSs蛋白通过与病毒dsRNA结合、抑制dsRNA次生扩增、长距离传播等机制抑制RNA沉默;在动物、人类寄主以及传播介体中,多种证据表明,NSs蛋白也能抑制RNA沉默。RNA沉默是植物和节肢动物中主要的抗病毒机制之一,NSs蛋白抑制RNA沉默对于病毒成功侵染寄主或传播介体非常重要。本文就近年来NSs蛋白在抑制RNA沉默方面的研究做一综述。

鉴别检测裂谷热病毒NSs缺失型疫苗株与野生株模拟物的双重荧光定量RT-PCR方法的建立

为了建立一种能够鉴别检测裂谷热病毒野毒株与NSs缺失型疫苗株的荧光定量RT-PCR方法,本研究通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析,选择其S节段NSs基因及L节段L基因的无二级结构且保守的区段,分别设计多对引物和探针,通过试验验证并优化反应条件,筛选出最佳引物和探针的组合,建立了可以快速检测裂谷热病毒并区分NSs基因缺失疫苗株和野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测羊临床常见病原,结果显示该方法仅对裂谷热质粒标准品样品检测为阳性,不与羊常见的其他病原出现阳性反应,特异性强;将裂谷热质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的方法进行检测,结果显示,该方法对NSs和L基因重组质粒标准品的检测下限分别为10拷贝/μL和100拷贝/μL,敏感度高;重复性实验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。将NSs缺失型和非缺失型质粒分别转染细胞,提取核酸,利用本方法进行检测,结果显示该方法可有效区分NSs基因缺失型和非缺失型核酸样品。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法为鉴别野生病毒株和NSs缺失型疫苗株奠定了技术基础。

基于Web的NSA和NSS集成的商务洽谈系统

商务洽谈是解决电子商务冲突的最好方法之一。该文研究和讨论了基于Web的集成商务洽谈的两大实现技术：洽谈软件代理NSA和洽谈支持系统NSS，并给出了一个基于Web的NSS和NSA集成的商务洽谈系统框架。

淮阳山病毒NSs基因在THP-1细胞中的稳定表达及其对白细胞介素-6的调节作用

淮阳山病毒(Huaiyangshan virus,HYSV)是一种能引起人类发热伴血小板减少综合征的新型布尼亚病毒。NSs是淮阳山病毒的毒力因子,可能在病毒的致病中起重要的作用。本研究从构建好的含HYSV NSs基因的重组质粒pBluntNSs中扩增出NSs基因,然后克隆到慢病毒载体pHAGE-CMV-MCS-IZsGreen中构建重组质粒pHAGE-NSs;利用脂质体将pHAGE-NSs与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞,在荧光显微镜下可见大量绿色荧光,收上清,即慢病毒悬液;将慢病毒悬液感染THP-1细胞后,通过绿色荧光蛋白进行流式分选、Western blot验证获得稳定表达NSs蛋白的THP-1细胞。利用人白介素-6ELISA检测试剂盒检测NSs蛋白对白介素-6的调节作用,结果表明,NSs蛋白能激活THP-1细胞产生白细胞介素-6。

NSS中的潜信道及其封闭方法

NSS是2001年提出的一个新的签名体制.文章首次给出了封闭潜信道的强和弱方法的定义,强方法可以完全阻止潜信息的发送,而弱方法只能以某个概率防止潜信息的传送.随后在NSS数字签名体制中建立了一个潜信道,并给出了封闭它的弱方法.

NSS自身安全防护系统的设计与实现

介绍了网络安全扫描系统(NSS)采用的两种安全防护保护机制和相关算法的描述。

利用酵母双杂交技术筛选鉴定与番茄环纹斑点病毒NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白

【目的】筛选鉴定西花蓟马Franiklinella ocicdentalis体内与番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus,TZSV)NSs蛋白互作的介体因子。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白;进行序列分析鉴定后,将捕获的蛋白与NSs基因回转到酵母细胞,利用营养缺陷型培养基鉴定蛋白互作情况。再利用GST Pull-down技术验证TZSV NSs与鉴定出的西花蓟马蛋白的体外互作关系。【结果】构建了TZSV NSs的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-NSs,确定了诱饵质粒对酵母AH109细胞无毒性,并且无自激活活性。序列分析发现与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白为类电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like,VDAC)。酵母回转实验显示TZSV NSs与西花蓟马VDAC在酵母细胞内存在特异性互作。GST Pull-down结果表明TZSV NSs与西花蓟马VDAC在体外存在相互作用。【结论】通过酵母双杂交和GST Pull-down技术,分别在酵母细胞内和体外证实了TZSV NSs和西花蓟马VDAC存在特异性互作。这些结果有助于揭示西花蓟马VDAC蛋白调控西花蓟马持久传毒的机制,为虫传病毒病的防治提供理论基础。

云南省不同地区烟草上TSWV NSs氨基酸序列分析

【目的】探究不同正番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus,TSWV)分离物中NSs与其地理来源和寄主二者之间的相关性,阐明云南不同地区8个烟草样品TSWV NSs适应性进化情况。【方法】利用RT-PCR、克隆、转化和测序技术,从云南不同地区已经确定感染TSWV的8份烟草样品中获得NSs氨基酸序列。采用DNAMAN 8.0和MEGA 7.0软件,对云南不同地区8个烟草样品与GenBank公布的烟草、番茄和辣椒上31个TSWV NSs氨基酸序列进行比对分析。通过The Selecton Server软件,对云南不同地区8个烟草样品TSWV NSs氨基酸序列进行选择压力分析。【结果】云南不同地区8个烟草样品与同样来自中国云南烟草、番茄和辣椒上TSWV NSs氨基酸序列在系统发育树中处于同一支,亲缘关系最近;与来自韩国的番茄和辣椒上TSWV NSs氨基酸序列位于同一大支,亲缘关系较近;而与来自欧洲保加利亚烟草上TSWV NSs氨基酸序列处于不同分支,亲缘关系最远。在云南不同地区8个烟草样品TSWV NSs氨基酸序列中未检测到正选择位点。【结论】不同TSWV分离物中NSs与其地理来源有明显的相关性,但跟寄主的相关性不大。云南不同地区8个烟草样品TSWV NSs稳定的保持其增强病毒症状、抑制沉默等功能。

NSS数字签名方案安全性能分析

研究基于NTRU公钥密码体制的一种数字签名方案—NSS数字签名方案。本文对NSS数字签名方案的安全性进行详细的分析,主要讨论五种攻击方式,即穷举攻击、对公钥的格攻击、副本格攻击、格基规约攻击和副本平均值攻击,并得出结论:在大维数情况下,NSS数字签名方案能够很好地对抗这五种攻击。

腔镜下甲状腺癌手术与开放性手术对淋巴结清扫数量、VAS及NSS评分的影响研究

目的探讨腔镜下甲状腺癌手术与开放性手术对淋巴结清扫数量、VAS及NSS评分的影响,旨在为临床治疗甲状腺癌提供有利的参考依据。方法 2008年1月～2012年1月在我院确诊甲状腺癌患者26例作为观察组,另外选择同期行开放性甲状腺癌手术患者20例作为对照组,比较两组的手术时间、术中出血量、住院时间、清扫淋巴结的数量术后24 hVAS评分及术后3、6个月NSS评分及并发症情况。结果观察组在手术时间、术中出血量、术后住院时间及清扫淋巴结数量方面与对照组比较,差异无统计学意义;但观察组术后24 hVAS评分明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术后3个月NSS评分及术后6个月NSS评分均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术后并发症例数明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论与开放性手术相比,腔镜下甲状腺癌手术患者痛苦少、美容效果好、并发症少,值得推广和应用。但腔镜下甲状腺癌手术的根治性效果、术后生存率、肿瘤复发率,其确切的结论仍需累积大量的临床病例,进行长期的随访来进一步证实。

金纳米星的制备及其对葡萄糖的表面增强拉曼光谱检测

采用种子生长法制备了金纳米星增强材料,用于对葡萄糖的表面增强拉曼光谱检测,通过透射电子显微镜等对制备的金纳米星进行结构分析和表征。所合成的增强材料直径约为82 nm,具有多分枝尖端的星状结构。探究了不同形貌的金纳米星增强效果,结果表明,所合成的金纳米星具有较强的表面增强拉曼效果,被应用于葡萄糖检测。在优化的检测条件下,该方法对葡萄糖检测的线性范围为1~120μmol/L,检出限为29 nmol/L,其实际样品加标回收率为97.5%~105.6%。该方法可用于复杂基质中葡萄糖的快速、灵敏检测。

金银合金纳米星/聚氯乙烯柔性表面增强拉曼基底的制备及其对毒死蜱的检测

该文制备了一种金银合金纳米星/聚氯乙烯柔性表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman scattering,SERS)基底,该基底具有透明度高、灵活性强和SERS增强性能显著的优点,可以快速实现对果蔬表面毒死蜱残留的定性和定量检测。在复合基底制备中,首先优化聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)添加量获得柔性良好的PVC基底,并优化氯金酸/硝酸银体积比制备了形貌鲜明且SERS增强效应显著的各向异性金银合金纳米星(gold-silver alloy nanostars,Au@Ag NSs),其次以拉曼信号分子4-巯基苯甲酸为对象,通过拉曼光谱仪测定其在复合基底上的SERS强度,确定了Au@Ag NSs溶液的最优浓缩倍数,进一步验证了基底的良好SERS效应、重现性和稳定性,最后成功应用于苹果表皮毒死蜱残留的检测。

氧化石墨烯基二维复合纳米片对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究

为研发抗动物源性病毒感染的新型广谱纳米材料,将氧化石墨烯(GO)与二氧化锰纳米片(MnO_(2) NSs)通过π-π堆叠作用制备合成二维复合纳米片材料(GO-MnO_(2) NSs),分别通过TEM、XRD、XPS对GO-MnO_(2) NSs的形貌、结构、结晶度和元素价态进行表征,并采用MTT法对GO-MnO_(2) NSs的细胞毒性进行测试。结果显示,625μg/mLGO-MnO_(2)NSs的细胞存活率超过85%;以猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为冠状病毒的模式病毒,EC50、间接免疫荧光和Western blot试验结果证实GO-MnO_(2) NSs对PEDV感染具有显著的抗病毒活性。研究结果表明,GO-MnO_(2)NSs能够清除由病毒感染引起的活性氧过表达并抑制细胞凋亡,同时还能上调细胞内干扰素和干扰素刺激基因(ISGs)等抗病毒因子的表达,从而有效抑制病毒感染。

“非人称主语句”研究存在的问题与对策

非人称主语句是语言研究中关涉人称、物称的重要概念,已有一些相关研究成果,但一直处于混沌状态,存在三个问题:分类不当造成泛化、外延交叉造成含混、概念不清造成误判。提出三个对策:1)科学分类消除泛化:该句式通过句法修辞和隐喻修辞两个路径获得,其中隐喻修辞含拟人句与死隐喻带来的常规实例,只有句法修辞句和拟人句有修辞意义;2)确定外延消除含混:将句法修辞类型命名为“非人称行为句”并确定其构式,将其与隐喻修辞明确辨别,补充其“转移责任”功能,提高应用效果;3)明确概念消除误判:强调非人称主语句在汉语中也大量存在,只有英语的“非人称行为句”的修辞效果难以在汉语中保留。研究有助于解决句法修辞和隐喻修辞之间长期困扰学习者的概念重叠问题,有利于提高应用实效。

海盐气溶胶和硫酸盐气溶胶在云微物理过程中的作用

利用大气气溶胶和云分档模式研究海盐气溶胶和硫酸盐气溶胶在云微物理过程中的作用,计算结果表明:云中液态水含量随高度的分布并不随海盐、硫酸盐的数目以及云团上升速度的变化而变化;随着云滴数目的增加,云滴的有效半径会减小;硫酸盐对云滴数目影响起主导作用,海盐在水汽相对充足情况下增加了云滴数目,在水汽相对不足的情况下减少了云滴数目;硫酸盐粒子浓度特别强的情况下(人类活动污染比较严重时),如果水汽相对不足,云滴数目会明显小于硫酸盐粒子浓度;而海盐粒子的存在,加剧了水汽的供应不足,从而可以在很大程度上进一步降低云滴数目。也就是说,在有些情况下,如果不考虑海盐气溶胶的作用,硫酸盐气溶胶对云特性的影响会被过高估计。

铝合金阳极氧化膜防护性能及失效规律研究

目的研究不同腐蚀环境条件下铝合金阳极氧化膜层的防护作用及失效规律。方法采用中性盐雾、酸性盐雾试验方法进行加速试验,对无划线试样腐蚀外观和附着力以及有划线试样的腐蚀形貌等进行检测和考核分析。结果获得了4种铝合金材料阳极氧化膜层在不同试验环境条件下的防护性能、腐蚀失效、附着力变化以及抗腐蚀扩展性能等试验数据。结论铝合金材料类型对未封闭处理的阳极氧化膜的耐腐蚀扩展性能影响明显。封闭处理能够提高铝合金阳极氧化膜的综合防护性能。