通窍明目汤调控p53/SLC7A11介导的氧化损伤及铁死亡改善青光眼RGC损伤的作用机制

目的:探讨通窍明目汤改善青光眼视神经损伤的分子机制。方法:通过网络药理学方法,数据库检索药物、疾病及铁死亡数据库靶点,筛选出共同靶点与关键靶标,构建“通窍明目汤-青光眼-铁死亡”网络,并进行通路富集分析;体外实验以过氧化氢诱导RGC,造模成功后,随机分为模型组、通窍明目汤组、阳性药物组,共3组,另设正常空白组,自第5周开始予通窍明目汤(99.96 g/kg)灌胃干预。实验结束后,CCK-8检测RGC增殖,流式细胞术检测ROS表达,ELISA法检测RGC中铁离子、MDA、SOD、GSH-PX含量及活性,Western blot检测RGC中ACSL4、GPX-4、FTH-1蛋白及p53/SLC7A11相关蛋白的表达变化,RT-PCR法检测RGC中p53、SLC7A11 mRNA含量。结果:经通窍明目汤汤干预后,与模型组比较,通窍明目汤显著降低RGC内活性氧阳性率、铁离子水平及MDA含量、下调RGC细胞核内p53、ACSL4及ACSL4、p53 mRNA表达,增加RGC增殖率,升高SOD、CAT及GSH水平,上调GPX-4、FTH-1、SLC7A11及GPX-4、FTH-1、SLC7A11 mRNA表达(P<0.05)。结论:通窍明目汤可能通过多成分、多靶点,涉及多条分子通路,其机制可能与阻断p53/SLC7A11信号通路中细胞内p53的表达及systemXc-所介导的RGC铁死亡,抑制SLC7A11表达,导致胱氨酸减少,增加铁死亡敏感性,触发的氧化应激和过度炎症反应,从而避免细胞受损和功能紊乱有关。

脂肪间充质干细胞外泌体对体外培养压力损伤的大鼠RGCs的保护作用

目的:通过体外建立大鼠视网膜神经节细胞(RGCs)压力损伤模型,研究脂肪间充质干细胞(ADSCs)外泌体对损伤的RGCs的保护作用。方法:培养ADSCs收集上清提取并鉴定外泌体,将体外培养大鼠RGCs分为正常培养的RGCs对照组、不同压力(40、80、120 mmHg)培养的RGCs模型组、不同压力培养的RGCs加入外泌体治疗组,通过CCK-8法检测各组RGCs细胞增殖活力,qPCR法检测各组RGCs中BDNF、Caspase-3的mRNA表达水平,Western Blot检测各组RGCs中BDNF、Caspase-3的蛋白表达水平。结果:CCK-8法检测发现,在对照组中,与24 h的细胞增殖活力相比,48 h时细胞增殖活力上升(P<0.05)。在48 h时,与加压40、80、120 mmHg模型组相比,加入外泌体后细胞活力均上升(均P<0.05)。qPCR法检测发现,与对照组比较,40 mmHg组中BDNF mRNA表达下降,但无差异(P>0.05),80、120 mmHg组中BDNF mRNA表达下降(均P<0.05)。加压40、80 mmHg组加入外泌体后RGCs的BDNF mRNA表达均上升(均P<0.05),加压120 mmHg组加入外泌体后RGCs的BDNF mRNA表达上升,但无差异(P>0.05)。与对照组比较,加压40 mmHg组中Caspase-3的mRNA表达上升,但无差异(P>0.05),加压80、120 mmHg组中Caspase-3 mRNA表达均上升(均P<0.05)。加压40、80 mmHg组加入外泌体治疗后RGCs的Caspase-3 mRNA表达下降(P<0.05),加压120 mmHg组加入外泌体治疗后RGCs Caspase-3的mRNA表达下降,但无差异(P>0.05)。Western Blot检测发现,与对照组比较,加压40 mmHg组中BDNF蛋白表达下降,但无差异(P>0.05),加压80、120 mmHg组中BDNF蛋白表达下降(均P<0.001)。与模型组相比,加入外泌体治疗后BDNF蛋白表达均上升(均P<0.05)。与对照组比,加压后各模型组中Caspase-3蛋白表达均上升(均P<0.05);与模型组相比,加入外泌体治疗后各组Caspase-3蛋白表达均下降(均P<0.05)。结论:ADSCs来源的外泌体能够增加体外培养不同压力损伤的大鼠RGCs的细胞增殖活力,提高BDNF的mRNA及蛋白表达水平,降低Caspase-3的mRNA及蛋白表达水平,说明ADSCs来源的外泌体对体外培养压力损伤的大鼠RGCs具有保护作用。

理肺散提取物乙酸乙酯层的化学成分及其对RGC-5细胞损伤的保护作用研究

目的分析理肺散提取物乙酸乙酯层的化学成分,并探讨其对RGC-5细胞损伤的保护作用。方法采用硅胶柱、MCI柱等柱色谱技术对理肺散提取物乙酸乙酯层进行分离,采用制备型高效液相色谱进行纯化,利用核磁共振法对化合物进行结构鉴定,采用CCK-8法检测化合物对丙泊酚诱导的RGC-5细胞损伤的保护作用。结果共分离鉴定出15个化合物,分别为capsaicin(化合物1)、homodihydrocapsaicinⅠ(化合物2)、secoisolariciresinol(化合物3)、lariciresinol(化合物4)、dehydrodiconiferyl alcohol(化合物5)、cleomiscosin A(化合物6)、curcasinlignan B(化合物7)、syringaresinol(化合物8)、oleanolic acid(化合物9)、ursolic acid(化合物10)、methyl 4-benzoyloxy-3-methoxybenzeneacetate(化合物11)、(R)-6-methyl-4,6-bis(4-methylpent-3-enyl)cyclohexa-1,3-dienecarbaldehyde(化合物12)、2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone(化合物13)、isoscopoletin(化合物14)、1H-indole-3-carboxaldehyde(化合物15)。化合物1,4,6-8对丙泊酚诱导的RGC-5细胞损伤具有一定保护作用,其中化合物4、化合物7活性最强,分别使RGC-5细胞的活力提升了15.89%和13.09%。结论化合物1-7为首次从耳草属中分离发现,化合物9-10,13为首次从理肺散中分离发现。化合物4、化合物7对丙泊酚诱导的RGC-5细胞损伤显示出较好的保护作用。

活血明目方对体外加压培养大鼠RGCs NF-κB信号通路凋亡相关因子Bax及Bcl-2的影响

目的观察活血明目方对体外加压大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)中凋亡相关因子Bax和Bcl-2表达的干预作用。方法将SD大鼠随机分为4组,每组3只大鼠,采取体外加压培养SD大鼠凋亡模型,制备活血明目方含药肠吸收液,观察活血明目方对体外加压RGCs在NF-κB信号通路作用下对Bax、Bcl-2表达的影响。结果Q-PCR和Western blot检测发现,与模型组相比,含药肠吸收液组中Bax相对表达量显著下降(P<0.05),而Bcl-2相对表达量则显著上升(P<0.01)。结论活血明目方含药肠吸收液对RGCs凋亡具有一定的抑制作用。

过表达RGC-32对胰腺癌BxPC-3细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨RGC-32基因在胰腺癌Bx PC-3细胞增殖、凋亡中的作用。方法常规培养胰腺癌Bx PC-3细胞,构建RGC-32表达质粒pc DNA3.1/myc-His C-RGC-32,并瞬时转染Bx PC-3细胞作为实验组;将转染空质粒pc DNA3.1/myc-His C的Bx PC-3细胞作为对照组;应用实时定量PCR及Western blotting确定转染效率。采用细胞增殖试剂盒CCK-8(cell counting kit-8)法检测转染前后细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡的变化。结果定量PCR及Western blotting检测结果均显示转染实验组较对照组RGC-32mRNA及蛋白表达显著上调(P<0.05)。细胞增殖实验表明实验组较对照组细胞存活率显著性下降(P<0.05);细胞凋亡实验表明实验组较对照组细胞凋亡率无显著性下降(P>0.05)。结论在胰腺癌Bx PC-3细胞中,过表达RGC-32可抑制细胞增殖,但对细胞凋亡无明显作用。

TAIL-PCR的技术改良及对香蕉NBS-RGC5基因侧翼序列的克隆

香蕉枯萎病是一种毁灭性真菌病害,对香蕉的种植和产业发展危害严重,研究香蕉枯萎病相关的抗性基因,具有重要的理论意义。对TAIL-PCR进行技术改良,以简并引物组合的方式与特异性引物进行扩增,代替最初的单一简并引物方式,在TAIL-PCR第一轮扩增的大循环中设置不同的退火温度;采用改良后的TAIL-PCR成功克隆了巴西蕉NBS型抗性蛋白(NBS-RGC5)基因的侧翼序列。

分离提纯牛α晶体蛋白促大鼠RGCs生长作用的观察

目的观察分离提纯的牛α晶体蛋白(α-crystallin)对体外培养视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)生长的作用。方法原代培养RGCs,Thy1.1免疫荧光法鉴定RGCs并进行纯度检测,不同浓度分离提纯的牛α晶体蛋白(10-7、10-6、10-5、10-4g/L)加入后,于3、12h、1、2d和3d在相差显微镜下观察RGCs形态学变化;计突起数目和轴突长度并与正常对照组、鼠α晶体蛋白组(10-4g/L)进行比较。结果分离提纯的牛α晶体蛋白组(10-4g/L和10-5g/L)RGCs突起数目及轴突长度显著大于正常对照组(P<0.05,P<0.01),牛α晶体蛋白10-4g/L与鼠α晶体蛋白组(10-4g/L)比较无明显区别(P>0.05)。结论分离提纯的牛α晶体蛋白(10-4g/L)能够促进RGCs生长,与鼠α晶体蛋白(10-4g/L)比较无明显区别。

α-晶体蛋白干预大鼠RGCs过氧化损伤作用实验研究

目的观察α-晶体蛋白(-αcrystallin)在过氧化氢(H2O2)损伤大鼠视网膜神经节细胞(retina ganglion cells,RGCs)中的影响并探讨其机制。方法原代培养大鼠RGCs并用Thy1.1鉴定,-αcrystallin组加入α-晶体蛋白(10-4、10-5、10-6g/L)预处理2h,然后加入H2O2(终浓度为0.5mmol/L)进行损伤实验,观察3、12、24h细胞形态学变化、轴突长度和突起数目的变化及细胞凋亡发生,检测RGCs培养上清液中相关酶(超氧化物歧化酶/SOD、谷胱甘肽过氧化物酶/GSH Px和过氧化氢酶/CAT、乳酸脱氢酶/LDH)活性及丙二醛/MDA水平的变化。Fluo-3/AM荧光比值成像技术测定RGCs胞浆游离钙离子水平。结果单纯损伤组RGCs存活率与SOD、CAT、GSH Px活性随损伤时间延长显著降低,LDH活性和MDA含量升高;-αcrystallin组RGCs存活率与SOD、CAT、GSH Px活性升高,LDH、MDA生成减少,其变化呈浓度依赖性。-αcrystallin组RGCs突起断裂程度明显少于单纯损伤组。单纯损伤组24h DNA电泳出现明显凋亡梯形带,-αcrystallin低浓度组出现较弱凋亡带。单纯损伤组RGCs钙离子荧光强度急剧升高,12h达平台期。-αcrystallin组钙离子变化随-αcrystallin浓度增高而减弱。结论α-晶体蛋白能够减轻H2O2介导的RGCs自由基损伤效应,其机制与抑制RGCs钙离子内流、升高RGCs抗氧化酶活性有关。

转基因视网膜神经节细胞系RGC-5的研究进展

为研究青光眼性视网膜神经节细胞(RGCs)损害的细胞和分子机制,多种细胞培养模型已经建立,但是转基因的视网膜神经节细胞RGC-5细胞系在国内未见报道。RGC-5细胞系是应用鼠视网膜细胞通过转染技术建立的,除了其形态和电生理特性与RGCs有所不同外,细胞的生长条件以及细胞膜或者细胞内表达的物质与RGCs一致。应用RGC-5细胞系已经建立了多种凋亡模型,研究发现这些模型的细胞在凋亡时的基因变化以及对神经保护剂的反应都与RGCs一致。因此加强对RGC-5的研究和应用,对进一步阐明RGCs的损伤和保护机制将非常有意义。现就这个细胞系的建立及已做的相关研究做一综述。

CNTF对慢性高眼压大鼠RGCs的保护作用

目的研究慢性高眼压大鼠玻璃体腔内注射睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)对大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)的保护作用。方法大鼠随机分成1、2、3、4周组,制作慢性高眼压模型,实验眼玻璃体注入CNTF0.5μg,对照眼注入5μl磷酸钠溶液,各实验点光镜观察和进行免疫组化检测,采用图像分析系统分析。结果HE染色光镜观察分析,1、2、3周实验组RGCs数明显多于对照组(P<0.05),RGCs略有肿胀,形态趋于正常,4周实验组和对照组形态差异不明显;GAP-43免疫组织化学检测,2、3、4周实验组RGCs层阳性染色与对照组相比有显著性差异(P<0.05),1周实验组RGCs阳性染色较少(P>0.05)。结论CNTF对慢性高眼压动物RGCs起到一定的保护作用并可促进RGCs再生。

Etoposide经由caspase依赖途径诱导RGC-5细胞凋亡

目的研究etoposide诱导视网膜神经节细胞RGC-5细胞死亡的分子机制。方法建立etoposide诱导的RGC-5细胞死亡模型,应用APOPercentageTM及原位TUNEL染色确定RGC-5细胞的死亡方式,并进而利用Westernblot检测细胞内活化caspase-3及PARP-1的变化情况,并通过广谱caspase抑制剂间接证明是否有caspase依赖途径的激活。结果相对高浓度的etoposide(1～10μmol/L)可以迅速降低RGC-5细胞的活性并诱导死亡;APOPercentageTM及原位TUNEL染色确定etoposide是以凋亡的方式诱导RGC-5细胞死亡;Westernblot显示etoposide诱导后的RGC-5细胞中caspase-3被激活并伴有PARP-1的降解片段出现;广谱caspase抑制剂Z-VAD-fmk可以保护etoposide诱导的RGC-5细胞,提高细胞活性。结论Etoposide经由caspase依赖途径诱导RGC-5细胞凋亡。

Staurosporine诱导RGC-5细胞分化作用的研究

目的观察Staurosporine是否可以诱导视网膜神经节细胞-5(RGC-5)的分化。方法正常培养RGC-5细胞,应用500nmol/L Staurosporine诱导RGC-5细胞分化,并在诱导后不同时间段连续观察细胞形态的变化。应用免疫荧光检测视网膜神经节细胞(RGCs)阳性标志因子Thy-1和Brn-3的表达,应用Western Blot、RT-PCR分别定量检测诱导分化后RGC-5细胞中的Thy-1和Brn-3蛋白表达及mRNA的转录情况。结果应用500nmol/L Staurosporine诱导后的RGC-5形态上表现出增生停止,胞体周围纤长轴突生长,轴突末端可见类似突触结构。500nmol/L Staurosporine可以诱导RGC-5细胞中RGCs阳性标志因子Thy-1和Brn-3转录及表达上调。结论500nmol/L Staurosporine可以有效地诱导RGC-5细胞向成熟RGCs分化。

CMOS RGC低噪声跨阻放大器

光纤通信系统接收端前置放大器的性能很大程度上决定着整个光纤通信系统的性能.基于CMOS工艺,给出了一个RGC结构的,应用于2.5Gbit/s光纤通信系统的低噪声跨阻放大器的实现方式.RGC结构具有极低输入电阻特性,同时,为了减小输入等效噪声电流和提高-3dB带宽,采用了跨导增大技术和感性峰值技术.采用SMIC的0.18μm CMOS工艺的仿真结果表明该电路具有61.23dB的跨阻增益,2.09GHz的带宽,输入等效噪声电流为9.4pA/(Hz)^(1/2),电路功耗仅为16.2mW.

RGCs缺氧条件下钙离子水平动态变化及与TNF-α及脂质过氧化反应的关系研究

目的探讨体外培养大鼠视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs),在缺氧条件下细胞质内游离钙离子水平动态变化规律及与培养液中TNF-α含量及脂质过氧化反应的关系。方法正常对照组RGCs在常规条件下培养、缺氧组在1%氧浓度下培养1、3、12、24h。采用激光扫描共聚焦技术检测RGCs细胞质游离钙离子水平、黄嘌呤氧化酶法和硫代戊巴比妥酸法检测培养液SOD活性和MDA含量、TNF-α水平检测采用酶标双抗夹心免疫吸附法(ELISA)。结果正常对照组RGCs细胞质钙离子水平无显著变化,缺氧组RGCs细胞质内游离钙离子荧光强度急剧升高,缺氧12h达平台期,较正常对照组显著升高(P<0·01)。缺氧组细胞培养液SOD活性随缺氧时间延长显著降低,MDA含量及TNF-α含量显著升高(P<0·01)。结论体外培养RGCs在缺氧条件下其细胞细胞质内游离钙离子水平呈上升趋势,其表达变化与缺氧时培养液中脂质过氧化反应逐渐增强、TNF-α水平上升及RGCs抗氧化能力降低有关。

ATP与P2X_7受体在Müller细胞激活导致视网膜神经节细胞株RGC-5凋亡中的作用研究

目的 :探讨Müller细胞胶质化激活对RGC-5细胞的影响及ATP与P2X7受体在其中的相关作用。方法:纯化培养Müller细胞、RGC-5细胞株,免疫荧光进行细胞鉴定,并观察加入DHPG后Müller细胞的GFAP表达情况。荧光素酶法检测加入DHPG后Müller细胞外ATP的含量变化;DHPG刺激后的培养液作为条件培养基加入RGC-5细胞株(RGC-5预先使用MPEP及MPMQ处理2 h),TUNEL法检测RGC-5凋亡情况,预先加入P2X7受体阻断剂亮蓝G(brilliant blue G,BBG)后检测RGC-5的凋亡情况。同时使用Western blot检测抗凋亡蛋白及促凋亡蛋白Bcl-2和Bax的变化情况。免疫荧光及Western blot检测RGC-5上P2X7受体的表达变化。结果:DHPG激活Müller细胞后可以导致细胞外ATP的增加;激活的Müller细胞条件培养基(conditioned medium,CM)可以导致RGC-5凋亡的明显增加。而BBG可以抑制RGC-5凋亡的增加,同时Western blot也显示与对照组相比CM显著降低RGC-5细胞上的Bcl-2蛋白水平,但增加了Bax的蛋白表达,而当预先加入BBG后再用CM处理则呈现相反的结果。另外Western blot及免疫荧光显示加入条件培养基后RGC-5细胞的P2X7受体蛋白表达增加。结论:Müller细胞的激活可以导致RGC-5细胞的凋亡,该现象可能与Müller细胞激活引起的ATP释放增加及RGC-5上P2X7受体有关。

益气明目颗粒含药血清对氯化钴诱导缺氧损伤RGC-5细胞的保护作用

目的观察益气明目颗粒含药血清对氯化钴(CoCl2)诱导缺氧损伤小鼠视网膜神经节细胞(RGC-5)的保护作用。方法采用CoCl2构建RGC-5缺氧损伤模型,分别用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡水平,生物透射电镜观察细胞超微结构改变,试剂盒检测细胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)含量的变化,RT-PCR检测缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、半胱天冬酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤因子相关x蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤基因-2(Bcl-2)相关mRNA表达水平。结果不同浓度含药血清组细胞存活率均高于缺氧模型组(P<0.05,P<0.01),且2.5%、5%含药血清组细胞存活率显著高于同浓度空白血清组(P<0.05),抑制细胞凋亡,减轻细胞超微结构损伤,提高细胞GSH-Px和SOD水平(P<0.01);与模型组相比,2.5%、5%浓度含药血清能够下调细胞HIF-1α、Caspase-3、Bax的表达(P<0.05,P<0.01),升高Bcl-2的表达(P<0.01)。结论益气明目颗粒含药血清能够通过抗氧化应激作用减轻CoCl2诱导的RGC-5缺氧损伤。

人参皂苷Rb1对H_2O_2损伤RGC-5细胞的保护作用及机制探讨

目的观察人参皂苷Rb1对H2O2损伤RGC-5细胞的保护作用,并探讨其机制。方法采用MTT方法检测人参皂苷Rb1对H2O2损伤RGC-5的细胞活力的影响,试剂盒方法检测SOD活性、GSH含量,免疫荧光化学染色法检测碘化丙啶(PI)、Caspase-3、Ca2+。结果 A、B、C、D、E组在490 nm处检测细胞活力分别为0.266±0.038、0.299±0.025、0.314±0.014、0.222±0.031、0.391±0.041,A、B、C、E组与D组比较,P均<0.05。空白对照组、人参皂苷Rb1组、H2O2损伤组SOD活性分别为19.88±0.12、17.12±0.32、15.47±0.21,人参皂苷Rb1组、空白对照组分别与H2O2损伤组比较,P均<0.05。空白对照组、人参皂苷Rb1组、H2O2损伤组GSH含量分别为15.67±0.18、14.98±0.25、13.71±0.31,人参皂苷Rb1组、空白对照组分别与H2O2损伤组比较,P均<0.05。空白对照组、人参皂苷Rb1组、H2O2损伤组Caspase-3阳性率分别为12%±0.25%、57%±0.47%、28%±0.18%,PI染色阳性率分别为16%±0.25%、18%±0.45%、32%±0.56%,Ca2+荧光染色阳性率分别为8%±0.11%,31%±1.20%,19%±0.34%,人参皂苷Rb1组与H2O2损伤组比较,P均<0.05。结论人参皂苷Rb1能够拮抗H2O2对RGC-5细胞的氧化损伤,其机制可能为提高SOD活性、GSH含量,降低Caspase-3表达,减少Ca2+水平。

一种带AGC功能的RGC输入前置放大器设计

基于标准CMOS 0.18μm工艺,设计了一种带AGC功能的光接收机RGC输入前置放大器。该放大器采用电压并联负反馈结构;输入级采用RGC结构以拓展带宽,从而解决了宽带宽与高跨阻之间的矛盾;输出级接入单端转差分结构,使输出的信号能直接输入到后续的主放大器中;嵌入自动增益控制技术AGC,以解决输入动态范围与高跨阻、低噪声之间的矛盾。同时,选用SIMC0.18μm工艺库进行了模拟仿真。结果显示,当光接收机输入光功率为-10 dBm、电源电压为1.8 V、光检测器的寄生电容为0.5 pF时,此放大器具有良好的等效电流输入曲线和幅频特性。

RGC-32在结肠癌组织中的表达及临床意义

目的:探讨RGC-32(response gene to complement 32)在结肠癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法:选取2012年1月至2015年3月期间芜湖市第二人民医院收治的45例结肠癌患者及20例正常患者行结肠镜活检或结肠癌根治术的标本,采用免疫组织化学SP法检测RGC-32在结肠癌组织中的表达,分析RGC-32表达与结肠癌临床病理特征的关系。结果:RGC-32在结肠癌组织中的表达明显高于正常结肠黏膜组织(84.4%vs.15%,P<0.05);结肠癌组织中RGC-32高表达与肿瘤大小、分化程度、TNM分期及淋巴结转移等呈正相关(P<0.05),与患者年龄、性别无关(P>0.05)。结论:RGC-32在结肠癌高表达,并参与结肠癌的发生、发展。

Identifying specific RGC types may shed light on their idiosyncratic responses to neuroprotection

Retinal ganglion cells（RGCs）are located in the innermost layer of the retina and are the only retinal output neurons,conveying light information to the main retinorecipient target regions of the brain responsible for the image-and non-image-forming visual functions.There are well over twenty RGC types,each with its own dendritic morphology and physiological characteristics,