131I标记C（RGD）2修饰的脂质体的制备及生物分布研究

目的将c(RGD)2连接于脂质体表面并用放射性核素^131 I进行标记,通过放射性核素生物分布测定探讨脂质体介导的^131 I-c(RGD)2-Lp对比无脂质体介导的^131 I-c(RGD)2脑部摄取情况,为后续将^131 I-c(RGD)2应用于脑胶质瘤的诊断与治疗研究奠定基础。方法将c(RGD)2肽连接于脂质体上[c(RGD)2-Lp]。用放射性核素^131 I进行标记,得到核素探针^131 I-c(RGD)2-Lp,测定该探针在小鼠体内的生物分布,并与未连接脂质体的探针^131 I-c(RGD)2进行对比。结果^131 I-c(RGD)2-Lp主要浓聚在肝、脾、胃等脏器;而^131 I-c(RGD)2主要浓聚在肾、胃等脏器。^131 I-c(RGD)2-Lp在多数器官(除肾以外)中的放射性摄取值均比^131 I-c(RGD)2高。注射^131 I-c(RGD)2-Lp后6h在血液中的放射性摄取值为(3.222±1.205)%ID/g;而^131 I-c(RGD)2的血液放射性摄取值为(0.616±0.277)%ID/g;^131 I-c(RGD)2-Lp注射后6h在脑组织中的放射性摄取值为(0.133±0.053)%ID/g,而^131 I-c(RGD)2的放射性摄取值为(0.023±0.011)%ID/g,两者具有统计学差异(P<0.05)。结论脂质体修饰的c(RGD)2的生物分布与未修饰的c(RGD)2存在很大差异。^131 I-c(RGD)2-Lp的脑摄取值显著高于^131 I-c(RGD)2,并具有较长的血液循环时间,具有进一步应用于脑胶质瘤显像研究的可能性。

RGD修饰的肿瘤抑素19肽的合成与鉴定及其对肝癌SK-Hep-1细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用

目的:探讨精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)修饰对肿瘤抑素19肽(T-19)抗肝癌活性的影响,比较分析T-19及RGD修饰的T-19(RGD-T-19)对肝癌SK-Hep-1细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。方法:用Fmoc固相法合成T-19及RGD-T-19,用高效液相色谱仪和质谱进行分离、鉴定。常规培养SK-Hep-1细胞,用0、50、100、150、200、250μg/mL的T-19及RGD-T-19分别处理细胞,分为0μg/mL(对照)组、50μg/mL组、100μg/mL组、150μg/mL组、200μg/mL组、250μg/mL组。CCK-8法、克隆形成实验、划痕愈合实验和Tanswell小室实验、WB法和q PCR法分别检测SK-Hep-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力,以及环氧合酶-2(COX-2)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、组织基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)、TIMP-2蛋白和MMP-1、MMP-2 mRNA的表达。结果:经质谱鉴定,用Fmoc固相法合成的T-19及RGD-T-19纯度高。T-19和RGD-T-19均能显著抑制SK-Hep-1细胞的增殖、迁移、侵袭能力,抑制COX-2蛋白、MMP-2和MMP-9蛋白及mRNA的表达、促进TIMP-1、TIMP-2蛋白的表达(P <0.05, P <0.01, P <0.001),RGD-T-19的抑制或促进效应均明显强于T-19(均P <0.05)。结论:利用Fmoc固相法合成了纯度高、活性好的T-19及RGD-T-19,两种肽均能抑制SK-Hep-1细胞增殖、侵袭和迁移能力,RGD-T-19作用明显强于T-19。

负载RGD的PLA-HA骨仿生支架促进骨缺损早期修复的研究

目的:使用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽(RGD)修饰骨仿生支架并探究其应用于大鼠股骨缺损区的成骨性能。方法:通过三维(3D)打印技术制备聚乳酸-羟基磷灰石支架(PLA-HA),在其表面修饰甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和RGD构建复合水凝胶支架PLA-HA/GelMA/RGD(PHD),扫描电镜(SEM)表征支架表面形貌,CCK-8实验评估骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖能力。将18只SD大鼠随机均分为3组(n=6)制备股骨缺损模型,分别植入PLA-HA/GelMA(PHG)、PHD支架,空白对照组不植入。于术后4周拍摄Micro-CT测算骨缺损面积和新生骨指标,并对缺损区的股骨样本进行HE染色和Masson三色染色观察组织学形态。结果:SEM观察到支架和水凝胶孔径明显,同时水凝胶稳健的连接到支架表面;CCK-8结果显示与PHG组相比,PHD组显示细胞增殖活性更佳。术后4周,Micro-CT三维重建图像显示空白组和PHG组新骨形成较少,PHD组骨缺损内部见大量新骨形成,同时定量分析发现该组骨体积分数、骨小梁厚度均显著大于空白组和PHG组。组织学染色结果显示PHD组形成连续且致密的骨组织。结论:负载RGD的PLA-HA骨仿生支架在体外具有促进成骨细胞增殖的能力,同时在体内诱导大鼠股骨缺损区新骨形成,成功地实现了早期骨缺损修复。

RGD修饰的低分子量鱼精蛋白/CpG ODN复合物的制备及抗肿瘤活性

目的利用RGD修饰的低分子量鱼精蛋白(low molecular weight protamine,LMWP)包裹CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotide,CpG ODN)制备复合物,评价其对CpG ODN抗肿瘤活性的影响。方法基于静电引力将RGD-LMWP与CpG ODN以不同质量比共孵育制备复合物,并利用凝胶阻滞实验分析RGD-LMWP对CpG的缩合能力;使用zeta电位/粒度仪对RGD-LMWP/CpG复合物的粒径和zeta电位进行表征;采用体外细胞实验评价RGD-LMWP/CpG复合物对肿瘤细胞的摄取效率和细胞毒性。结果采用共孵育法成功制备了RGD-LMWP/CpG复合物。当RGD-LMWP与CpG的质量比为3∶1时,RGD-LMWP能完全压缩CpG。此时,复合物的平均粒径和zeta电位分别为119.7±1.2nm和47.9±0.5mV。体外细胞实验表明,与游离CpG比较,RGD-LMWP/CpG(3∶1)复合物能显著提高人子宫颈癌细胞株(HeLa)细胞对CpG的摄取效率,抑制HeLa细胞的增殖。结论RGD-LMWP与CpG结合形成的复合物可以有效地将CpG递送至肿瘤细胞内并诱导肿瘤细胞凋亡,是一种具有研究前景的抗肿瘤给药方案。

RGD和泊洛沙姆F127共修饰载多西紫杉醇脂质体的制备及体外抗卵巢癌的初步研究

目的制备精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(RGD)和泊洛沙姆F127共修饰载多西紫杉醇脂质体(DTX-F127-RGD-LP)并研究其对卵巢癌体外抗肿瘤效应。方法采用薄膜水化法制备DTX-F127-RGD-LP,通过电镜测定其形态,并进行粒径、电位、包封率、载药量等表征的测定及体外稳定性的考察;以香豆素6为荧光探针考察SKOV3细胞对修饰的脂质体的摄取情况,通过加入不同的内吞抑制剂研究修饰的脂质体的摄取机制;采用MTT法及结晶紫染色法考察修饰的脂质体对SKOV3细胞的毒性。结果DTX-F127-RGD-LP粒径为(107.2±0.67)nm,电位为-(19.7±0.4)mV,包封率为86.4%,载药量为2.7%,体外稳定性良好。RGD和泊洛沙姆F127修饰后显著增加SKOV3细胞对脂质体的摄取量,DTX-F127-RGD-LP的内吞主要通过小窝蛋白、巨胞饮以及整合素蛋白途径摄取进入细胞。与未修饰的脂质体相比,DTX-F127-RGD-LP对SKOV3细胞毒性最大,结晶紫染色法的结果与MTT结果一致,经计算DTX-F127-RGD-LP的IC50值为0.039μg·mL^(-1)。结论DTX-F127-RGD-LP能显著增强体外卵巢癌细胞的摄取,提高体外抗卵巢癌效应。

RGD肽偶联材料在实体瘤治疗中的应用

化疗药物的渗透性差和非选择性分布是实体癌化疗的主要障碍。近年来,很多研究通过RGD肽及其衍生物与药物分子或载体材料偶联再形成纳米药物来增加化疗药物的肿瘤靶向性及肿瘤渗透性来改善实体癌的治疗效果。本文介绍了实体癌治疗障碍,分析了RGD肽及其衍生物的作用机制,并对其与药物分子及脂质材料偶联形成的靶向材料在实体癌治疗中的应用及研究进展进行了综述。

含 RGD 四肽的合成与功能

在血小板依赖的血栓形成中，纤维蛋白与血小板表面ＧＰＩＩｂ／ＩＩａ受体结合是重要步骤。在受体识别中，ＲＧＤ（ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ，精·甘·天冬）是关键序列。含ＲＧＤ多肽的竞争抑制作用，表现为抗血栓作用。本文合成了ＲＧＤＳ，ＲＧＤＶ和ＲＧＤＦ３种四肽；测定了它们的舒血管活性和抗血栓活性；讨论了溶液中的构象对生物活性的影响。在大鼠血栓模型上，用５０μｍｏｌ·ｋｇ－１剂量，ＲＧＤＳ和ＲＧＤＶ无明显的抗血栓作用。用２５μｍｏｌ·ｋｇ－１剂量，ＲＧＤＦ的抗血栓作用有明显的统计意义。该结果与它们在溶液中的构象相关。３种四肽对主动脉条的舒血管作用体现另一种趋势，ＲＧＤＳ和ＲＧＤＶ显示明确的舒血管活性。小剂量时ＲＧＤＦ的舒血管作用与对照组相比，无统计学意义。

RGD-蜘蛛拖丝蛋白聚合物的生物合成与纯化

蜘蛛拖丝是自然界性能最好的蛋白质纤维之一 ,其独特的机械性能 ,良好的生物相容性和缓慢的可降解性 ,作为生物材料在组织工程领域有着潜在的应用前景。本文根据蜘蛛拖丝蛋白序列高度重复的特点 ,引入与细胞黏附有关的精氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 (RGD)三肽 ,化学合成RGD 蜘蛛拖丝蛋白基因单体 ,通过头尾相连倍加构建策略 ,首次得到RGD 蜘蛛拖丝蛋白基因 8聚体和 16聚体。分别将这两种多聚体与原核高效表达载体 pET 30a(+)连接 ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) pLysS ,用IPTG诱导表达。SDS PAGE图谱显示表达产物分子量分别为 35KD和 6 0KD ,与理论值基本相吻合 ;蛋白质印迹分析这两种表达产物均显示特异性。文中对表达产物的纯化方法进行了初步的摸索。

RGD多肽修饰的改性PLGA仿生支架材料对骨髓间充质干细胞粘附、增殖及分化影响的研究

目的:探索RGD多肽修饰的改性PLGA支架材料上骨髓基质细胞的增殖、粘附及分化情况。方法用异型双功能交联剂Sulfo-LC-SPDP将GRGDSPC多肽共价结合到改性PLGA支架材料上,以未接多肽的改性PLGA材料做对照,取第三代MSC接种到材料上,培养1d、2d、3d、4d后比较材料上的细胞密度来反映细胞的增殖程度;取第三代MSC接种到材料上,培养4h、12h后沉淀法定量检测粘附的细胞数,培养24h后摄光镜图像比较粘附细胞的数量和形态,并用FITC连接的鬼笔环肽对细胞骨架染色,在荧光显微镜下观察细胞骨架的组织情况;取第三代MSC接种到材料上,用成骨性培养基培养7d、14d、21d,检测细胞中ALP活性来了解MSC分化情况。结果:培养1d、2d、3d、4d后细胞的增殖程度无显著性差异;培养4h、12h后实验组细胞粘附率均显著高于对照组,且24h后细胞的粘附质量、细胞骨架的组织情况也较对照组为好;培养14d后实验组细胞表达显著高的ALP活性。结论:RGD多肽修饰对细胞增殖无明显促进作用,但能提高改性PLGA支架材料对骨髓基质细胞的粘附性,对MSC向成骨细胞分化有显著促进作用。

RGD类似物修饰的阿霉素隐形脂质体的制备及体外细胞结合试验

目的研究用精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)类似物(RGDm)修饰隐形脂质体(SL),以增加抗癌药物在肿瘤部位积蓄的同时,增加抗癌药物向肿瘤细胞内的传递。方法合成RGDm,将其通过PEG链与二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)连接形成导向化合物DSPE-PEG-RGDm,在此基础上制备RGDm修饰的隐形脂质体(RGDm-SL),阿霉素(DOX)作为模型药物通过硫酸铵梯度法装载。体外实验中,用pH探针(BCECF-AM)标记黑色素瘤细胞,通过细胞黏附试验考察导向化合物与肿瘤细胞的黏附情况;通过流式细胞实验和激光共聚焦显微实验考察肿瘤细胞对SL包封的阿霉素(SL-DOX)及RGDm-SL包封的阿霉素(RGDm-SL-DOX)的结合或摄取情况。结果与DSPE-PEG相比,黑色素瘤细胞与导向化合物DSPE-PEG-RGDm的黏附显著增加,过量游离RGDm的加入能抑制其黏附;与SL-DOX相比,RGDm-SL-DOX与黑色素瘤细胞共同孵育后,细胞对阿霉素的结合及摄取均显著增加。结论RGDm修饰的隐形脂质体可作为肿瘤靶向的载体通过受体介导的方式促进抗肿瘤药物向肿瘤细胞内的传递。

RGD多肽结合型长循环脂质体的肿瘤靶向性研究

目的 :研究RGD(精氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸 )多肽结合型长循环脂质体的肿瘤靶向性。方法 :将长循环脂质体 ,通过共价键反应与RGD基元多肽进行结合 ,然后研究其在荷瘤小白鼠体内的肿瘤靶向性。结果 :RGD结合型长循环脂质体在Colon26荷瘤小白鼠体内具有较好的肿瘤靶向性。结论

携RGDS超声造影剂的制备及体外靶向血栓研究

目的探讨制备携精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸(Arg-G ly-Asp-Ser,RGDS)靶向脂膜超声造影剂的制备,并对靶向微泡的特性及靶向作用进行初步鉴定。方法分别采用酰胺键共价键合的方式和表面吸附法将脂膜超声造影剂与RGDS血栓靶向短肽片段进行结合;制备产物通过流式细胞仪进行携带率和稳定性的检测;对内源性凝血途径产生的血栓进行寻靶作用研究。结果流式细胞仪显示共价键合RGDS脂膜超声造影剂其微泡外壳波长发生了明显变化,显示改变率达到82%,而表面吸附法制备的靶向超声造影剂改变率达到23%;激光共聚焦显微镜显示携带RGDS的脂膜超声造影剂在大量的PBS液清洗后,对离体血栓仍具有很强的靶向性和稳定性,而表面吸附法制备的靶向超声造影剂在大量PBS液清洗后,失去了其靶向性。结论采用共价键合的化学修饰方法可以成功制备稳定性好的亲血栓靶向脂膜超声造影剂。

含RGD基元多肽结合型长循环脂质体抗癌转移效果的研究

目的 研究RGD结合型长循环脂质体对黑色素瘤在小鼠体内肺转移的抑制作用。方法 以RGD结合型长循环脂质体与黑色素瘤细胞混合或直接静脉间隔给药 ,按设计时间处死动物 ,然后检查肺转移癌灶数目。结果 RGD结合型长循环脂质体对小鼠黑色素瘤实验性肺转移与自发性肺转移具有显著的抑制作用 (P <0 .0 1)。结论 含RGD基元多肽结合型长循环脂质体可能对新生肿瘤具有抑制与治疗作用。

131^Ⅰ标记RGD环肽在荷瘤小鼠体内分布与显像研究

目的研究^(131)I标记含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的小分子环形肽(cRGD肽)在荷瘤小鼠体内的分布与显像,探讨^(131)I-cRGD肽作为肿瘤诊治药物的可能性。方法利用氯胺T法对cRGD肽行^(131)I标记,建立荷黑色素瘤B16动物模型,分别进行体内分布实验、非标记cRGD肽竞争抑制实验及肿瘤显像研究。结果用统计软件SPSS 12.0进行分析。结果^(131)I-cRGD肽的标记率达90%,放射化学纯度达99%;荷瘤小鼠体内分布实验显示:给药后在血液、肾脏、膀胱有较高的放射性分布,小肠、肝脏、肌肉呈低水平放射性分布,24 h肿瘤/肌肉(T/M)放射性比值=6.34,肿瘤/血液(T/B)放射性比值=1.1。显像结果示:静脉注射^(131)I-cRGD肽后1 h肿瘤开始显影,随时间的延长,影像逐渐清晰,24 h时肿瘤显像最清晰。用非标记cRGD肽进行阻断实验,肿瘤的放射性摄取为(0.969±0.151)%/g,与非阻断组(1.40±0.136)%/g比较具有显著性差异。结论应用氯胺T法可以成功完成^(131)I-cRGD肽标记;尾静脉注射^(131) I-cRGD肽后,肿瘤表现为放射性浓聚,肿瘤对^(131)I-cRGD肽的摄取可被非标记的cRGD肽抑制,表明^(131)I-cRGD肽可与肿瘤新生血管αvβ3受体特异性结合,有望成为一种新型的肿瘤诊治药物。

细胞粘附位点RGD三肽脂质体的制备及表征

对RGD(Arg-Gly-Asp)三肽脂质体载药剂型进行研究,确定了薄膜超声法制备脂质体的路线.电子显微镜观察表明,脂质体粒径均匀,为100nm左右,属于小单室脂质体.脂质体中RGD量为2.4～2.5mg/mL,包封率达到70%.脂质体稳定性较好,而且具备pH5.4～6.0的靶向性,可能成为具有较好肿瘤细胞靶向性的脂质体制剂.

生物活性短肽RGD在PET表面接枝方法的研究

在高分子材料表面共价引入人工合成的精氨酰 -甘氨酰 -天冬氨酸三肽 (Arg- Gly- Asp peptides,RGD) ,以达到让内皮细胞与之特异结合并更加牢固的目的。实验用紫外辐照法将活性基团羧基 (- COOH)接枝到聚对苯二甲酸乙二醇酯 (Poly(ethylene terephtalate) ,PET)膜的表面 ,将液相合成的 RGD三肽耦合接枝到处理过的材料表面 ,光电子能谱对以羧基为活性基团的接肽反应结果进行分析 ,光学、电子显微镜观察内皮细胞生长情况以检测接枝短肽的生物活性。内皮细胞生长实验结果表明 ,成功接枝的 RGD序列对材料内皮细胞种植起到了促进作用。本实验成功运用紫外接枝与化学耦合 ,将生物活性短肽 RGD接枝到膜表面 ,探索了一种新的接枝生物活性短肽的方法。

含RGD序列环肽以及类似物的合成方法研究

通过文献检索 ,总结了含RGD序列环肽以及类似物的合成方法 .该类化合物的合成方法较多 ,生物活性较好 。

RGD三肽液相合成的研究

由N -保护的精氨酸、C -保护的甘氨酸采用混合酸酐法缩合成RG二肽 ,再与天冬氨酸在液相中合成RGD三肽。探讨了成酐和碱性试剂 ,反应温度 ,甘氨酸和天冬氨酸羧基保护等对缩合反应的影响。TLC跟踪反应与纯化全过程。以精氨酸计RGD三肽收率为 6 1.4 % ,HPLC确认其纯度为 88.6 6 %。

RGD多肽类药物设计、活性测定及^(99)Tc^m-cRGD二聚体的制备

通过V-life计算机模拟软件建立cRGD(cyclic Arg-Gly-Asp,cRGD)多肽类分子库,利用V-life软件中的DOCK功能对分子库内cRGD肽结构进行筛选评分,挑选出能与整合素αν3β受体高特异性结合的cRGD结构。将该结构进行改造后制备成二聚体,用99Tcm对该结构进行标记,制备成肿瘤分子探针。并对其标记条件、稳定性、水溶性和亲和力进行评价。结果表明,DOCK功能计算出评分最佳的cRGD分子结构为Cys-Arg-Gly-Asp-(D)Ser-Cys。将该结构进行改造制备成二聚体后,室温下、ρ(SnCl2.2H2O)=1 g/L、反应时间为30 min时,标记率可达(87.42±3.21)%,经Sephadex G10层析柱纯化后,其放化纯大于95%;在室温和37℃条件下,99Tcm-cRGD于生理盐水和正常人新鲜血清中均保持良好的标记稳定性;其脂水分配系数对数值lgP(正辛醇/生理盐水)为-1.96±0.01;与U87人神经胶质瘤细胞进行受体的放射性配基结合分析(radioligand binding assay of receptors,RBA)实验,其平衡解离常数(equilibrium dissociation constant,Kd)为(0.089±0.052)×10-9L/mol。这表明,通过计算机模拟系统筛选出的cRGD肽可与整合素ανβ3特异性结合,是一种有前景的整合素ανβ3受体阳性肿瘤显像剂。

RGDS-尿激酶原嵌合体的构建与表达

利用定点突变及ＤＮＡ重组技术，构建了在尿激酶原Ｋ区Ｃ端的β发夹区插入了精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－丝氨酸〔ＲＧＤＳ〕片段的尿激酶原嵌合体基因，并利用昆虫杆状病毒表达系统通过感染Ｓｆ９细胞对野生型及嵌合体尿激酶原进行了高效表达，表达量分别为１２００～１８００ＩＵ／（１０６细胞·ｍｌ）和１８００～２４００ＩＵ／（１０６细胞·ｍｌ）．经过ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ离子交换层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５凝胶过滤层析及超滤浓缩对野生型及突变型进行了部分纯化，并对其性质进行了初步研究．表明突变体尿激酶原保留了全部尿激酶原的纤溶酶原激活活性，并具有很强的抗血小板聚集活性．