建立检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2的mRNA相对表达水平的RT-qPCR方法

目的本研究旨在建立一种实时荧光定量PCR方法,用于检测猕猴三磷酸腺苷结合盒转运蛋白G2(adenosine triphosphate-binding cassette transporter protein G2,ABCG2)mRNA的基因转录水平。方法使用NCBI上GenBank数据库猕猴(Macaca mulatta)的ABCG2核苷酸序列号NM_001032919.1及内参GAPDH核苷酸序列号NM_001195426.1,借助Primer premier 5.0软件设计PCR引物。提取猕猴新鲜肾组织的总RNA,并反转录合成cDNA。接着,利用PCR引物进行实时荧光定量PCR扩增,并根据反应体系中荧光的变化情况定量分析ABCG2的mRNA相对表达水平。结果PCR产物测序结果显示,扩增的ABCG2和GAPDH核苷酸序列与NCBI上猕猴的序列同源性分别为90.91%和91.14%。ABCG2和GAPDH的扩增效率均达到80%~120%,实时荧光定量PCR标准曲线的熔解曲线为单峰,R2接近1。结论本研究建立的检测猕猴ABCG2 mRNA实时荧光定量检测方法,为研究高尿酸血症的发病机制以及新药开发奠定基础。

PEDV、PoRVA和PDCoV TaqMan三重RT-qPCR检测方法的建立与初步应用

旨在建立一种可快速同时检测猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪A群轮状病毒(porcine rotavirus type A, PoRVA)和猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV)三重荧光定量PCR方法。针对PEDV-N、PoRVA-VP6和PDCoV-M基因设计了引物和探针,条件优化后进行性能评估,并与商品化试剂盒检测对比。结果显示:本研究建立的三重RT-qPCR方法具有良好特异性,对PRRSV、PCV_2和PRV等阳性核酸不发生扩增;具有较高的敏感性,PEDV、PoRVA和PDCoV的最低检测限均达1 copies·μL^(-1);重复性良好,组内和组间变异系数均小于1%;样本适应性广,检测不同样本类型时,变异系数均小于1%。与商品化试剂盒对比,本研究建立的方法PEDV和PoRVA的检测符合率为92.5%和97.5%,并对PDCoV的检测范围更广,对其变异毒株仍有较好的检测效果。本研究建立的检测方法具有特异性好、敏感性高、稳定性强和样本适应性广等优势,为临床腹泻样本提供了一种好的检测方法。

用RT-qPCR方法评价4个不同猪品种骨骼肌候选内参基因

【目的】寻找合适的规范化策略研究猪骨骼肌相关基因。【方法】筛选TATA结合蛋白(TBP)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)、核糖体蛋白L4(RPL4)、肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)、β-2微球蛋白(B2M)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白(YWHAZ)、β-肌动蛋白(ACTB)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)8个候选内参基因,选取国外引进的长白、约克与杜洛克公猪,进行三元杂交生产的商品猪(DLY),长白、约克猪进行二元杂交的商品猪(LY),成华猪和藏猪共4个品种进行基因表达正常化评价。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper3种常用算法评估候选内参基因的稳定性。将3种常用算法的结果进行综合排名。【结果】8个候选内参基因在不同猪种中表现出较高的表达稳定性,但表达循环阈值不同。【结论】运用3种不同的评估算法可以筛选出相似的候选内参基因,该结果可为猪骨骼肌基因表达RT-qPCR分析内参基因的选择提供参考。

一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因RT-qPCR内参基因筛选

一心维纳斯蝴蝶兰(PhalaenopsisI-HsinVenus)花型优雅、花期持久、花香馥郁,是优良的香花品种,具有较高的园林观赏价值和经济价值。为筛选适用于一心维纳斯蝴蝶兰花香物质合成相关基因表达分析的内参基因,本研究以一心维纳斯蝴蝶兰不同花期(中蕾期、初开期、盛开前期、盛开中期、盛开后期、衰败期)的转录组数据为基础,选取了ACT1、ACT2、ACT3、GAPDH、EF1α、TUA、TUB和Ubi共8个管家基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测候选内参基因在花朵不同发育时期的表达情况,并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper三个内参基因稳定性分析软件对候选内参基因进行分析。综合分析结果表明,ACT1的稳定性最高,可作为一心维纳斯蝴蝶兰相关基因表达分析的最适内参基因。

基于转录组测序和RT-qPCR技术的烟草糖酯合成基因挖掘

为挖掘调控烟草糖酯合成的功能基因,采用转录组测序对烟草腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因及其功能进行分析,并利用RT-qPCR对分析结果进行验证。结果表明:共获得11962个腺毛细胞和叶细胞的差异表达基因,其中5145个上调表达基因,6817个下调表达基因;上调表达基因主要包括生物学进程(2265个)、分子功能(1169个)、细胞成分(363个)3大类,可将基因序列定位到122条代谢通路中,其中与糖酯合成相关的糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、苯丙烷类生物合成被高度富集,腺毛细胞中酰基糖通路显著上调,有12个基因在功能上与酰基转移酶有关;在腺毛细胞中,分析得到的12个基因中有11个基因的表达量都高于叶细胞,其中gene63826、gene16194和gene37511表达分别上调195.79倍、166.23倍和132.65倍。上述11个基因可能参与调控腺毛细胞合成糖酯,为下一步验证基因功能提供依据。

齿兰环斑病毒RT-qPCR检测方法的建立

【目的】针对齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus,ORSV)建立快速、有效检测方法,对于保障兰花规模化生产有重要意义。【方法】以齿兰环斑病毒为材料,根据NCBI上已登录的齿兰环斑病毒外壳蛋白(coat protein,cp)基因序列分析其序列保守区,使用Primer Premier 5.0设计反转录荧光定量PCR引物及TaqMan荧光探针,建立检测齿兰环斑病毒的一步法RT-qPCR。构建齿兰环斑病毒cp基因克隆质粒,并以该质粒作为标准品进行荧光定量PCR标准曲线测定;以齿兰环斑病毒、建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的病毒RNA为模板进行一步法RT-qPCR特异性检测;以10倍倍比稀释的cp基因质粒为模板进行灵敏性检测;用该法对大田18个兰花样品进行齿兰环斑病毒感染情况监测。【结果】齿兰环斑病毒一步法RT-qPCR检测法仅检出齿兰环斑病毒阳性模板,其余模板检测结果为阴性,说明检测方法具有特异性;该方法能够检测到的齿兰环斑病毒cp基因最低拷贝数为130;大田兰花样品感染齿兰环斑病毒的检出率为100%。【结论】一步法RT-qPCR是一种特异性强、灵敏度高,且适合监测实际生产过程中兰花感染齿兰环斑病毒情况的检测方法。

不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒的动态监测

为明确鸡群经不同途径感染禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的排毒动态,本试验通过设立无特定病原体(SPF)鸡胚6胚龄卵黄囊感染组、1日龄SPF鸡腹腔感染组以及对上述两组SPF鸡分别加入感染鸡的卵黄囊感染同居组和腹腔感染同居组,建立SPF鸡感染REV模型,同时设置空白对照组,在不同日龄记录各组鸡的体重和死亡情况,并综合运用反转录PCR(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和间接免疫荧光试验(IFA)3种检测方法对各感染组进行REV的动态监测。结果显示:(1)与空白对照组相比,腹腔感染组和卵黄囊感染组SPF鸡体重增长在感染后第21~70天均受到显著抑制(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡的死亡率在感染后第49和63天显著升高(P<0.05),腹腔感染组SPF鸡的死亡率在感染后第42天显著升高(P<0.05),卵黄囊感染组SPF鸡血浆中REV病毒载量在感染后第21天显著高于腹腔感染组(P<0.05);(2)卵黄囊感染组SPF鸡自出壳即可检测到病毒血症阳性,并在感染后第21天时达到排毒高峰,腹腔感染组SPF鸡在感染后第14天时达到排毒高峰;(3)卵黄囊感染同居组的10只SPF鸡在感染后第7天时即检测到2只鸡呈病毒血症阳性,腹腔感染同居组SPF鸡在感染后第21天时检测到1只鸡呈阳性;(4)3种检测方法中,RT-qPCR和IFA检出REV效果更好。本试验通过分析不同途径感染REV后鸡群血浆中的带毒状态,为REV感染的科学防控和净化提供参考数据。

芦笋皂苷合成相关糖基转移酶基因克隆及原核表达分析

【目的】克隆芦笋(Asparagus officinalis)甾醇糖基转移酶基因AoSGT1,分析其潜在催化活性,为解析芦笋皂苷合成途径及代谢调控机制提供科学依据。【方法】基于芦笋转录组数据设计特异性引物,扩增AoSGT1基因的完整开放阅读框(open reading frame,ORF),经测序验证获得目标基因序列并进行生物信息学分析;实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RTqPCR)测定各组织基因表达量;构建pGEX-4T-3-AoSGT1原核表达载体,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(De3),随后诱导实现重组蛋白表达。【结果】AoSGT1长1800 bp,编码599个氨基酸,其相对分子质量为66.72 kD,属于亲水性蛋白,无跨膜域和信号肽。系统发育结果表明,AoSGT1与盾叶薯蓣(Dioscorea zingiberensis)Dz3GT_(2)有较高同源性,同属UGT80B1亚家族。多序列比对揭示了该蛋白序列包含甾醇糖基转移酶保守结构域PSBD Box和PSPG Box,预示其具有对甾体化合物3β-OH位点潜在糖基化活性。RT-qPCR结果显示,AoSGT1在芦笋根中高表达,而在茎和花中低表达。此外,SDS-PAGE结果表明,目标蛋白在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达,其大小与预测值相符。【结论】成功克隆AoSGT1基因,并确认其在芦笋中呈现组织特异性表达,推测其可能参与芦笋甾体皂苷生物合成。同时,成功在大肠杆菌中实现了目标蛋白的异源表达。

不同温度胁迫下瓜实蝇RT-qPCR内参基因筛选

特定条件下稳定表达内参基因的筛选是利用实时荧光定量PCR研究基因表达的关键基础。本研究以不同温度胁迫后后的瓜实蝇Bactrocera cucurbitae 2龄幼虫、雌虫和雄虫为试验材料,对其9个候选内参基因表达进行了RT-qPCR分析,并利用ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和Ref Finder 4款软件分析各候选内参基因在3种虫态中的表达稳定性。结果表明,18S rRNA基因Ct值(≤5)较小,不适合作为内参基因使用,其它8个内参基因在瓜实蝇2龄幼虫中的稳定性排序为Rp L32> RPS13> TBP>β-tubulin> TUBE> Actin2> G6PDH> Actin3。雌虫表达稳定性由高到低为:RPS13> Rp L32>β-tubulin> TBP> TUBE> Actin2> Actin3> G6PDH。雄虫表达稳定性为Rp L32> RPS13>β-tubulin> TBP> TUBE> Actin2> G6PDH> Actin3。ge Norm软件分析各个虫态内参基因最佳组合均为2个。RPS13和Rp L32组合可作为瓜实蝇不同虫态下温度胁迫后的内参基因。

RT-qPCR法定量检测乳腺癌FFPE样本ER、PR、HER2、Ki-67表达的初步分析

目的初步探索实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法与免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)法检测乳腺癌福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed and paraffin embedded,FFPE)样本ER、PR、HER2、Ki-67的一致性及评估RT-qPCR法的应用前景。方法纳入术前穿刺诊断为乳腺浸润性导管癌、临床病理资料完整、肿瘤成分大于20%的FFPE样本73例。RT-qPCR采用人乳腺癌分子分型定量检测试剂盒(MammaTyper)检测。结果 RT-qPCR法与IHC法一致率ER、PR、HER2、Ki-67分别为90. 41%、87. 67%、84. 93%、94. 52%;一致性分析Kappa值分别为0. 777 5、0. 752 2、0. 701 2、0. 800 8。结论 RT-qPCR法与IHC法检测ER、PR、HER2、Ki-67具有较高的一致性;但在检测ER、PR和HER2时应注意导管原位癌和残存乳腺组织的可能影响,并进一步扩大检测样本量,不断优化RT-qPCR的截断值。与ER、PR和HER2相比,RT-qPCR法检测Ki-67可能具有更好的应用前景。

大蒲莲猪不同发育阶段组织RT-qPCR分析中适宜内参基因筛选

利用适宜数量且表达稳定的内参基因对目的基因的表达量进行标准化是获得准确、可靠RT-qPCR数据的重要条件。以不同日龄大蒲莲猪8种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肠组织、肌肉、血液)为试验材料,使用ge Norm、Norm Find软件对8个常用候选内参基因(ACTB、B2M、GAPDH、RPL4、SDHA、TBP、YWHAZ、PPIA)的表达稳定性进行分析,筛选适宜内参基因及其组合。ge Norm、Norm Find软件联合分析结果表明,不同日龄大蒲莲猪心脏中表达最稳定的内参基因为TBP、PPIA和YWHAZ,肝脏、肾脏、肠组织和肌肉中最稳定的内参基因均为TBP和PPIA,脾脏中表达最稳定内参基因为TBP和RPL4,肺脏中表达最稳定内参基因为TBP、RPL4、PPIA和ACTB,血液中表达最稳定内参基因为ACTB、YWHAZ和GAPDH。由于大蒲莲猪8种体组织中最适宜内参基因组合和数量不同,因此内参基因筛选是进行RT-qPCR数据分析的必要条件。结果可为研究大蒲莲猪目的基因表达时适宜内参基因的选择提供帮助。

同步检测PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

目前我国菠萝产区已相继报道3种菠萝凋萎相关病毒(PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3)。通过建立这3种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR(RT-q PCR)同步定量检测方法,为菠萝凋萎病毒的定性定量研究提供技术手段。根据这3种菠萝凋萎相关病毒的外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物和Taq Man水解探针,在优化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR反应体系后,以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线,初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR检测方法。其中PMWaV-1标准曲线为y=-3.283logx+39.02,其扩增效率达101.7%,线性相关系数R2=0.999;PMWaV-2标准曲线为y=-3.393logx+37.53,其扩增效率为97.1%,线性相关系数R2=0.998;PMWaV-3标准曲线为y=-3.171 logx+38.48,其扩增效率为106.7%,线性相关系数R2=0.996;这表明3种菠萝凋萎相关病毒质粒标准品在同一反应体系中可稳定扩增,且线性关系表现良好,可用于后续试验。灵敏度试验数据表明,该方法对PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低检测线分别为99,98,868拷贝;重复性试验表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-q PCR扩增曲线的标准差小于0.267,变异系数小于1.44%。这表明建立的三重RT-q PCR检测方法可快速、准确、稳定地定量检测PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3种病毒,为PMWaV的定性定量研究和复合侵染机制的探索提供了技术基础。

三阴性乳腺癌IL-17基因Real-time RT-qPCR检测法的建立与应用

目的:建立Real-time RT-qPCR(实时荧光定量RT-PCR)检测IL-17的方法,应用该方法检测三阴性乳腺癌(three negative breast cancer,TNBC)组织IL-17 mRNA的水平。方法:以TNBC组织为实验组,纤维腺瘤旁正常乳腺组织为对照组,并经HE染色病理分析确诊,Trizol法提取总RNA并反转录为c DNA。选β-actin作为内参,建立SYBR GreenⅠReal-time RT-qPCR检测法。利用该方法检测两组IL-17和β-actin的初始模板量,IL-17/β-actin计算IL-17 mRNA的相对表达量。结果:IL-17扩增效率为98.6%,相关系数0.997,溶解曲线为特异单峰,变异系数小于2.0%,IL-17 mRNA在TNBC组[(0.64±0.12)×10^(-2)]的相对表达高于正常对照组[(0.43±0.07)×10^(-2)],差异有统计学意义(P=0.025)。结论:成功建立了人源IL-17的Real-time RT-qPCR检测方法,TNBC组IL-17的高表达提示其可能与TNBC有一定关系,为研究TNBC的发病机制奠定了理论基础。

小麦mRNA剪接因子TaSR与TaHis的互作鉴定及其基因表达分析

为研究TaHis基因对小麦赤霉病的抗性机制,首先克隆了TaHis基因全长编码序列,构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,通过酵母双杂交技术对赤霉病诱导的小麦穗部酵母双杂交文库进行筛选,获得互作蛋白后利用酵母双杂交技术和双分子荧光互补技术验证蛋白质之间的互作,并利用RT-qPCR技术对抗感小麦材料中TaHis互作蛋白的赤霉病诱导表达模式进行分析。结果表明,成功构建了pGBKT7-TaHis诱饵载体,经过酵母双杂交文库筛选后,在四缺选择培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade)上获得了18个酵母单克隆。测序后Blast分析发现,共获得5个可能与TaHis互作的蛋白质,其中在6个酵母单克隆中均鉴定到富含丝氨酸/精氨酸的mRNA剪接因子SR45a类蛋白(TaSR)编码序列。以百农4299为材料,克隆了TaSR基因全长编码区,并构建了pGADT7-TaSR载体,酵母双杂交试验表明,pGADT7-TaSR和pGBKT7-TaHis共转化的酵母细胞在四缺培养基(SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA)上可以生长且显蓝色,表明TaSR和TaHis在酵母细胞中直接互作;构建了YC-TaHis、YN-TaSR载体,双分子荧光互补试验表明,共转化YC-TaHis和YN-TaSR的烟草细胞中产生强烈荧光信号,进一步验证了TaSR与TaHis的互作。RT-qPCR分析显示,TaSR在抗性材料百农4299中受赤霉病诱导后上调表达,在感病材料百农607中受赤霉病诱导后下调表达,表明TaSR基因表达量与小麦赤霉病抗性呈正相关。综上,小麦TaSR与TaHis存在相互作用,且TaSR基因表达量与小麦赤霉病抗性呈正相关。

均匀设计在候选内参基因RT-qPCR实验条件优化中的应用

目的探讨均匀设计在候选内参基因RT-qPCR实验条件优化中的应用,有助于后期实验筛选不同状态下THP-1细胞的稳定内参基因。方法以THP-1细胞cDNA为模板,cDNA模板量、引物浓度和退火温度3个因素为影响因素,应用均匀设计3因素8水平,探索影响候选内参基因RT-qPCR的扩增条件,检测不同实验条件下的扩增效果,在最优扩增条件下建立候选内参基因定量扩增的相对标准曲线,并检测扩增效率。结果通过均匀设计,完成对cDNA模板量、引物浓度和退火温度3因素8水平的实验条件优化,建立候选内参基因RT-qPCR检测的最佳组合为cDNA模板量0.5μg、引物浓度200μmol/L、退火温度55℃。结论本实验选用均匀设计优化RT-qPCR实验条件,筛选出THP-1细胞候选内参基因RT-qPCR的最优实验条件。均匀设计适合于本实验研究多因素多水平试验条件的配比。

PRV感染PK-15细胞后相关炎性通路及炎症因子表达变化

试验旨在了解猪伪狂犬病毒(PRV)感染宿主后炎症动态变化,以猪肾细胞为宿主,选用炎性通路中Toll样受体4(TLR4)、骨髓分化一级反应蛋白88(MyD88)、核因子kB(NF-kB)和炎症因子干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)为研究指标。通过PRV感染PK-15细胞和BHK-21细胞,对比分析两者细胞感染量(TCID_(50))、细胞病变(CPE)和病毒载量;选取PRV较敏感细胞,设计炎性通路因子特异性引物,用实时荧光定量PCR检测不同时间点TLR4、MyD88和NF-kB表达量,ELISA测定IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子含量。结果显示,PK-15细胞、BHK-21细胞的TCID_(50)分别为10^(-8.98)/0.1 mL和10^(-8.58)/0.1 mL;在感染PRV第18 h均见典型CPE。PK-15细胞病毒载量较高,且18 h内PK-15的CPE程度与病毒载量呈正相关。与未感染的PK-15细胞相比,PRV感染PK-15细胞后TLR4、MyD88和NF-kB表达量均在感染后0~6 h时升高,感染后第12 h时极显著降低(P<0.01);除IFN-β外的炎症因子含量总体呈先下降后上升趋势。研究表明,PRV感染宿主过程中可引起TLR4-MyD88-NF-kB通路表达量升高,促进炎症因子变化抵抗病毒感染,TLR4-MyD88-NF-kB炎症通路在抗PRV感染过程中发挥重要作用。

油菜蜂花粉总RNA(含小RNA)大量提取及RT-qPCR检测

大量提取含小RNA的油菜蜂花粉总RNA,为研究油菜蜂花粉所含外源性miRNA在动物和人体内发挥的生理和病理功能研究奠定基础。改良苯酚-氯仿法大量提取油菜蜂花粉总RNA,Nanodrop 2000检测浓度和质量,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性;所得的总RNA经过RT-qPCR扩增。提取的总RNA260/280为2.11,产量高于1‰。电泳条带清晰,完整性良好。可扩增出油菜基因组中的miR-159和miR-166a,且可进行丰度差异比较。本方法能大量提取包括油菜蜂花粉在内的植物RNA(含小RNA),为中草药和其他植物来源天然产物中功能性miRNA在动物和人体内发挥的生物学功能研究奠定基础。

水稻组蛋白H1三突变体的创建和转录组学分析

【目的】组蛋白H1对于染色质高级结构的维持和稳定具有重要作用,研究水稻H1对基因表达的影响,为深入理解水稻H1的生物学调控功能提供依据。【方法】通过半定量RT-PCR与RT-qPCR对水稻4个H1基因进行表达分析,利用CRISPR技术创建水稻H1基因编辑植株,鉴定突变体表型,对突变体进行转录组学分析。【结果】水稻4个H1基因的表达比较广谱,在根中的表达较低;在T_(0)代CRISPR突变体筛选过程中发现H1.1-H1.4发生多种突变;在T_(1)代筛选到一株Osh1.1 Osh1.3 Osh1.4纯合三突变体,该三突变体具有多种发育缺陷,成为转录组分析的材料;进一步在T_(2)代得到三突和四突群体,该群体约25%为白化苗,植株生长迟缓,在响应干旱胁迫方面发生缺陷;对三突变体进行转录组学分析,鉴定到1055个差异表达基因,显著上调的基因约为下调基因的2.5倍,说明H1可能具有抑制基因表达的功能。【结论】在突变体中,光合作用、胁迫响应、氨基酸代谢和RNA代谢等多种途径均发生调控紊乱;其中,核糖体蛋白和光合作用相关基因显著上调,与干旱胁迫相关的脱氢酶基因显著下调。核糖体途径基因过量表达可能造成蛋白质稳态失调,导致植物发育缺陷。

肯尼亚拟盘多毛孢几丁质酶基因鉴定及表达分析

利用生物信息学方法从重寄生肯尼亚拟盘多毛孢(Pestalotiopsis kenyana)PG52菌株基因组中挖掘几丁质酶基因并分析,通过检测锈孢子诱导不同时间段基因的表达情况筛选重寄生相关几丁质酶基因。结果表明:在PG52中共鉴定到20个GH18家族和1个GH19家族几丁质酶基因,分子量38.0~177.2 kDa,理论pI值范围3.97~9.25;其中7个有信号肽,13个定位在胞外。所有PGChns基因都含有GH18家族或GH19家族保守结构域;与木霉几丁质酶序列聚类分析显示,PG52含有7个sgA、4个sgB、8个sgC、1个sgD几丁质酶基因。锈孢子诱导下共18个几丁质酶基因在转录组中被检测到表达,7个基因在诱导24 h时表达量最高,6个基因在经诱导后持续下调表达,4个基因在诱导72 h时表达量最高。对6个表达量高以及表达倍数高的基因进行RT-qPCR分析,所有基因均出现显著差异表达,并在诱导72 h时表达量最高。经诱导后上调表达的PGChns很可能在PG52菌株重寄生过程中发挥破坏锈孢子壁的作用,需要后续进一步验证。

草珊瑚不同光质条件下RT-qPCR内参基因筛选与验证

为分析不同光质对草珊瑚目的基因表达量的影响,筛选出稳定表达的内参基因,根据草珊瑚转录组数据,选择激动蛋白(Actin)、β-微管蛋白(TUB)、SAND家族蛋白(SAND)、泛素蛋白(UBQ)、网格蛋白适配器复合物(CAC)等10个基因作为候选内参基因。以不同光质条件下草珊瑚幼苗的根、茎和叶组织为材料,利用实时荧光PCR技术,并结合geNorm、NormFinder、BestKeeper、The comparative delta-Ct和RefFinder等软件分析内参基因的表达稳定性,从而筛选出最佳内参基因,并通过对草珊瑚叶片碳代谢中7个关键酶基因的表达量分析,验证内参基因的准确性。结果表明,内参基因CAC在不同光质条件下草珊瑚幼苗的根、茎和叶组织中表达最稳定。在不同光质条件下,草珊瑚叶片碳代谢中7个关键酶基因相对表达量的变化趋势与转录组的相对一致。本研究筛选的最佳内参基因CAC可为后续准确分析草珊瑚功能基因在不同光质条件下的表达模式提供参考。