绿色荧光蛋白(GFP)标记杧果细菌性角斑病病原菌及其定殖规律

为研究杧果细菌性角斑病病菌在杧果不同器官组织中的定殖规律。利用电击转化法将质粒pBBR1MCS2-Tac-EGFP导入野油菜黄单胞菌杧果致病变种(Xanthomonas citri pv.mangiferaeindicae)菌株Xcm003中,通过转化子生长表型和外源基因的PCR鉴定,成功获得带绿色荧光蛋白(GFP)标记的转化子Xcm003-EGFP,采用室内刺伤和盆栽苗灌根接种试验,结合组织学观察法,追踪该病原菌在不同杧果器官组织中的定殖规律。结果表明,病原菌通过伤口侵入杧果果实果皮外层细胞层,随着侵染时间推移,向内层果皮细胞层垂直扩散并定殖,后期病原菌在伤口处大量聚集,出现隆起开裂状病斑。在杧果叶片中,病原菌从伤口侵入叶片上表皮细胞层,随后迁移到叶肉细胞间隙,侵染后期,病原菌在气孔和伤口定殖,造成气孔和伤口堵塞,导致接种点出现黑褐色水浸病斑。盆栽苗灌根后发现,该病原菌可在土壤中定殖,入侵杧果根部,但并不扩散至其他杧果组织,不会为害整株幼苗。说明杧果细菌性角斑病病菌可在不同杧果组织中定殖,但仅表现为局部侵染特性。

面向视频侦查应用的退化人像GFP深度复原技术

在视频侦查工作中时常遇到视频人像质量过低难以辨识的情况,而GFP等人像深度复原方法只适用于单张人像的复原。为此,本文提出一种基于GFP的监控视频人像复原技术,将GFP方法扩展至视频侦查应用,便于及时锁定犯罪嫌疑人,提高破案效率。首先对监控视频进行视频分帧、人像裁剪对齐、倾斜透视校正等预处理操作,然后使用GFP方法对预处理后得到的人像进行深度复原,最后经过逆处理将复原人像整合成高质量人像视频。在大量经过预处理后的模拟退化人像和无参考退化人像测试集上进行对比实验,结果表明,GFP方法在主观视觉效果和FID、PSFR、SSIM、NIQE等客观量化指标上均优于其他人像深度复原方法,相较于其他人像深度复原方法,能够更有效地复原复杂应用场景下的低质量退化人像,更适用于视频侦查应用;通过使用YTF视频人像数据集进行对比测试实验,结果显示,本文所提出的添加预处理与逆处理过程的基于GFP的监控视频人像复原技术,对于低质量视频人像有更加优秀的复原效果。

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建PD-L1-GFP报告基因HT29细胞株

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和同源重组技术在PD-L1基因的特定位置敲入绿色荧光蛋白(GFP)序列,构建含有PD-L1-GFP报告基因的结肠癌细胞(HT29)稳定细胞株。根据CRISPR-Cas9靶点设计原则,针对PD-L1基因终止密码子设计两对sgRNA,退火形成双链后连接至Lenti-V2空载质粒中,转化培养后提取质粒并测序验证。对于正确的Lenti-V2-sgRNA重组质粒,T7E1酶切验证其基因编辑效率。根据靶点位置设计左同源臂+GFP+右同源臂序列合成Donor片段,双酶切后连接至pUC19,重组载体转化扩增后同样进行质粒提取和测序验证。将验证成功的Lenti-V2-sgRNA和pUC19-donor-GFP共转染HT29细胞,荧光显微镜检测GFP表达情况,菌落PCR及基因测序验证GFP报告基因的靶向插入效果。经酶切和测序鉴定,靶向编辑PD-L1的Cas9载体Lenti-V2-gRNA和含GFP基因的Donor质粒pUC19-donor-GFP构建成功。两个重组质粒转染HT29细胞后,显微观察、多克隆验证、单克隆筛选及鉴定结果显示,GFP成功转入HT29细胞并进行了表达,经有限稀释法筛选出的单克隆细胞荧光均一,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明在PD-L1终止密码子前成功插入了GFP片段,细胞株构建成功。通过基因编辑技术成功构建了稳定表达PD-L1-GFP报告基因的HT29结肠癌细胞株,建立了一个可以直观在细胞上观察PD-L1是否表达以及表达的强弱程度的系统,为后期体内外筛选调控PD-L1的上游新靶点及药物奠定了基础。

采用GFP标记筛选抑制多血清型口蹄疫病毒3C基因表达的siRNA

为筛选出可抑制多种血清型口蹄疫病毒(FMDV)的小干扰RNA(siRNA),本试验通过多血清型口蹄疫病毒序列比对与siRNA设计分析,筛选出潜在抗多血清型siRNA位点;通过体外合成A型、O型和Asia I型病毒部分基因序列,制备绿色荧光蛋白(GPF)基因融合表达载体;将化学合成的siRNA与融合表达载体共转染,通过GFP观察、Western blot和实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)方法检验目标siRNA对融合基因的抑制效率。生物信息分析发现,多血清型口蹄疫病毒3C基因高度保守并存在潜在siRNA作用靶位,GFP-3C融合表达载体成功构建,与化学合成的siRNA1-3C共转染293T细胞,GFP观察发现,siRNA1-3C可有效抑制来源于A型、O型和Asia I型3C基因的GFP-3C荧光信号且持续时间达72 h,Western blot检测证实此结果。qRT-PCR检测发现,siRNA1-3C对3个GFP-3C融合基因转录水平抑制效率超85%,且作用可维持72 h。本试验利用GFP作为筛选标记成功筛选出1个作用于FMDV 3C基因的siRNA,为开发多血清型口蹄疫抑制剂提供参考依据。

基于mt-roGFP1探针研究除草化合物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响

【目的】研究几种代表性商品化除草剂以及植物源除草化合物小檗碱及其类似物对拟南芥根尖细胞氧化还原电位的影响。【方法】以靶向线粒体的氧化还原敏感绿色荧光蛋白(Mitochondria targeted redox-sensitive green fluorescent protein,mt-roGFP1)标记的拟南芥转基因植株为材料,采用不同质量浓度的化合物处理不同时间后,测定拟南芥根冠、分生区、过渡区和伸长区的细胞氧化还原电位的变化。【结果】经几种商品化除草化合物处理后,拟南芥根部分生区的细胞氧化还原电位最小。从分生区到伸长区氧化还原电位逐渐增大,呈现逐渐被氧化的趋势。其中,光系统II抑制剂(莠去津和环嗪酮)的氧化还原电位变化规律最为明显,说明mt-roGFP1荧光探针能较好地响应光系统II抑制剂。氨基酸生物合成抑制剂草甘膦对拟南芥根尖细胞氧化还原的影响具有明显的剂量−效应关系,随着草甘膦质量浓度增加,氧化还原电位变化量也逐渐增大,呈正相关关系(R^(2)=0.9956)。小檗碱及其类似物处理后,大多数处理组的拟南芥根尖细胞的氧化还原电位在分生区达到最大还原值,并从分生区开始逐渐被氧化。【结论】研究结果可以为应用roGFP荧光探针技术研究除草化合物对根系细胞线粒体的作用机制提供基础。

乌梅丸对乳腺癌MDA-MB-231-GFP细胞小鼠移植瘤的作用及其机制研究

目的探讨乌梅丸对乳腺癌MDA-MB-231-GFP细胞小鼠移植瘤的作用及其可能机制。方法选择SPF级雌性小鼠为试验动物,建立人乳腺癌MDA-MB-231-GFP细胞小鼠移植模型,随机分为模型组(灌胃口服0.9%氯化钠溶液)、阳性对照组(腹腔注射紫杉醇20 mg/kg)、乌梅丸组(灌胃乌梅丸颗粒剂药液),每日1次,连续30 d。观察小鼠一般情况,利用荧光成像系统采集肿瘤图像,以系统自带软件计算肿瘤面积;称取小鼠肿瘤质量和肺癌转移灶数;qPCR检测小鼠肿瘤组织中Fas、FasL mRNA水平;Western blotting检测小鼠肿瘤组织MDAMB-231细胞中Fas相关死亡域蛋白(FADD)、活性半胱天冬酶8(cleaved caspase-8)、Fas、FasL蛋白表达。结果模型组、乌梅丸组和阳性对照组小鼠肿瘤面积持续增大,呈时间依赖性(P<0.05);与模型组比较,乌梅丸组与阳性对照组小鼠肿瘤面积较小,肿瘤质量较低,肺癌转移灶数量较少(P<0.05);与乌梅丸组比较,阳性对照组小鼠瘤面积较小,肿瘤质量较低,肺癌转移灶数量较少(P<0.05)。与模型组比较,乌梅丸组小鼠Fas mRNA相对表达量较高、FasL mRNA相对表达量较低,FADD、cleaved caspase-8、Fas蛋白相对表达量较高、FasL蛋白相对表达量较低(P<0.001)。结论乌梅丸对乳腺癌MDA-MB-231-GFP细胞小鼠移植瘤有抑制作用,并抑制肺转移,其可能机制与调控Fas/FasL通路蛋白有关。

CRISPR/Cas9介导的高效四倍体马铃薯试管薯基因编辑体系的建立

【目的】基因编辑技术的发展使得马铃薯实现精准分子育种成为了可能,试管薯作为遗传转化的理想材料,但其诱导和转化具有基因型依赖性,建立高效且普遍适用的试管薯基因编辑技术体系可为其精准分子育种提供技术支撑。【方法】以四倍体栽培马铃薯品种青薯9号和并薯6号为材料,对试管薯诱导及其遗传转化体系进行摸索;同时,转化CRISPR/Cas9基因编辑载体进行基因组编辑。另外,利用筛选的条件对其他3个马铃薯品种进行测试。【结果】全黑暗条件下,采用2叶/段的扩繁方式,在含有10%蔗糖和5 mg/L激动素的培养基上,5个马铃薯品种均可成功诱导出试管薯,但诱导效果存在差异。青薯9号的最佳分化激素配方为0.5 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.2 mg/L吲哚-3-乙酸、0.2 mg/L赤霉素、2 mg/L玉米素,再生效率、转化频率和基因编辑效率分别为41.5%、51.9%和82.1%。利用上述筛选的激素配方,在其他4个四倍体马铃薯品种中均可高效地实现试管薯的遗传转化再生,其中并薯6号、Desiree和晋薯16号的编辑效率分别为63.2%、33.3%和10%。【结论】建立了5个不同基因型四倍体马铃薯高效的试管薯遗传转化再生体系,其中的4份材料成功地实现了基因组编辑。

生防菌ZJY-1及ZJY-116的GFP标记及其在黄瓜根围的生态适应性

将具有绿色荧光蛋白(GFP)标记和氯霉素抗性的重组质粒pRP22-GFP导入生防菌BrevibacillusbrevisZJY-1和Bacillus subtilisZJY-116中,用这些标记菌株处理黄瓜种子,出苗后通过定期分离计数具有上述表型的转化子,研究了2株生防菌在黄瓜根围的定殖规律.结果表明,在整个生育期2株生防菌株均能在黄瓜根围有效定殖,并在黄瓜盛花期和盛果期出现数量高峰.盆栽试验发现,引入黄瓜根围的2株生防菌有向周边杂草迁移的特性,且在前一季寄主植物死亡后,菌株可在下一季植株根围增殖.

GFP基因在软枣猕猴桃愈伤组织原生质体中瞬间表达的初步研究

用PEG介导法对游离出来的软枣猕猴桃原生质体进行遗传转化,成功地将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入了原生质体,并获得了瞬间表达.结果表明,影响GFP基因转化的因素主要是材料的生理状态,PEG的种类和浓度;适宜的转化条件和方法为,将从白色、较为疏松愈伤组织中游离的原生质体,悬浮到质量分数为13%甘露醇的洗液(CPW13)中,置于45℃水浴中热激5min,再放在冰浴中迅速冷却;加入质粒,轻轻混匀后静止10min;逐滴加入质量分数40%PEG6000介导转化,终浓度为100g·L-1,在室温下放置20min;逐滴加入CPW13稀释转化后的原生质体,以避免PEG浓度剧烈变化造成细胞膜破裂.

灰树花多糖纳米乳的制备及其对H9亚型禽流感病毒与常见细菌抑制效果的评估

为制备灰树花多糖(GFP)纳米乳,并观察其理化及形态学特征,评估其对H9亚型禽流感病毒(AIV)及3种常见细菌的抑制效果,本研究采用低能乳化法制备GFP纳米乳,经不同方式处理后观察GFP纳米乳的稳定性,分别采用透射电镜和扫描电镜观察其形态特征,使用激光粒度仪测定GFP纳米乳的粒径与多分散系数(PDI),使用电位仪测定其Zeta电位。结果显示:该GFP纳米乳外观澄清、透明,8000 r/min离心20 min和室温静止7 d后不分层、不破乳,表明制备的GFP纳米乳性状稳定。电镜观察可见许多单一分布的均匀圆球,其周围包裹着网格状凝胶基质;GFP纳米乳的粒径为10 nm~100 nm,平均粒径24.12 nm,PDI为0.096,Zeta电位为-18.6±4.3 m V,表明GFP纳米乳稳定性较好。将不同浓度的GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂分别于MDCK细胞中与H9亚型AIV NJ02株作用,通过计算各药物对H9亚型AIV的抑制率比较GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制效果。将不同稀释度的GFP纳米乳、GFP溶液及免手洗凝胶和75%乙醇分别与AIV NJ02株作用后,采用荧光定量PCR(q PCR)检测H9亚型AIV基因的拷贝数,并计算各药物对H9亚型AIV的抑制率。采用药敏纸片法检测GFP纳米乳、GFP原液、免手洗凝胶对禽舍3种常见细菌的抑菌效果。对H9亚型AIV的抑制率检测结果显示,当浓度低于10μL/mL时,GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂对H9亚型AIV的抑制率均小于55%,效果不明显;当浓度大于40μL/mL时,GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率极显著高于同浓度的免手洗凝胶(P<0.01);当浓度为80μL/mL时,GFP纳米乳可以100%抑制病毒增殖,且对细胞无毒性。qPCR结果显示,10倍稀释的各药物对H9亚型AIV的抑制率均明显高于100倍稀释的各药物,且10倍稀释的GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率均极显著高于免手洗凝胶、GFP原液和75%乙醇(P<0.01)。纸片扩散法结果显示,GFP纳米乳对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较强,但总体GFP纳米乳的抑菌效果比免手洗凝胶稍差。上述结果表明,本研究制备的GFP纳米乳性状稳定,对体外培养的H9亚型AIV具有良好的抑制效果,对禽舍常见细菌具有一定的抑制效果,且安全无毒副作用,有望作为安全高效的纳米消毒剂用于畜禽和人类的消毒。本研究为开发新型抗病毒中草药纳米消毒剂奠定了实验基础。

GFP标记溶磷草木樨中华根瘤菌CHW10B及其定殖

【目的】为有效利用草木樨中华根瘤菌CHW10B菌株,对绿色荧光蛋白（GFP）标记的菌株在南方红豆杉根际及其根部的定殖进行研究。【方法】采用修改的反复冻融转化方法,将穿梭载体p GFP4412质粒转化进入草木樨中华根瘤菌CHW10B细胞,对该菌株进行GFP标记,筛选荧光表达强烈且稳定遗传的转化子,对转化子的细胞及菌落形态特征进行观察,并采用钼锑抗比色法对其溶磷能力进行测定。在此基础上,以GFP基因标记和抗性标记作为示踪手段,将GFP标记的CHW10B菌株接种到南方红豆杉1年生盆栽实生苗根表面,借助荧光显微镜及稀释涂布技术,对根际土壤中GFP标记菌株进行定期回收检测。【结果】成功获得CHW10B菌株荧光表达强烈且稳定遗传的GFP转化子,该转化子及野生菌株均为革兰氏阴性（G-）,短杆菌,但二者在LB固体平板上的菌落形态有一定差别。野生菌株菌落呈圆形、边缘整齐,表面湿润黏稠,为乳白色;而标记菌株CHW10B-GFP2菌落表面为浅棕色,其他一致;标记菌株溶磷能力与野生菌株接近,发酵液上清液中可溶性磷含量分别为639.12和656.57 mg·L-1。GFP标记菌株在南方红豆杉根际的数量变化幅度较大,接种1天根际土壤中CHW10B转化子菌数为6.08×107cfu·g-1,随后细菌数量迅速减少,15天后标记细菌数量开始增多,25~40天菌体数量升高并呈平稳趋势。用荧光显微镜对接种40天后南方红豆杉的根部进行观察,发现在根系表面及其内部有大量发绿色荧光的GFP标记细胞存在。【结论】GFP基因标记的CHW10B菌株在南方红豆杉幼苗根际土壤中具有持久性定殖的能力;另外,该标记菌株能在根表面和内部定殖,具有内生性。

利用GFP和抗性双类型标记监测联合固氮菌在玉米根际的定殖

将来自质粒pKRP10、pKRP11和pKRP12的氯霉素、卡那霉素和四环素抗性基因分别插入质粒GFPmut2中gfp基因下游的PstI位点 ,得到gfp和不同抗性基因共存的重组质粒 ,转化Enterobactergergoviae 5 7- 7野生型菌株和耐铵工程菌E7后 ,得到既有抗生素抗性又在蓝光下呈现亮绿荧光的菌株 .用它们接种玉米后 ,利用这两种选择标记双重筛选重新分离到的细菌确定了接种菌在玉米幼苗根表面的定殖数目 ,同时用荧光显微镜观测了它们在玉米根表和土壤中的分布 .确证了GFP与抗生素抗性双标记定量环境中微生物的可靠性和GFP标记用于原位监测细菌分布的优越性 .图版 1图 1表 2参

α-synuclein-EGFP在体外培养SH-SY5Y细胞中过表达对包涵体形成及线粒体结构改变的影响

为了观察 α-synuclein-p EGFP真核载体在 SH-SY5 Y细胞内表达状况及其对细胞的影响 ,本研究用 L ipofect AMINE法转染 SH-SY5 Y细胞 ,用荧光显微镜检测报告基因表达产物 EGFP,用荧光免疫细胞化学法检测α-synuclein蛋白表达以及用 H-E染色、光学显微镜观察转基因表达产物在细胞内的积聚 ,电镜观察转基因细胞超微结构形态学变化 ,rhodamine12 3染色、荧光显微镜检测线粒体跨膜电位变化。结果证明 ,该载体转染 SH-SY5 Y细胞后 ,在细胞内同时表达报告基因和目的基因 ;外源基因的表达产物可在细胞内积聚形成包涵体并引起线粒体结构和功能改变。本研究结果提示 ,本实验获得的细胞模型可模拟 Parkinson病发生过程中一些基本的神经病理学特点 ,可为进一步探讨

BrdU,CFSE和GFP标记大鼠间充质干细胞的比较

目的:研究BrdU,CFSE和GFP作为大鼠间充质干细胞标记物的可行性.方法:分别用上述三种标记物标记大鼠间充质干细胞,检测即时、15和30d的标记率,通过检测细胞周期、凋亡率和描绘生长曲线,来明确标记物对体外培养大鼠间充质干细胞生长特性的影响;通过流式细胞仪检测标记物对细胞表面标志(CD29,CD34,CD44,CD45)表达的影响.结果:BrdU,CFSE,GFP的即时标记率为77.0%,99.4%,89.7%,1mo后分别下降至51.9%,77.5%,82.9%.三者对体外培养的大鼠间充质干细胞的生长特性和表面标志的表达均无明显影响.结论:GFP,BrdU和CFSE均可以作为大鼠间充质干细胞的标记物.

GAD67-GFP精神分裂症小鼠行为学改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达

目的:探讨谷氨酸脱羧酶67-绿色荧光蛋白(GAD67-GFP)基因敲入小鼠制备精神分裂症模型后学习与记忆功能的改变及海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元的表达。方法:利用聚合酶链式反应(PCR)鉴定GAD67-GFP基因敲入小鼠,MK-801连续腹腔注射2周制备精神分裂症动物模型,通过悬尾实验、Morris水迷宫实验、免疫荧光标记技术等,观察GAD67-GFP基因敲入小鼠的学习与记忆功能的改变及GABA能神经元在海马齿状回颗粒细胞层的表达。结果:停药后实验组与对照组比较:(1)实验组体重增加明显低于对照组(P<0.05);(2)行为学改变:1悬尾实验:实验组不动时间明显小于对照组(P<0.05);2Morris水迷宫实验:定位航行实验中实验组逃避潜伏期,游泳总路程明显长于对照组(P<0.05),而其平均游泳速度与对照组没有明显差异(P>0.05);空间探查实验中实验组经过平台所在点的次数和在平台所在象限的时间明显小于对照组(P<0.05);(3)在海马齿状回颗粒细胞层中实验组的GFP阳性细胞明显多于对照组(P<0.05)。结论:通过对GAD67-GFP基因敲入小鼠进行腹腔注射MK-801制备精神分裂症模型后,其学习与记忆功能显著下降,且海马齿状回颗粒细胞层GABA能神经元明显增加。提示精神分裂症后学习记忆功能减退可能与GABA能神经元的表达有关。

根癌农杆菌介导苎麻转绿色荧光蛋白(GFP)基因植株再生

以苎麻优良品系"5041-3"子叶作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究,农杆菌菌株为EHA105,重组质粒为pBINm-GFP5-ER。经农杆菌浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再生出抗性植株,对抗性植株的再生过程进行了GFP荧光检测,结果表明,GFP基因能在苎麻中强烈表达,证明GFP基因能够在苎麻遗传转化中得到应用。对抗性植株的Southern杂交检测证实外源基因已整合到苎麻基因组中。

GFP基因在新疆小拟南芥和拟南芥中的表达分析

以质粒pMCB30为模板,扩增GFP基因,连接到载体pCMBIA2300-35S-OCS上,构建过量表达载体p35S:GFP,将其转入农杆菌GV3101.通过农杆菌介导法将p35S:GFP载体分别转入新疆特色植物小拟南芥和拟南芥中.T0代经含有卡那霉素的1/2MS培养基筛选,获得了T1代转基因小拟南芥2株,T1代转基因拟南芥9株.通过激光共聚焦显微镜观察,在转基因小拟南芥和拟南芥的根尖细胞中均可检测到GFP绿色荧光蛋白;对转基因植株进行PCR扩增,均可检测到GFP基因,表明GFP基因已成功转入小拟南芥和拟南芥中.该研究建立了小拟南芥的遗传转化体系,为进一步利用GFP基因和进一步研究小拟南芥的功能基因奠定基础.

GFP标记的球孢白僵菌在玉米中的定殖

为明确球孢白僵菌在玉米中的定殖分布规律以及不同施用方式和处理浓度对玉米生长发育的影响,本文利用绿色荧光蛋白(GFP)标记的球孢白僵菌,在激光扫描共聚焦显微镜下观测了球孢白僵菌在玉米根部、茎部和叶部的定殖情况,同时检测了不同接种方式在球孢白僵菌不同处理浓度下对玉米生长指标的影响。结果表明,球孢白僵菌在玉米不同组织部位上的定殖有着明显的差异,各球孢白僵菌接种处理中,均以叶部定殖的白僵菌孢子数最多,而茎部均未观测到孢子定殖;玉米根部仅在浸种和灌根处理中可见少量孢子。球孢白僵菌不同接种方式对其在玉米中定殖率的影响差异较大,灌根处理定殖率最高,为76.7%;其次为浸种处理,为73.3%;茎部注射处理及叶面喷施处理定殖率较低,分别为43.3%和36.7%。研究表明,不同施用方式及接种浓度球孢白僵菌孢悬液对玉米生长指标有一定的影响,球孢白僵菌可通过不同接种方式在玉米植株中定殖并扩散,对玉米的生长发育有一定的促进作用,其中以1×106～1×107孢子/mL球孢白僵菌孢悬液浸种或灌根,对玉米苗的促进生长作用最明显。

利用GAD67-GFP基因敲入方法显示小鼠脊髓内表达GFP的GABA能神经元的分布(英文)

γ-氨基丁酸 (GABA)是脊髓背角、前角内主要的抑制性神经递质。为了更好地观察脊髓背角内 GABA能神经元的形态和功能 ,本研究使用了两种谷氨酸脱羧酶 67-绿色荧光蛋白 (GAD67-GFP)基因敲入小鼠 ,并观察了敲入小鼠脊髓内的 GFP表达状况。用免疫荧光组织化学双标记方法显示脊髓内所有的 GF P阳性神经元基本上都呈 GAD67和 GABA阳性 ;GFP阳性神经元在脊髓背角的 ～ 层最为密集 ,背角深层内侧部及中央管周围呈中等密度分布 ,而在脊髓背角其它部位及前角则呈散在分布。脊髓内 GFP阳性神经元的分布与 GABA能神经元的分布一致。本文作者等还进一步在 GAD67-GFP敲入小鼠中观察了 GFP和神经元标志物神经元核蛋白 (Neu N )的共存状况。脊髓背角内 GFP阳性神经元分别占 、 和 层的 Neu N阳性神经元的 3 1.5 %、3 3 .3 %和 44 .7% ,与以往的 GABA免疫组化研究结果基本一致。本研究表明 GAD67-GFP基因敲入小鼠脊髓内的 GFP在GAD67启动子的调节下正确地表达于 GABA能神经元 ,该基因敲入小鼠可用于脊髓

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的 构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体。方法 利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1 IRES EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP +E86和PA3 17,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;“乒乓球”法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT PCR法分别检测细胞荧光和Delta1mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能。结果 酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1 IRES EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9 7×10 5CFU ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化。结论 逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达。