胎盘生长因子串联scFv质粒构建表达及亲和力测定

目的:构建并表达胎盘生长因子串联scFv,提升对胎盘生长因子的亲和力。方法:设计不同长度的柔性连接子连接的串联scFv,构建串联scFv质粒,并分别将串联scFv与亲本scFv于原核表达系统进行表达。通过间接ELISA分别测定串联scFv及对应亲本scFv亲和力,分别对数据进行单因素ANOVA方差分析,并使用Dunnett-t检验进行组间比较。结果:柔性连接子长度的不同,会对串联scFv亲和力造成差别。单因素ANOVA方差分析结果表明,各组亲和常数间存在明显的统计学差异,Dunnettt检验组间比较结果可知,当串联scFv间柔性连接子(GGGGS)n长度n=4和n=5时,亲和力较亲本提升不明显(P>0.05);但亲和力在n=6(t_(335)=33.90,t_(7A10)=32.00,均P<0.000 1)及n=7(t_(335)=91.68,t7A10=90.71,均P<0.000 1)时较两亲本均有明显提升。结论:串联scFv可以明显提高单体scFv亲和力。

KGla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达

目的 :用噬菌体展示技术构建KGla免疫小鼠的脾细胞scFv表达文库。方法 :用人髓系白血病细胞系KGla细胞免疫小鼠 ,取其脾细胞 ,RT PCR扩增VH和Vκ基因并克隆入噬菌体展示表达载体 ,构建scFv文库 ,并测定文库的库容量和BstN1酶切单个克隆分析文库的多样性。用KGla作为固相抗原 ,进行四轮吸附 洗脱 富集的筛选 ,SDS PAGE检验筛选后文库scFv的呈示表达。结果 :文库的库容为 3× 10 6cfu ,单个克隆的BstN1Ⅰ酶切图谱显示多样 ,提示文库的容量和多样性均能满足进一步筛选分离目的基因的需要 ,筛选后的文库能很好地表达外源scFv。结论

抗人乙酰胆碱受体scFv-人血清白蛋白融合蛋白的构建及在大肠杆菌中的表达

目的:制备抗人乙酰胆碱受体单链抗体637(scFv637)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白,提高scFv637的稳定性。方法:用PCR扩增人HSA基因,并克隆到含有抗人乙酰胆碱受体scFv637基因的载体pHEN2中构建重组载体pHEN2-scFv637-HSA。以重组载体转化E.coliHB2151,表达产物用斑点杂交试验检测,并以SDS-PAGE和Westernblot鉴定其融合蛋白的相对分子质量(Mr)。结果:琼脂糖凝胶电泳显示,扩增的人HSA基因和融合基因的大小分别为1770bp和7054bp。构建的scFv637-HSA经测序证实核苷酸序列正确,并且正确克隆至载体的开放读码框架内。表达产物仅存在于pHEN2-scFv637-HSA转化的E.coliHB2151外周质裂解液中。表达的融合蛋白的Mr约为95900。结论:在E.coli中成功地表达scFv637-HSA融合蛋白,为进一步对其进行功能研究和应用奠定了基础。

抗隐孢子虫子孢子ScFv-PE40免疫毒素表达质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

用PCR方法扩增抗隐孢子虫子孢子ScFv片段,插入表达载体pET-28a中,构建重组质粒pET-28-ScFv,然后,将绿脓杆菌外毒素(PE40)片段定向克隆到ScFv基因的下游,构建免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。经酶切分析、PCR检测和测序进行鉴定。成功地构建了免疫毒素表达质粒pET28ScFv-PE40。将上述质粒转化受体菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,成功地表达了目的蛋白。免疫毒素ScFv-PE40大小约为66kDa,表达量约占菌体蛋白总量的14%。

二硫键稳定的抗肝癌人源化scFv-hTNFα突变体融合基因在大肠杆菌中表达

目的 提高抗肝癌抗体靶向人肿瘤坏死因子(hscFv2 5-hTNFα)的稳定性和杀伤活性 ,并探讨该新型靶向细胞因子在大肠杆菌中的可溶性表达。方法 以引物PCR法和重叠延伸PCR法 ,对人源化抗肝癌hscFv2 5及hTNFα基因进行定点突变 ,构建重组表达载体 pGEX -hFvT ,并以IPTG在大肠杆菌中诱导表达。用免疫组化染色和MTT比色法 ,分别检测重组蛋白的抗体和hTNFα突变体的双重活性。结果 重组基因在大肠杆菌中获得高效可溶性表达。表达产物具有抗体和hTNFα突变体的双重活性 ,重组蛋白的稳定性得到大幅度提高 ,抗体活性于 4℃放置 3个月活性无明显下降 ,抗肿瘤活性较天然hTNFα高 4倍。结论 重组基因在大肠杆菌中获得了高效功能性表达 ;重组蛋白稳定性及抗肿瘤活性得到大幅度提高 。

高亲和力抗Met人源基因工程抗体scFv的筛选与特性分析

目的应用噬菌体展示技术制备抗HGF受体Met特异性、高亲和力的全人抗体scFv片段。方法以从天然抗体库中筛选出的Fab基因可变区VH和VL为模板,分别在CDR区引入有限突变和随机突变,扩增出scFv基因库,克隆于pComb3XSS中,构建scFv次级突变抗体库,筛选高亲和力克隆。结果经5轮细胞筛选和2轮抗原固相筛选,选取60个克隆进行ELISA检测,选择较高亲和力的噬菌体抗体,克隆于原核表达载体pBAD-gIII/A中,经诱导表达、SDS-PAGE和Westernblotting分析,在相对分子质量30000处出现预期大小的蛋白条带。单链抗体经表达、变性与复性和IMAC亲和纯化后,用于流式细胞术、免疫沉淀分析,结果表明,scFv能够与S114细胞表达Met的胞外区特异性结合,其亲和常数Kd值为4.76×10-8mol/L,与突变前抗体的亲和力(Kd值为5.24×10-6mol/L)相比,抗体的亲和力提高约100倍。竞争ELISA结果显示,亲和力成熟后抗体的抗原结合表位未变。结论经过CDR突变和抗体库筛选,有效提高了抗体的亲和力,该抗体有望成为临床肿瘤诊断或治疗的候选分子。

抗肝癌单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40的构建及其导向作用的实验研究

目的构建单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40并探讨其导向细胞毒作用。方法采用亚克隆技术,首先将HAb25(scFv)与绿脓杆菌外毒素基因突变子PE40,在p ly5载体上构建HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pBV220原核表达载体中,转化DH5α宿主菌,温度诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法;间接免疫荧光染色鉴定HAb25(scFv)-PE40与肝癌细胞结合的特异性;体外导向细胞毒实验明确其是否具有选择性靶细胞杀伤活性。结果限制性酶切图谱和序列分析证实在p ly5载体上成功地构建了HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;该单链免疫毒素基因在pBV220载体中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的43.3%;纯化后的HAb25(scFv)-PE40间接免疫荧光染色显示具有与亲本抗体HAb25相同的抗原结合特性;导向细胞毒实验结果显示HAb25(scFv)-PE40具有明确的选择性靶细胞杀伤活性。结论已成功构建和高效表达了单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40,该免疫毒素有选择性地杀伤靶肝细胞的生物活性(P<0.001),为其进一步的基础和临床应用研究奠定了基础。

抗Pgp基因工程抗体ScFv的构建、表达及其活性测定

目的 :构建表达抗PgpScFv,进行体外活性的测定。方法 :利用RT PCR方法 ,克隆抗Pgp杂交瘤细胞PHMAO2的重链可变区基因 (VH) ,轻链可变区基因 (VL) ,拼接为单链抗体 (ScFv) ,再克隆到具有强启动子的PET2 8a(+)载体上进行表达 ,并进行了表达产物体外活性的测定。结果 :构建了表达质粒PET2 8a(+) ScFvPGP。表达产物可与表达Pgp抗原的K5 6 2 A0 2细胞特异性结合 ,并不抑制Pgp外排泵的功能。结论 :构建表达的抗PgpScFv只有针对Pgp抗原的识别功能 ,并无抑制作用 ,因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能 ,无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂 ,均具有广泛的应用前景。

抗黄曲霉毒素B1单链抗体(scFv)库的建立和筛选

从抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体细胞系中扩增到重链可变区(VH)和轻链可变区(VL),经PCR将VH、Linker和VL连接成单链抗体(scFv),并克隆到载体pCANTAB-5E,经电转化大肠杆菌TG1,构建了库容量为1×108的单链抗体库。通过辅助噬菌体M13KO7感染后,使单链抗体展示在噬菌体衣壳蛋白pIII的N端,得到客容量为1×108的噬菌体展示的抗体库。将抗体库用于"淘洗-富集-扩增"4轮以后,得到针对AFB1特异性的噬菌体抗体。进一步以噬菌体感染大肠杆菌HB2151,在细菌细胞周质中可溶性大量表达,最终经竞争ELISA分析表明获得了3株可以稳定分泌抗黄曲霉毒素B1 scFv菌株,分别命名为3C3、3B3和4A2。

人源抗HBsAgscFv与重组复合干扰素融合蛋白的高效表达及活性鉴定

目的 :制备人源抗乙型肝炎病毒表面抗原 (HBsAg)单链抗体 (scFv)与重组复合干扰素 (consensusinterferon ,cIFN)的融合蛋白 ,并鉴定其活性。方法 :把人源抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白的表达载体pRA cIFNscFv转化到大肠杆菌菌株BL2 1之后大量表达抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白。SDS PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白 ,经纯化并变性复性包涵体蛋白后用ELISA、流式细胞仪、MTS非放射性活细胞比色定量法及HBsAg血凝抑制试验等进行融合蛋白的抗HBsAg抗体活性和干扰素活性测定。结果 :SDS PAGE和Westernblotting结果显示 ,抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白在BL2 1大肠杆菌中大量表达 ,表达量超过 10mg L培养基 ;ELISA和流式细胞仪结果显示 ,所表达的目的蛋白具有抗HBsAg和IFNα的免疫活性 ,且特异性良好 ;MTS和HBsAg血凝抑制试验结果显示 ,融合蛋白具有明显的PLC PRF 5细胞增殖抑制活性和HBsAg分泌抑制活性 ,表明所获得的抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白具有抗HBV病毒活性和HBV感染细胞增殖抑制活性。结论 :用基因工程方法成功制备了人源抗HBsAgscFv cIFN融合蛋白 ,此融合蛋白具有抗HBsAg抗体活性和IFNα活性 。

新型小分子抗体scFv多聚体与肿瘤靶向

新型小分子抗体—单链可变区片段 (sc Fv)是由一弹性接头 (linker)将 VH和 VL 连接而成 ,是抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位。以分子量小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注。依据接头的长度和 V区的方向 ,sc Fv分子可聚集形成二聚体 (Diabody)、三聚体 (tri-abody)和四聚体 (tetrabody)。我们就 sc Fv分子接头长度和 V区方向、sc Fv多聚体的表达和稳定性、sc Fv多聚体在体内的药代动力学、sc Fv多聚体的弹性和亲和力、鼠源性 sc Fv多聚体的体外应用、多特异性 Sc

抗HBc-ScFv基因复制缺陷型腺病毒载体的构建及其体外表达

目的:构建表达抗乙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体(抗HBc ScFv)的复制缺陷型腺病毒载体,并检测其能否在真核细胞中有效表达目的基因. 方法:采用DNA重组技术将特异性人源性抗卜HBc单链抗体基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,与5 型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染B15183细菌,经细菌内同源重组产生携带抗HBc ScFv基因的重组腺病毒载体pAd—ScFV,经脂质体法转染293细胞,包装产生携带抗HBc scFv基因的重组腺病毒Ad—scFv,体外转染HepG2细胞,PCR和ELISA法检测目的基因及其表达. 结果:构建了表达抗HBc ScFv基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1015 PFU/L,并能在真核细胞中有效表达目的基因. 结论:成功构建表达抗HBc ScFv的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步开展抗HBc ScFv在抗HBV基因治疗中的作用研究提供实验基础.

全人源scFv-Fc真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建全人源抗IL-33 scFv-Fc重组载体,转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO),表达并鉴定融合抗体蛋白。方法:RT-PCR扩增人IgG1 Fc段并插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1/Fc重组载体;将合成的信号肽(SP)序列插入重组质粒pcDNA3.1/Fc,构建重组pcDNA3.1/SP-Fc通用载体;最后将本实验室前期筛选的抗IL-33 scFv插入重组质粒pcDNA3.1/SP-Fc中,构建重组pcDNA3.1/SP-scFv-Fc载体,测序正确后转染CHO细胞。RT-PCR、Western blot检测目的基因的转录及表达。结果:重组质粒测序结果表明成功地构建了pcDNA3.1/SP-scFv-Fc重组真核表达载体,插入的SP-scFv-Fc目的基因大小为1 560 bp左右。转染CHO细胞后,RT-PCR结果显示目的基因在CHO细胞中成功转录,Western blot显示表达的蛋白可以和羊抗人IgG1 Fc抗血清发生特异性免疫反应。结论:成功构建了pcDNA3.1/SP-scFv-Fc重组真核表达载体,以便于后续在CHO细胞中表达。

抗人P185^(erbB2) scFv-Fc-IL-2调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞

目的将抗人P185erbB2scFv-Fc-IL-2融合蛋白(HFI)作用于人卵巢癌细胞株SKOV3细胞和人外周血单个核细胞(PBMC),通过体外实验阐明HFI调变肿瘤细胞表面分子和激活免疫效应细胞的抗肿瘤机制,为HFI临床应用提供实验依据。方法MTT法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术观察细胞表面分子的表达水平;生物活性法检测细胞膜相关TNF杀伤活性;RT-PCR检测细胞穿孔素表达水平。结果HFI处理后,未观察到对SKOV3细胞增殖活性的直接抑制作用;SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达率分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%(P<0.01);人PBMC的增殖活性增强,CD3+CD8+T细胞和CD3-CD16+CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%(P<0.01);CD25、LFA-1、FasL表达水平分别由3·99%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06%16.19%(P<0.01);穿孔素基因、膜相关TNF均表达增强,LAK样、NK样杀伤活性在各效靶比时均明显增高(P<0.01)。结论HFI提高SKOV3细胞杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达水平,并且对人PBMC有明显的增殖活化作用,通过激活LFA-1/ICAM-1、Fas/FasL途径提高杀伤介质穿孔素和膜相关TNF的释放,增强LAK样、NK样杀伤活性。

基于流式细胞术的scFv抗体库筛选技术的建立

目的利用NlpA前导肽诱导抗体锚定细菌内膜建立筛选scFv抗体库的展示技术,为高亲和力抗体的筛选奠定基础。方法从pNAD质粒中克隆出NlpA前导肽基因序列,酶切后将该序列克隆进pHEN1表达载体中。以PEAI质粒为模板,利用PCR的方法克隆得到抗-hIL-1β抗体的重链可变区和轻链可变区基因,然后利用重叠PCR的方法构建得到抗-hIL-1βscFv抗体。将scFv抗体插入到NlpA leader-pHEN1表达载体中构建成展示scFv的重组质粒pBSD-scFv。将pBSD-scFv转入到E.coli DH5α中诱导表达,原生质球制备后,采用梯度浓度的抗原进行孵育,最后经流式细胞术(FCM)检测抗体展示情况并且分选阳性群体,利用质粒提取的方法来替代PCR方法拯救阳性基因,转化E.coli DH5α,利用FCM再次检测该群体展示的抗体与抗原结合情况。结果所展示的抗-hIL-1βscFv抗体依次与抗原和FITC标记的抗原特异性抗体孵育后,用FCM实时检测,结果显示出很强的荧光信号并且表现出抗原浓度依赖性。拯救出的pBSD-scFv-原生质球的FCM检测结果与首次展示的FCM结果一致,该系统能够稳定的展示抗体。结论经过该细菌展示系统展示的scFv抗体能够有效的折叠,与相应的抗原具有很好的特异结合能力。

抗甲硝唑人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选甲硝唑人源单链可变区（scFv）抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,以甲硝唑作为抗原,固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选过程,随机挑选抗甲硝唑的90个克隆,利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与甲硝唑结合活性较强的scFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行酶切鉴定分析.结果 经过筛选90个克隆中有16株克隆ELISA的490 nm波长吸光度（A490nm）值较高,将这些噬菌体上清与牛血清清蛋白（BSA）进行交叉反应,确定有4株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌感受态细胞XL1-Blue.结论 提取质粒酶切片段与目的相符,为下一步研究其特异性亲和力的研究创造了条件.

不同培养条件对抗α毒素ScFv基因表达的影响

将ScFv基因片段与pHOG21载体连接后,转化至受体菌XL1-Blue中,得到重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）。随后研究了培养基中无机盐成分、温度、诱导时间、IPTG和蔗糖浓度对ScFv基因表达的影响。经SDS-PAGE分析表明,重组菌株XL1-Blue（pHOG2E3）在LB培养基中加入0.5mmol/L IPTG和 0.4 mol/L蔗糖,37℃诱导6h,其目的蛋白的表达量较高,表达的ScFv蛋白主要以包含体的形式存在,分子量为31,000D,在重组菌株的培养上清和菌体裂解上清液中,通过ELISA法也检测到了ScFv的存在,且具有中和α毒素的活性。

融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP在昆虫细胞中的表达及其靶向结合乳腺癌细胞的功能分析

目的:利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达获得携带绿色荧光蛋白(GFP)的抗人表皮生长因子受体2(HER2)的单链抗体可变区片段(ScFv),分析其靶向结合乳腺癌细胞表面受体HER2的功能。方法:构建融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,重组获得真核表达载体重组子pFAST Bac-to-Bac HT A/anti-HER2-ScFv-GFP,转化DH10Bac,收集重组病毒bacmid,分别转染、感染粉纹夜蛾细胞Tn-5B1-4,SDS-PAGE及Westernblotting分析融合蛋白表达产物。Ni2+-NTA亲和层析法纯化anti-HER2-ScFv-GFP融合蛋白后分别滴入乳腺癌细胞HER2阳性的SKBR3和HER2阴性的MCF7,对比携带绿色荧光的抗HER2单链抗体靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体情况。结果:获得长度约1 539 bp的融合基因anti-HER2-ScFv-GFP,感染重组病毒的Tn-5B1-4细胞膜附近有明显绿色荧光,SDS-PAGE、Western blotting法检测到60 kD的特异性条带。结合实验显示HER2阳性的SKBR3细胞表面有明显绿色荧光,而HER2阴性的MCF7细胞表面荧光易被洗脱。结论:在Tn-5B1-4中成功表达携带绿色荧光的融合蛋白anti-HER2-ScFv-GFP,该携带绿色荧光的抗HER2单链抗体具有靶向结合乳腺癌细胞表面HER2受体的效能。

重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的构建、表达及其活性鉴定

目的:构建重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达载体,转染SGC7901胃癌细胞后观察其促凋亡作用.方法:采用重组PCR法,将抗HER2的单链抗体(e23sFv)通过白喉毒素的Furin识别位点的编码序列(FDT)与人重构型caspase-6(RC6)基因重组,构建融合蛋白表达基因e23sFv-FDT-RC6.将所获得的重组基因克隆入真核表达载体pCMV,以脂质体法瞬时转染HER2阳性的SGC7901细胞和HER2阴性的HeLa细胞.MTT法检测目的基因转染后细胞的增殖情况.间接免疫荧光染色观察目的基因的表达对SGC7901细胞的促凋亡作用.结果:把e23sFv-RC6,e23sFv-FDT-RC6基因克隆入真核表达载体pCMV,酶切鉴定和基因测序证明目的基因序列正确.转染SGC7901和HeLa细胞后,Western Blot检测到目的蛋白的表达.MTT实验观察到转染pCMV-e23sFv-FDT-RC6的SGC7901细胞的增殖被明显抑制,间接免疫荧光染色可以观察到表达e23sFv-FDT-RC6融合蛋白的SGC7901细胞形态发生改变,部分细胞呈现典型凋亡特征.结论:重组抗HER2 ScFv/FDT/caspase-6基因的表达可促进HER2阳性SGC7901胃癌细胞的凋亡.

抗CD3 ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体的高密度发酵与纯化

在发酵罐上采用高密度发酵的方法对抗CD3ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体工程菌进行了培养,其发酵结果是每升发酵液的湿菌菌重150g,OD550值达121;以免疫亲和层析的方法纯化抗CD3ScFv/抗PgPScFv双功能抗体,经计算抗体产量可达146.6mg/L;间接免疫荧光测定结果经流式细胞仪分析计算表明,抗CD3ScFv/抗PgP ScFv双功能抗体能与Jurkat细胞及K562/A02细胞特异性结合。