Selection of phages and conditions for the safe phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections

The emergence of multidrug-resistant bacterial pathogens forced us to consider the phage therapy as one of the possible alternative approaches to treatment. The purpose of this paper is to consider the conditions for the safe, long-term use of phage therapy against various infections caused by Pseudomonas aeruginosa. We describe the selection of the most suitable phages, their most effective combinations and some approaches for the rapid recognition of phages unsuitable for use in therapy. The benefi ts and disadvantages of the various different approaches to the preparation of phage mixtures are considered, together with the specifi c conditions that are required for the safe application of phage therapy in general hospitals and the possibilities for the development of personalized phage therapy.

Common Preconditions for Safe Phage Therapy of <i>Pseudomonas aeruginosa</i>Infections

One of the approaches to the treatment of infections caused by multiply-(MDR) or extra drug- resistant (XDR) pathogenic strains may be application of bacterial viruses (bacteriophages)— phage therapy. Results of a long, but quite limited use of phage therapy in several Eastern European countries, as well as experiments on animal models in Western countries support the possibility to use phage therapy. However, given the role of phages in the evolution of bacterial pathogens, it is necessary to discuss and evaluate negative consequences of mass introduction of phage therapy, as the measures necessary for its safe use. We discuss some actions in case of transiting to world-wide use of phage therapy with purpose to prolong the active life of phage therapy and to diminish possible complications.

一株铜绿假单胞菌噬菌体全基因组分析及与抗生素体外联合应用效果

旨在为解决耐药铜绿假单胞菌感染提供不同方法。以鸡源铜绿假单胞菌为宿主菌,从医院污水中分离纯化出铜绿假单胞菌噬菌体,并进行生物学特性研究与基因组学分析,同时采用棋盘法与三种抗生素联合应用测试其效果。结果显示:从医院污水中分离到一株铜绿假单胞菌噬菌体PaVOB,TEM显示病毒颗粒具有一个平均直径为73.02 nm的二十面体头部和一个平均长度为155.57 nm的长尾部,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科,具有双链DNA基因组,宿主谱较窄,耐低温(-20℃)并且在37℃达到最适温度,有良好的酸碱耐受性,在pH为3~12时保持活性,最佳MOI为0.001,一步生长曲线显示潜伏期为10 min,爆发量为50 PFU·cell^(-1),吸附性试验表明PaVOB在10 min的吸附率为99.1%。PaVOB基因组全长为72179 bp,(G+C)%含量为54.81%,与VB PaeP FBPa1亲缘关系小于0.1,ORF预测显示,PaVOB包括74个ORF,软件预测均未发现毒力基因、耐药基因和tRNA存在。此外,抗生素联合应用结果显示,PaVOB与头孢曲松联合应用有协同作用,在效价为107 PFU·mL^(-1)时与恩诺沙星产生协同作用,与庆大霉素产生无关作用。铜绿假单胞菌噬菌体PaVOB对环境适应能力强,且基因组信息清晰,能够选择性地与不同抗生素联合应用发挥协同作用,具有治疗临床耐药铜绿假单胞菌感染的可能性。

铜绿假单胞菌耐药机制及治疗技术研究新进展

铜绿假单胞菌(PA)是最常见的条件致病菌之一,严重危害人类的健康。随着广谱抗生素的大量应用,导致多重耐药菌株的出现,从而使治疗更加棘手。研究发现,免疫力低下的人群容易诱发PA的感染,随着临床耐药PA检出率的增加及抗生素的治疗效果减弱,部分患者的生活质量及预后受到很大影响。PA的感染难以控制的原因是复杂的耐药机制,其中包括生物膜的形成、孔蛋白的介导作用、外排泵以及抗菌灭活酶的产生等。由于抗生素的应用不能有效控制PA的感染,所以针对耐药机制在药物治疗方面进行研究,其中包括外排泵抑制剂、抗生素佐剂、相关灭活酶抑制剂、外膜透化剂。此外,噬菌体疗法、中药疗法、一氧化氮疗法及纳米技术等特殊治疗也展现出良好的治疗效果,疫苗领域及增强自身免疫力也是未来预防PA感染的重要研究方向。因此,研究PA的耐药机制及治疗技术对PA感染的预防和治疗具有深远的意义。

铜绿假单胞菌噬菌体的分离鉴定和全基因组序列分析

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种人兽共患的机会性病原体,给养殖业造成巨大经济损失,噬菌体在防治铜绿假单胞菌感染性疾病方面具有应用前景。本试验以实验室保存的铜绿假单胞菌临床分离株PA31为宿主菌,通过点滴法和双层琼脂平板法从水样中分离纯化噬菌体;以PA31和实验室保存的大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门菌(Salmonella)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)临床分离株作为宿主菌,通过点滴法分析噬菌体的裂解谱;利用负染法在透射电镜下观察噬菌体形态,双层平板法测定噬菌体的最佳感染复数和一步生长曲线,测定pH和温度对噬菌体稳定性的影响;采用Illumina NovaSeq平台测定噬菌体的全基因组序列,利用A5-MiSeq、SPAdes、GeneMarkS、Rfam、Diamond、BLASTp和MEGA 11.0生物信息软件进行拼接、注释和比较基因组学分析。结果显示,分离出1株铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeM_Ty,其仅能裂解宿主菌PA31和Escherichia coli-39、Enterococcus faecalis-8a,具有一定的宿主特异性;纯化vB_PaeM_Ty效价为1×10^(12)PFU/mL,该噬菌体为肌尾病毒科,最佳感染复数为1.0。一步生长曲线显示,vB_PaeM_Ty感染宿主菌PA31的潜伏期为20 min,裂解期为40 min,裂解量约为142 PFU/mL;在pH 3~12、温度45~70℃范围内噬菌体活性稳定;噬菌体vB_PaeM_Ty的核酸类型为双链DNA(dsDNA),基因组长50051 bp,GC含量为47.23%,编码74个开放阅读框(ORFs);其全基因组比对结果显示,vB_PaeM_Ty与假单胞菌噬菌体K4的同源性最高,基因组序列已经提交GenBank,登录号为OQ555403。结果表明,本试验分离鉴定了1株新的噬菌体vB_PaeM_Ty,其为烈性噬菌体,耐高温环境,且耐酸碱,包含多种功能相关蛋白,提示该噬菌体具有治疗铜绿假单胞菌耐药菌的潜力。

微观水分和养分条件对铜绿假单胞菌噬菌体裂解宿主过程的影响

为研究不同水分和养分条件下细菌和噬菌体的生长和运移规律、细菌和噬菌体种群互作过程以及其对群落结构的影响和调控机制,通过控制微生物运动平板表面相对水膜厚度研究铜绿假单胞菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)和铜绿假单胞菌噬菌体PA-27-1(Pseudomonas aeruginosa phage PA-27-1)的互作过程。结果表明,细菌和噬菌体的互作主要受噬菌体裂解细菌、细菌的运动和噬菌体扩散三个因素控制。水分通过调控多孔表面水膜的厚度和连通性来改变细菌在微孔尺度的运动,进而影响微生物在粗糙界面的增殖和生物膜的形成过程以及菌落的形态特征,同时通过影响噬菌体的扩散传播来调节细菌和噬菌体之间的互作机制。细菌与噬菌体自身运动性及个体大小上的不同也导致二者在微观孔隙中增殖(扩散)特征的差异。相对低水膜网络促进了细菌和噬菌体之间的空间隔离,降低了噬菌体有效侵染细菌的概率,从而有利于细菌的增殖。丰富的养分条件有利于细菌生物量的快速繁殖,进而促进噬菌体的增殖。本研究揭示了环境生物膜等微生境中噬菌体和宿主细菌的生长和运移规律,有助于为深入理解土壤噬菌体的时空分布特征与演变规律以及其与土壤细菌之间的互作模式提供理论基础和数据支撑。

铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeM-YQ78生物学与基因组特征及其裂解酶的改造

目的从医院废水中筛选并鉴定铜绿假单胞菌烈性噬菌体,表达和优化其裂解酶。方法以收集的临床铜绿假单胞菌为宿主菌,分离纯化烈性噬菌体,并深入鉴定其中一株裂解能力强的广谱噬菌体的生物学特性,分析其基因组特征和进化特征,表达和改造噬菌体裂解酶,测定噬菌体与抗生素的协同杀菌作用以及不同穿膜辅助剂对于裂解酶杀菌活性的影响。结果噬菌体vB_PaeM-YQ78是一株新的铜绿假单胞菌肌尾噬菌体,潜伏期为10 min,裂解量为43;最佳感染复数为0.00001;在40℃以下和pH 5~10范围内保持稳定。噬菌体与环丙沙星具有较强的协同作用,在24 h内无突变菌株生长。不使用穿膜辅助剂时,裂解酶LysYQ78在1 h内能将多重耐药铜绿假单胞菌降低1个log单位,在添加5 mmol/L EDTA时,LysYQ78可以将细菌浓度降低6个log单位。将ApoE蛋白N端穿膜肽融合到LysYQ78的N端后,Lys1410-YQ78的杀菌活性得到显著提高,可以在1 h内将宿主菌浓度降低2个log单位。结论本实验分离鉴定了一株新的铜绿假单胞菌烈性噬菌体,其具有较宽的宿主谱,与环丙沙星具有较强的协同作用。并且,其裂解酶本身就可以穿透细胞外膜,展现杀菌活性,而与穿膜肽融合后,杀菌活性得到显著增强。本实验的裂解酶改造为进一步优化提供了思路,为将来铜绿假单胞菌的噬菌体治疗提供新的选项。

铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaeS_HP1的分离鉴定和基因组学初步研究

目的研究一株从医院未经处理的污水中筛选出的铜绿假单胞菌噬菌体的生物学特性和基因组成,为临床治疗铜绿假单胞菌感染提供新选择。方法利用16S rDNA技术对宿主菌进行菌种鉴定,并以其为模板采用双层平板法筛选出铜绿假单胞菌噬菌体,并测定其噬菌斑、形态特征、最佳感染复数等生物学特性;提取噬菌体DNA样品,进行全基因组检测,使用在线网站对功能基因进行预测,Mauve软件对噬菌体的共线性进行分析。结果菌种鉴定结果显示宿主菌Pae-01为铜绿假单胞菌,成功分离得到一株铜绿假单胞菌噬菌体,命名为vB_PaeS_HP1,其噬菌斑直径为7 mm,边缘整齐,清晰透明,无晕环;透射电镜观察属短尾噬菌体,多面体头部直径约为75 nm,尾部长度约为53 nm;最佳感染复数为1;潜伏期为30 min,裂解期为50 min;对不同的温度和pH具有较强的适应能力;NCBI数据库比对后确定其为一株全新的噬菌体;预测出43个功能基因,包括与噬菌体的结构相关基因、DNA复制和调控相关的基因、DNA包装蛋白相关的基因和其他功能基因;共线性分析显示其共线性良好,无基因突变情况。结论vB_PaeS_HP1是一株短尾噬菌体,生物学特性明确,功能基因完整,可为噬菌体疗法治疗铜绿假单胞菌感染提供新方案。

泛耐药铜绿假单胞菌菌株广谱噬菌体裂解酶的获取及抗菌活性观察

目的获取泛耐药铜绿假单胞菌(PA)广谱噬菌体裂解酶,并观察其抗菌活性。方法(1)取237株PA菌株,采用药敏实验筛选得到84株泛耐药PA菌株。采用噬菌斑测定法,将污水与10株泛耐药PA菌株混合培养,筛选得到9株泛耐药PA菌株噬菌体,并用84株泛耐药PA菌株,筛选出90%以上泛耐药PA菌株的广谱噬菌体。(2)采用Proteinase K裂解法及测序获取泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶基因、运用生物信息学工具(ORF finder和BLAST)进行序列确认,获得泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶的基因序列(目标序列),将目标序列克隆、转化、诱导纯化后得到泛耐药PA广谱噬菌体裂解酶。取泛耐药PA菌株,将其均匀涂抹至2个培养基,分别滴加5、10μL泛耐药PA菌株广谱噬菌体裂解酶,培养24 h时观察培养基噬菌斑生长情况。结果得到泛耐药PA菌株广谱噬菌体EPA19及EPA19裂解酶lysEPA19。5、10μL的lysEPA19与泛耐药PA菌株混合培养后,培养基上均可见噬菌斑(5μL LysEPA19噬菌斑为11~13mm,10μL LysEPA19噬菌斑为23~27 mm)。结论成功筛选得到泛耐药PA广谱噬菌体裂解酶lysEPA19,可有效抑制泛耐药PA菌株生长。

一株宽宿主谱多重耐药铜绿假单胞菌噬菌体的生物学特性与基因组特征分析

为探究针对多重耐药铜绿假单胞菌(P.aeruginosa,PA)裂解性噬菌体生物学特性及其基因组结构特征,本研究以一株人源多重耐药PA 3099-2aT株为宿主菌,从养殖场污水中分离纯化到一株噬菌体,命名为p PA-3099-2aT.2。噬菌体经磷钨酸染色后采用透射电镜观察形态,经双层平板法测定其对温度和酸碱的稳定性、绘制一步生长曲线,通过双层平板法测定该噬菌体对各试验菌株的裂解情况确定其宿主谱,通过测定不同感染复数(MOI)细菌和噬菌体混合液的OD_(595nm)分析该噬菌体体外抑菌效果,通过不同浓度的PA 3099-2a T对大蜡螟幼虫致病性及攻毒保护率试验检测噬菌体体内抑菌效果。结果显示,噬菌体p PA-3099-2aT.2头部直径约为76.69 nm,有尾鞘,尾长123.89 nm,形态学分类为肌尾噬菌体;在-20℃~60℃和p H值为4~10的环境中稳定性良好,最适p H值为6,最适温度为37℃,潜伏期小于10 min,裂解期持续至100 min,裂解量约为178 pfu/cell;能裂解ST198型、ST274型、ST3683型、ST3875型、ST3216型等8株不同来源的PA;体外抑菌效果良好,其中MOI 0.01抑菌效果最好,能在0~15 h内有效抑制细菌生长;在体内也具有良好的抑菌效果,该噬菌体对大蜡螟幼虫的保护率与其MOI呈正相关,24 h内该噬菌体的MOI为100时对大蜡螟幼虫的保护率为100%,MOI 1时对大蜡螟幼虫的保护率为60%,MOI 0.01时对其的保护率为40%。采用高通量测序技术对p PA-3099-2aT.2进行全基因组测序,并于GenBank数据库下载32条噬菌体N-乙酰胞壁酰胺酶氨基酸序列,分析其遗传演化规律,采用DNAMAN v6对p PA3099-2aT.2、噬菌体JG004 lysozyme(Pae87)和v B_PaeM_C2-10_Ab1的N-乙酰胞壁酰胺酶的氨基酸序列进行比对分析。全基因组测序结果显示,p PA-3099-2a T.2基因组为ds DNA,长度为93031 bp,GC含量49.4%,含有穿孔素、N-乙酰胞壁酰胺酶、细胞壁水解酶等裂解相关蛋白;N-乙酰胞壁酰胺酶进化分析结果显示,该蛋白在噬菌体帕克普纳属和宿主菌铜绿假单胞菌种具有较高的保守性,与噬菌体JG004 lysozyme(Pae87)该蛋白氨基酸序列同源性为98.39%,但存在3个氨基酸突变。上述结果表明,噬菌体p A-3099-2a T.2具有生物学稳定性、潜伏期较短、裂解能力强、识别多种ST型宿主菌和抑菌效果良好等特性,能够显著提高感染多重耐药PA大蜡螟幼虫的存活率,为噬菌体治疗多重耐药PA感染提供参考依据。

铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaS_IME307的生物学特性研究及全基因组分析

目的以实验室保存菌株Pa175为宿主菌,从医院污水中分离得到1株铜绿假单胞菌噬菌体,研究其生物学特性及全基因组学特征。方法利用双层平板法、噬斑法分离并鉴定噬菌体;PEG8000浓缩NaCl沉淀法纯化噬菌体;蔗糖梯度离心进一步纯化噬菌体,经磷钨酸负染染色后,使用透射电子显微镜观察其形态;蛋白酶K/SDS法提取噬菌体DNA,对提取的核酸进行全基因组测序和生物信息学分析。结果得到1株裂解性铜绿假单胞菌噬菌体vB_PaS_IME307,该噬菌体可以形成透明且有晕环的噬菌斑,全基因组大小为51545 bp。透射电镜结果显示vB_PaS_IME307的头部呈正二十面体形状,直径(66±2)nm,尾长(116±2)nm;进化树分析发现该噬菌体为Mccleskeyvirinae病毒属,长尾噬菌体科(Siphoviridae)。生物学特性研究发现:vB_PaS_IME307在pH=4.0~11.0、60℃以下能够保持较高活性,感染周期约为60 min,其中包括10 min潜伏期和50 min暴发期,其暴发量为150 PFU/cell。结论噬菌体vB_PaS_IME307具有宿主特异性,对温度和pH具有较好的耐受能力,具有防治铜绿假单胞菌细菌感染的潜力。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2生物学特性的研究

目的 确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的形态与大小、裂菌特性、最佳感染复数、一步生长特性等基本的生物学特性。方法 电镜观察纯化噬菌体颗粒 ;制备PaP2噬斑 ,观察其特点 ;提取噬菌体感染的细菌基因组 ,用SmaⅠ酶切 ,通过脉冲场电泳观察酶切产物的带型特点 ;测定不同感染复数 ,培养 3 5h后细菌 噬菌体液中的噬菌体滴度 ;加入宿主菌及噬菌体使MOI =10 ,进行一步生长实验 ,在 0时刻和每隔 15min测定噬菌体滴度。结果 噬菌体PaP2头部直径约为 5 2nm ,无囊膜 ,有一短尾 ;噬斑雾状半透明 ,直径约 1～ 2mm ;被噬菌体感染的宿主菌基因组的SmaⅠ酶切产物带型 ,比未感染宿主菌的多出了 1条大于噬菌体基因组的片段 ;当MOI =10时宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高 ;绘制出了一步生长曲线。结论 PaP2属短尾噬菌体科 ,是溶原性噬菌体 ;最佳感染复数是 10 ;感染宿主菌的潜伏期是 75min ,裂解期是 90min ,平均裂解量是 3

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1生物学特性的研究

目的 确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP1的形态大小、核酸类型、裂菌特性、最佳感染复数和一步生长曲线等基本生物学特性。方法 对CsCl梯度离心纯化后的噬菌体PaP1颗粒进行电镜观察;提取PaP1基因组核酸,通过限制性内切酶图谱分析其核酸类型;制备PaP1的单个噬斑,观察噬斑特点;按照感染复数(MOI)分别为0 0 0 0 1、0 0 0 1、0 0 1、0 1、1和10加入噬菌体纯培养液和宿主菌,3 7℃160r/min培养3 5h后测定噬菌体滴度;加入噬菌体及宿主菌使MOI =10 ,3 7℃温育15min后进行一步生长实验,于0时刻和每隔10min取样5 0 μl测定上清中噬菌体滴度。结果 PaP1噬菌体头部呈多面体立体对称,直径约70nm ,无囊膜,有一个约60nm长的尾;PaP1噬斑直径约2mm ,圆形透明;当MOI为0 0 1时PaP1感染其宿主菌产生的子代噬菌体滴度最高;根据一步生长实验结果绘制出了一步生长曲线。结论 PaP1属于肌尾科裂菌性噬菌体,其基因组为双链DNA分子;最佳感染复数为0 0 1,感染宿主菌的潜伏期是2 0min ,爆发期是40min ,平均爆发量约为65。

铜绿假单胞菌噬菌体D204的生物学特性和基因组学研究

目的 针对铜绿假单胞菌多耐药菌的不断出现,寻找高效、广谱的铜绿假单胞菌噬菌体。方法 以医院临床上分离到的铜绿假单胞菌为宿主菌,从环境污水中分离纯化铜绿假单胞菌噬菌体,磷钨酸负染法电镜观察噬菌体的形态和大小,测定其效价、宿主谱、酸碱稳定性和热稳定性,绘制一步生长曲线、吸附曲线和感染曲线,并抽取噬菌体DNA进行测序及分析。结果 分离到1株铜绿假单胞菌噬菌体,并命名为D204。D204在pH值为4~11及温度37~50℃环境下具有较高活性,电子显微镜观察发现此噬菌体由直径约为50 nm的多面体头部和约15 nm的短尾组成。一步生长曲线表明噬菌体在裂解宿主菌时,潜伏期为30 min,爆发期为40 min,裂解量约为160 pfu/cell。吸附曲线显示50 min时,其吸附率达95%以上。感染曲线显示当感染复数为0.1和1时,对宿主菌生长有抑制作用,在180 min后可完全抑制宿主菌生长。其基因组为环状双链DNA,全长为50 609 bp,GC含量为44.8%。预测共有75个开放阅读框。结论 分离、筛选出的铜绿假单胞菌噬菌体D204具有较强的裂解宿主的能力,其对酸碱和热比较稳定,裂解宿主时潜伏期较短,可以作为铜绿假单胞菌的储备噬菌体。

医院内宽嗜性铜绿假单胞菌噬菌体的分离筛选

目的从未经处理的医院下水道污水中分离筛选宽嗜性铜绿假单胞菌噬菌体,检测其对临床常规检出的铜绿假单胞菌的嗜性覆盖范围,探究其潜在的临床治疗价值。方法用双层琼脂噬菌斑形成法对铜绿假单胞菌噬菌体进行分离鉴定和感染谱的筛选,并用重复片段PCR基因指纹方法 (repetitive element PCR genomic fingerprinting,Rep-PCR)进行感染谱内宿主菌同源性分析,确认噬菌体的感染谱;用双层琼脂噬菌斑形成法检测筛出的宽嗜性铜绿假单胞菌噬菌体对临床常规检出的铜绿假单胞菌的嗜性覆盖范围。结果从16家医院未经处理的下水道污水中分离到14株铜绿假单胞菌噬菌体,确定其中4株感染谱较广,4株宽嗜性噬菌体的交叉组合对临床日常分离30株铜绿假单胞菌吞噬覆盖率为96.7%(29/30);30株铜绿假单胞菌中对亚胺培南耐药菌株12株,对药敏实验全部药物敏感菌株5株,其他耐药菌株13株,4株宽嗜性噬菌体交叉组合对耐亚胺培南菌株吞噬覆盖率为91.7%(11/12),对药敏实验敏感菌株的吞噬覆盖率为100%(5/5),对其他耐药菌株交叉吞噬覆盖率为100%(13/13)。结论从分离鉴定的14株铜绿假单胞菌噬菌体中筛选出4株宽嗜性噬菌体,其交叉组合能够吞噬型解临床日常筛出30株铜绿假单胞菌中的29株,对耐亚胺培南和其他临床常规药物的耐药菌株的交叉吞噬覆盖率在90%以上,交叉组合吞噬覆盖率高,为其进一步在临床抗菌治疗方面的应用提供基础和依据。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组电转化宿主菌的条件初探

目的：研究将铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组DNA电转入其宿主菌并获得噬斑的基本条件。方法：以铜绿假单胞菌PA3作受体菌，将噬菌体PaP3基因组DNA通过电转化导入受体菌中，研究细胞生长状态、感受态细胞的制备方式、电场强度、DNA浓度和细胞密度等条件对转化效率的影响。结果：在含50μg／ml红霉素的LB培养液中培养宿主菌14—16h，以100mmol／L蔗糖溶液为介质，在25℃条件下制备感受态并使其浓度达到10μ／ml，电转参数为12kV／cm，300Ω，25μF，在此组条件下能获得较高的转化效率，最高可达2．1×10^3pfu／μg的DNA。结论：确定了一组电转条件，成功地将铜绿假单胞菌噬菌体完整基因组导入PA3中，并形成噬斑，为铜绿假单胞菌噬菌体的深入研究奠定了基础。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP2的结构蛋白及其编码基因的研究

目的 :确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP2结构蛋白的构成及其编码基因。 方法 :CsCl梯度离心纯化噬菌体PaP2颗粒 ,SDS PAGE电泳 ,确定结构蛋白条带及其相对分子质量 ;然后电转印于PVDF膜上 ,用Edman降解法进行N端测序。根据所测的N端氨基酸残基序列在PaP2预测基因编码的蛋白质中检索 ,从而逆推其编码基因。 结果 :SDS PAGE显示PaP2含有 10条带 ,其中 1、3、4、5、8、9等 6条带的含量足以回收进行N端测序 ,测得N端氨基酸残基分别依次为 :Met Ile Glu Leu Gly、Ala Ile Ser Pro、Ala Arg Phe Ile Asp、Ser Val Tyr Ala Gly、Ala Ile Ser Arg Asn 和Ser Phe Ser Leu Gly。据此推论出它们的编码基因分别是ORF18340 2 3889、ORF4 4 19 6 4 19、ORF16 5 89 1832 2、ORF82 74 95 30、OrF15 70 8 16 6 2 5、ORF75 6 3 830 9。 结论 :噬菌体PaP2含有 10个结构蛋白 ,其中 6个主要结构蛋白的编码基因分别是orf 2 4、orf 8、orf 2 3、orf 12、orf 2 2、orf 11。

快速从医院废水中大规模分离铜绿假单胞杆菌噬菌体

目的:从医院废水中快速分离多株不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体,研究其生物学特性,为建立铜绿假单胞杆菌噬菌体库做准备。方法:利用噬菌斑法从未经处理的医院污水中分离和鉴定铜绿假单胞杆菌噬菌体,根据感染谱的不同确定它们为不同的铜绿假单胞杆菌噬菌体;重点研究其中一株宿主谱较广的噬菌体的生物学特性,采用负染法电镜观察噬菌体的形态和大小,提取该噬菌体的基因组并进行酶切电泳分析,测定噬菌体感染复数并观察其一步生长曲线。结果:通过噬菌斑法分离出90株铜绿假单胞杆菌噬菌体。电镜观察显示,噬菌体Pa27P1头部呈立体对称,有一长尾;酶切结果显示,噬菌体Pa27P1的基因组为双链DNA;生长曲线表明噬菌体Pa27P1感染宿主菌的潜伏期为25 min,爆发时间为25 min,裂解量为514。结论:90株铜绿假单胞杆菌噬菌体中有5株具有较广的噬菌谱,其组合能裂解所有18株铜绿假单胞杆菌,为深入研究铜绿假单胞杆菌噬菌体的生物学特性及其功能提供了依据。

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3整合位点的鉴定

目的:确定铜绿假单胞菌噬菌体PaP3在宿主菌基因组中的整合位点。方法:利用在噬菌体PaP3基因组中无酶切位点的Pst Ⅰ对溶原性细菌全基因组进行酶切,获得含有噬菌体PaP3全基因组及部分宿主菌DNA序列的大片段;然后进行第二次酶切,获得噬菌体基因组与宿主菌基因组的交界点序列,并进行克隆、测序,鉴定出杂合位点attR。根据λ噬菌体的整合机制,利用PCR反应扩增出另一杂合位点attL,根据测序结果及Blast检索确定attP 与attB的位置和DNA序列。结果:经序列比对发现,attP及attB的核心位点分别位于噬菌体PaP3基因组中的 t-RNAPro基因及铜绿假单胞菌PA3基因组中的t-RNALys基因中,其核心位点的DNA序列为21 bp(5'-GGTCGTAGGT- TCGAATCCTAC-3')。在核心位点的两侧存在正向重复序列及反向重复序列。结论:该研究为铜绿假单胞菌噬菌体的整合酶及整合机制的研究奠定了基础。

噬菌体治疗耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌合并铜绿假单胞菌肺部感染的病例报道

82岁男性患者,因反复肺部感染半年入院。患者既往有阿尔茨海默病史。本次入院前多次痰培养为耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌和耐碳青霉烯铜绿假单胞菌,使用包括替加环素在内的多种抗生素,患者痰细菌培养未转阴、肺部感染未改善。入院后予鲍曼不动杆菌噬菌体加铜绿假单胞菌噬菌体鸡尾酒疗法,每天2次雾化吸入,疗程分别为10d和19d;联合静脉滴注替加环素、哌拉西林他唑巴坦和阿米卡星。患者耐受良好,痰培养未见鲍曼不动杆菌生长,痰中铜绿假单胞菌荷菌量减少,临床症状和胸部X线片提示肺部感染明显好转。