(2S,4S)-4-羟脯氨酸的合成工艺研究

以(2S,4R)-4-羟脯氨酸为基础原料,以水为介质,利用三苯基膦和醇的Mitsunobu合成反应,改变其构型得到(2S,4S)-4-羟脯氨酸。此方法在现有合成路线基础上有所改进,在实验过程中探索反应物配比对各步反应收率的影响,得到实验的最优条件。并对产物进行表征及纯度分析,确定为(2S,4S)-4-羟脯氨酸,纯度为87.2%,收率93.3%。

分光光度法测定乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸的改进研究

针对皮革奶的鉴定长期以来没有正式的国标方法,而由中国检验检疫科学院食品安全所提供的"乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定—L(-)-羟脯氨酸质量分数测定"中试样的两种水解方法在实际操作中均有不同程度的缺陷,对试样的水解方法进行了改进,采用改进后的方法,加标回收率为97.5%,相对标准偏差为2.25%,检测限为5 mg/kg,定量限为20 mg/kg,该方法不仅简化了L(-)-羟脯氨酸测定的操作步骤,并且准确可行,具有良好的准确度、精密度、检测限和定量限低等优点。

产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及优化

反式-4-羟脯氨酸为手性亚氨基酸,是一种被广泛应用于医疗、美容、化工、畜牧领域的生产原料。通过以下工作构建了1株能够高效表达反式-4-脯氨酸羟化酶基因的重组大肠杆菌:(1)使用JCAT软件优化反式-4-脯氨酸羟化酶的编码区基因序列,改变141个碱基(替换了138个同义密码子),使其CAI指数由0.396 5优化至0.927 7,C/G由73.626 3%优化至59.706 9%,优化mRNA延伸效率;(2)优化非编码区序列,选择色氨酸启动子并进行简化,使RBS区包含SD序列,在RBS区前添加g10-L翻译增强子,使用RNAstructure软件优化起始区序列的二级结构,增强mRNA的起始效率;(3)构建重组大肠杆菌DH5α/pUC-19-pH,优化宿主及质粒载体,最终得到的重组菌DH5α/pUC-19-pH比酶活达到0.010 8 U/mg。

精氨酸缺陷型菌株发酵生产反式-4-羟脯氨酸

为了获得高产反式-4-羟脯氨酸的菌株,基于大肠杆菌的代谢网络模型的指导,以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)Δput A为出发菌株,通过基因敲除技术成功敲除arg B基因,阻断L-脯氨酸合成的前体物L-谷氨酸的分支代谢途径,增加L-脯氨酸合成的代谢流,构建了精氨酸缺陷型菌株E.coli BL21(DE3)Δput AΔarg B。同时转入表达质粒p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp,该质粒含有突变基因pro B2,该突变基因所编码的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低。摇瓶发酵结果表明,在外源添加600 mg/L L-精氨酸时,该重组菌株产反式-4-羟脯氨酸的量达到312.67 mg/L,较菌株E.coli BL21(DE3)Δput A/p UC19-pro B2A-Ptrp2-hyp提高了25.29%。

无外源脯氨酸发酵产反式-4-羟脯氨酸重组大肠杆菌的构建及发酵优化

为实现无外源脯氨酸的条件下直接从葡萄糖转化生成反式-4-羟脯氨酸,本实验采用定点突变和基因共表达的方法构建重组大肠杆菌:首先对L-脯氨酸生物合成途径中的关键酶谷氨酸激酶进行定点突变E143A、K145A,以增强L-脯氨酸生物合成能力;然后引入脯氨酸4-羟化酶基因,通过两个基因的共表达可以实现从葡萄糖到反式-4-羟脯氨酸的连续转化,而不再需要添加外源L-脯氨酸。得到的L-脯氨酸生物合成能力增强的菌株在摇瓶阶段L-脯氨酸的产量可达到1.4 g/L;pro BA2与hyp双基因共表达菌株的反式-4-羟脯氨酸产量为98.9 mg/L,比原始菌株提高了一倍,经发酵优化后得到培养基为:葡萄糖10 g/L,胰蛋白胨15 g/L,硫酸亚铁3 mmol/L,硫酸镁1 g/L,磷酸氢二钾3 g/L,氯化钙0.015 g/L,在这个培养条件下反式-4-羟脯氨酸的产量为220.0 mg/L,比优化前提高1.2倍。

大肠杆菌中顺式-3-羟脯氨酸羟化酶的定向改造

对以L-脯氨酸为底物,产顺式-3-羟脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)的羟化酶基因进行定向改造。从重组菌E.coli BL21(DE3)/p ET21a-ptrp2-H3P出发,通过易错PCR随机突变和定点突变处理,利用多孔板和创建的简易显色法相结合的高通量方法筛选出2株H3P高产菌P-2-H3、P-9-D5。经基因测序后得到5个突变位点R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I,并在出发菌基础上对此5个位点进行单一定点突变,得到5个突变体TBTR58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。发酵24 h测其产量找出3个优势突变位点。以TBT-R58C为出发菌,依次对另外2个位点进行定点突变。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突变体。发酵24 h产量达到了1125.3 mg/L。与重组菌相比,TBT-R58C-T83I-H89Y的产量提高了53.6%。

提高产反式-4-羟脯氨酸工程菌产量的发酵策略

为了实现羟脯氨酸的高产,首先以缺陷型菌株E.coli JM109ΔargB/pUC19-BH作为实验菌,通过单因素优化及正交试验,优化得到新的培养基配方及培养条件。其次通过基因工程手段引入透明颤菌血红蛋白VHB基因,构建菌株E.coli JM109ΔargB/pUC19-BHV,进行高密度发酵。结果显示,发酵培养基为:麦芽糖10 g/L,甘油5 g/L,胰蛋白胨22 g/L,K2HPO44 g/L,FeSO4(Fe2+∶VC=1∶1)5 mmol/L,MgSO4·7H2O 1.7 g/L,Nacl 3 g/L,Cacl20.005 g/L;培养条件为:初始pH 8.5,温度30℃,接种体积分数4%,转速220 r/min。此条件下,菌株E.coli JM109ΔargB/pUC19-BH羟脯氨酸产量约为1602 mg/L,约为优化前的1.4倍.在7 L罐发酵培养,菌株E.coli JM109ΔargB/pUC19-BHV的羟脯氨酸产量约为18.3 g/L,与JM109ΔargB/pUC19-BH相比,提高了13.2%,说明VHB基因的引入有利于羟脯氨酸产量提高.

产顺式-4-羟脯氨酸枯草芽孢杆菌工程菌的构建及发酵优化

顺式-4-羟脯氨酸(CHOP)是一种重要的手性结构物质,可广泛用于药物以及香料制造。本研究为开发CHOP的生物合成方法,将来源于中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的L-脯氨酸-4-羟化酶在枯草芽孢杆菌WB800N中实现了成功表达,构建获得了能够以L-脯氨酸为底物合成CHOP的工程菌株,进而对该菌株的发酵条件以及发酵组分进行了优化研究。结果表明:工程菌株的最适发酵温度为25℃,最适诱导剂浓度为1 mmol/L,最适发酵p H为5;在发酵体系中加入5 mmol/L硫酸亚铁和2.5 g/L L-脯氨酸时最有利于合成CHOP。在最优发酵体系下发酵60 h后,顺式-4-羟脯氨酸的产量可以达到120.2 mg/L。本文成功的构建了羟脯氨酸生产菌株枯草杆菌WB800 p HT-P4H,而研究结果为枯草杆菌工程菌发酵生产顺式-4-羟铺氨酸提供了基础。

乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸测定方法的改进

由食品整治办发布的中国检验检疫科学院食品安全所提供的"乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定—L(-)-羟脯氨酸含量测定"中试样的两种水解方法在实际操作中均有不同程度的缺陷,方法一采用的是已经作废的《GB 9695.23-90肉与肉制品L(-)-羟脯氨酸含量测定》中的水解方法,方法二有抽真空再充氮气以及需要110℃密封水解,操作复杂且危险。本文对试样的水解方法进行了改进,采用改进后的方法,加标回收率为84.8%,相对标准偏差为2.2%,检测限为0.001μg/mL,定量限为0.004μg/mL,该方法不仅简化了羟脯氨酸测定的操作步骤,并且准确可行,具有良好的准确度、精密度、检测限和定量限低等优点。

产3-羟脯氨酸重组菌的构建及发酵优化

顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)来避免异源表达时的诱导剂使用,构建重组质粒p ES-Ptrp2-P3H,成功构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H,优化后的脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)改变了168个碱基,GC含量由原来的64.83%降低到49.31%。该菌在初步优化培养基(葡萄糖1 g/d L,甘油0.125 g/d L,胰蛋白胨1.6 g/d L,(NH_4)_2SO_40.5 g/d L,K_2HPO_40.1 g/d L,NaCl 0.2 g/d L,FeSO_41 mmol/L,MgSO_40.5 g/d L,CaCl_20.015 g/d L,脯氨酸10 g/L,pH 7.5)上能一步法原位合成顺式-3-羟脯氨酸,摇瓶发酵24 h,产量0.8 g/L,比优化前提高一倍以上,为进一步开展顺-3-羟脯氨酸产业化提供了依据。

以甘油为碳源发酵高产反式-4-羟脯氨酸菌株的选育及营养优化

以低品级甘油为碳源进行微生物发酵合成反式-4-羟脯氨酸(Trans-4-hydroxy proline,Hyp)的探索。从实验室构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/p UC19-ptrp2-Hyp出发,通过易错PCR随机突变和常压室温等离子体复合诱变处理,利用单菌落琼脂块和氨基酸显色相结合高通量筛选出1株以甘油为唯一碳源的Hyp高产菌P71。与葡萄糖培养基相比,该菌株更适合在甘油上生长并转化L-脯氨酸合成Hyp,发酵20 h产Hyp高达1.20g/L,比生长在葡萄糖培养基上高70%以上;比其出发菌株在葡萄糖培养基上产量提高了1倍以上。通过培养基成分系统优化,发现胰蛋白胨、Fe SO4和L-脯氨酸是3大主要影响因素,最适加量分别为7.01 g/L、11.51 g/L和1.41 mmol/L;在该条件下突变菌株摇瓶发酵12 h产Hyp达1.61 g/L,比优化前提高了50%。

分光光度法测定酸奶中L(-)-羟脯氨酸含量的不确定度评定

对分光光度法测定酸奶中L(-)-羟脯氨酸的含量进行不确定度评定,为评价该方法的准确性和可靠性提供依据。根据《化学分析中不确定度的评估指南》、《化学分析测量不确定度评定》提供的不确定度分析思路,用改进后的L(-)-羟脯氨酸检测方法对市售某酸奶进行重复性检测,分析影响测量结果的各个因素,并对不确定度进行评定和表述。本方法的标准不确定度为0.0015g/100g,扩展不确定度为0.0030g/100g。改进后的L(-)-羟脯氨酸检测方法操作简单、有效可行;最终结果的不确定度主要由样品溶液中L(-)-羟脯氨酸含量和样品处理过程产生。

乳和乳制品中动物水解蛋白鉴定——比色法测定L(-)-羟脯氨酸含量

目的:研究乳和乳制品中动物水解蛋白的鉴定方法。通过对L(-)-羟脯氨酸的检测来鉴定是否含有动物水解蛋白。方法:样品经酸水解,释放出羟脯氨酸。经氯胺T氧化,生成含有吡咯环的氧化物。用高氯酸破坏过量的氯胺T。羟脯氨酸氧化物与对二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物,在波长558nm处进行比色测定。结果:动物水解蛋白在110℃条件下水解6h后,能够充分水解为L(-)-羟脯氨酸。以L(-)-羟脯氨酸为标样,比色法测定乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量。该方法的加标回收率为99.6%～104.6%,满足分光光度法分析方法的实验需求。

乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量的测定方法

目的:改进乳与乳制品中动物水解蛋白鉴定-L(-)-羟脯氨酸含量测定法(卫生部指定方法)。方法:在其前处理过程中用硫酸溶液代替氯化亚锡盐酸溶液水解样品,用烘箱代替了水浴水解样品,改动了试样前处理和测定操作。方法的线性范围0μg/mL^2.0μg/mL,相关系数γ-0.99993,加标回收率为89.5%~101.0%。结论:该方法显色灵敏,稳定性好,准确,干扰少,适用于乳及乳制品中-L(-)-羟脯氨酸含量测定。

产顺式-4-L-羟脯氨酸工程菌的构建及转化条件的优化

【目的】构建产顺式-4-L-羟脯氨酸(cis-4-Hyp)的工程菌并优化其转化条件。【方法】通过调整大肠杆菌的密码子偏好性以及mRNA二级结构对顺式-4-L-脯氨酸羟化酶(cis-P4H)基因进行优化,构建该基因的表达菌株。采用Ni-NTA亲和层析柱分离纯化cis-P4H,测定cis-P4H的酶活和稳定性。然后采用全细胞催化法制备cis-4-Hyp,通过单因素试验和正交试验对相关的转化条件进行优化。【结果】构建了一株产cis-4-Hyp的工程菌,cis-P4H的比活为2.65 U/mg,半衰期为2.32 h。经过条件优化后,采用OD600为0.9时加入IPTG获得的工程菌菌体构建转化体系,在转化体系pH 6.5,转化温度为31°C,转化时间为60 h时,L-脯氨酸转化率最高达到83.33%。【结论】研究获得的工程菌及转化条件具有良好的工业应用前景。

比色法测定乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸的探讨

目的对比色法测定乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸的方法和样品处理过程进行探讨。方法采用12.0 mol/L盐酸110(±1)℃恒温消解、过滤后定容、调节pH后按GB/T9695.23-2008加氯胺T氧化、加显色剂、60℃水浴后比色测定,并绘制标准曲线比较定量。结果该法线性范围L(-)-羟脯氨酸在1.0～10.0μg,标准曲线的线性良好,r=0.999 5,方法灵敏度为16.2μg/吸光度,检出限48.8μg/g,回收率在80.5%～95.2%,相对标准偏差在2.15%～4.18%。结论比色法测定羟脯氨酸的准确度和精密度良好,能有效地测定乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量。

培养骨髓基质细胞的羟脯氨酸-2-表异构酶活性

本实验利用液体静置法体外培养小鼠骨髓基质细胞.对生长细胞进行倒置显微镜下的原位连续观察及数种细胞化学观察.结果发现,骨髓游离细胞在两周内逐日减少,而贴壁细胞逐日增殖和分化.在成纤维细胞,网状细胞和巨噬细胞中均出现很强的羟脯氨酸-2-表异构酶(Hydro-xyproline-2-epimerase,EC5.1.1.a简称HP-Ⅱ-E)活性.证明杂环亚氨基酸-羟脯氨酸参与这些细胞代谢的过程非常活跃.

1,4-二棕榈酰羟脯氨酸的合成工艺

对化妆品用皮肤抗衰老剂1,4-二棕榈酰羟脯氨酸的合成工艺进行了研究。重点对棕榈酰氯与羟脯氨酸缩合反应的摩尔比、反应时间、反应温度、反应介质、pH值等因素进行了考察。得到的适宜的反应条件为:丙酮体积分数为50%、n(羟脯氨酸)∶n(棕榈酰氯)=1∶2.5、pH=9～10、反应温度15℃、反应时间4h。产物经纯化后得到熔点为81～85℃的白色固体粉末。

1,4-二棕榈酰羟脯氨酸的合成

对化妆品用皮肤抗衰老剂1，4-二棕榈酰羟脯氨酸的合成工艺进行了研究。该合成由棕榈酸的酰氯化和棕榈酰氯与羟脯氨酸的缩合两步反应组成。对棕榈酰氯与羟脯氨酸缩合反应的摩尔比、反应时间、反应温度、反应介质、pH等因素进行了考察，得到了适宜的反应条件为：丙酮体积分数为50％、n（羟脯氨酸）：n（棕榈酰氯）=1：2．5、pH=9～10、反应温度15℃、反应时间4h。并对反应进行了四因素三水平的正交优化。

细胞化学观察体外培养骨髓基质细胞的羟脯氨酸-2-表异构酶活性

本实验利用液体静置法体外培养小鼠骨髓基质细胞.对生长细胞进行倒置显微镜下的原位连续观察及数种细胞化学观察.结果发现,骨髓游高细胞在两周内逐日减少,而贴壁细胞逐日增殖和分化.网状细胞的生长过程中出现很强的羟脯氨酸-2-表异构酶(Hydroxyproline-2-epimerase,EC5.1,1,a简称HP-II-E)活性.这证明网状细胞在其功能蛋白质的合成过程中有杂环亚氨基酸-羟脯氨酸参与.