薯蓣皂苷对人肾癌786-0细胞缝隙连接功能的影响

目的探讨薯蓣皂苷(Dioscin,Dio)对人肾癌786-0细胞缝隙连接(Gap junction,GJ)功能的影响及其作用机制。方法 MTT法测Dio对786-0细胞生长的影响,荧光显微镜观察及流式细胞术结合荧光示踪法分析GJ功能变化,RT-PCR和Western blot分析连接蛋白基因表达。结果 0～2.5μmol.L-1 Dio处理786-0细胞48h不影响其存活率;用0、0.1、0.5、1和2μmol.L-1 Dio处理细胞48 h后,荧光显微镜下观察,Dio能明显提高786-0细胞Calcein传递,流式细胞术分析对照组和实验组的绿色荧光细胞(G4)与双阴性受体细胞(G3)比值(G4/G3)分别是0.13±0.01、0.23±0.01、0.30±0.01、0.56±0.02和1.15±0.02,各实验组G4/G3值明显高于对照组(P<0.01);RT-PCR和Western blot分析结果显示,用0、0.1、0.5、1和2μmol.L-1 Dio处理细胞48 h对其Cx43、Cx32和Cx26表达无明显影响。结论体外较低浓度Dio能够有效促进786-0细胞GJ功能,且具有明显的剂量效应关系。但Dio促进GJ机制并不是通过上调Cx43、Cx32和Cx26蛋白表达途径。

As_2O_3诱导人肾癌786-0细胞凋亡及其分子机制的研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)诱导786-0细胞凋亡的作用及其分子机制。方法用FCM和TUNEL等方法观察As2O3诱导786-0细胞凋亡,以ICC、RT-PCR、ISH、Western blot和EMSA技术等检测凋亡相关基因p53、bcl-2、c-myc、c-fos、NF-κBp65的mRNA和蛋白表达及NF-κBDNA结合活性的改变。结果2μmol/L以上浓度As2O3作用786-0细胞24h后开始发生细胞凋亡,出现凋亡的形态学改变和特征性亚二倍体峰(凋亡峰),使786-0细胞内p53活性升高(P<0.05),而bcl-2、c-myc、c-fos和NF-κBp65基因表达降低(P<0.05),NF-κBDNA结合活性也被显著抑制(P<0.01)。结论As2O3可能通过降低NF-κBp65基因表达和NF-κBDNA结合活性,下调bcl-2、c-myc和c-fos基因表达,而增加p53基因的表达,诱导人肾癌786-0细胞凋亡。

冬虫夏草菌丝粗多糖对SP2／0细胞凋亡和p53表达的影响

观察冬虫夏草菌丝粗多糖对SP2/0细胞凋亡诱导和p53基因表达的影响。在体外用粗多糖处理SP2/0细胞,MTT法检测其对肿瘤细胞增殖抑制作用,Hochest33342荧光染色观察细胞凋亡的形态学变化,DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞的周期,实时荧光定量PCR检测p53基因的表达情况。结果发现,与对照组相比,冬虫夏草粗多糖可抑制SP2/0细胞增殖,诱导出现典型凋亡形态变化,电泳出现特有梯形条带,引起细胞周期阻滞,使p53基因的表达明显改变。这提示冬虫夏草粗多糖对SP2/0细胞生长的抑制,可能与诱导凋亡和p53基因表达的改变有关。

HCVC区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达

目的 观察HCVC区基因在SP2 / 0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达情况 .方法 构建pEF HCVC重组质粒 ,转染SP2 / 0细胞 ,经G4 18进行筛选 ,建立稳定转染pEF HCVC的SP2 / 0细胞系 .并将转染后的SP2 / 0细胞接种于BALB/c小鼠皮下产生浆细胞瘤 .结果 用斑点杂交方法检测转染后的细胞 ,有HCVmRNA .免疫组化检测瞬时转染以及稳定转染的SP2 / 0细胞涂片均发现存在有阳性信号 .另外 ,对瘤组织进行免疫组化检测 ,发现有HCVC蛋白表达 .结论 pEF HCVC重组质粒可以在SP2 / 0细胞中长期稳定表达 ,也可以在BALB/c小鼠浆细胞瘤内表达 .

As_2O_3抑制人肾癌786-0细胞血管生成及浸润转移机制的初步研究

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)抑制人肾癌细胞系786-0细胞血管生成及浸润转移的机制。方法:采用免疫细胞化学方法检测As2O3处理前后786-0细胞VEGF、nm23、MMP-9、TIMP-1蛋白表达的改变;RT-PCR分析TGF-β1、TβR-I和TβR-IImRNA表达的改变。结果:2μmol/L As2O3处理肾癌786-0细胞72h后可显著抑制VEGF、MMP-9的蛋白表达(P<0.01),而促进786-0细胞中TIMP-1和nm23蛋白的表达(P<0.05)。786-0细胞中缺乏TβR-I mRNA,As2O3处理后,786-0细胞中TGF-β1和TβR-II mRNA表达无改变(P>0.05)。结论:As2O3通过抑制VEGF和MMP-9的蛋白表达,增加TIMP-1和nm-23蛋白的表达,抑制786-0细胞的血管生成和转移。

PLCε基因通过NF-κB/p65途径抑制肾癌786-0细胞的增殖

目的探讨RNA干扰技术沉默人源磷脂酶Cε(PLCε)基因对肾癌786-0细胞p65核转位的调控,对786-0细胞增殖的影响及其机制。方法用携带PLCεshRNA基因的真核表达质粒pGenesil-PLCε转染786-0细胞,克隆形成实验检测786-0细胞的增殖,RT-PCR检测PLCε、c-Myc和COX-2 mRNA的表达,Western blot检测PLCε、c-Myc、COX-2和p65总蛋白及p65在细胞核的表达,细胞免疫荧光检测p65在细胞核与细胞质的定位。同时应用p65特异的抑制剂BAY11-7082处理786-0细胞,Western blot检测c-Myc和COX-2蛋白的表达。结果转染pGenesil-PLCε质粒的786-0细胞生长明显受抑制;转染pGenesil-PLCε质粒细胞中PLCε、c-Myc和COX-2 mRNA和蛋白表达水平均较对照组pGenesil-NP明显下调(P<0.01),且抑制核中p65蛋白的表达(P<0.01),细胞免疫荧光结果显示转染pGenesil-PLCε质粒组p65在细胞核中的表达较对照组pGenesil-NP明显下降;BAY11-7082抑制c-Myc和COX-2蛋白的表达(P<0.01),且呈时间浓度依赖性。结论沉默PLCε基因后可能是通过抑制p65的核转位及c-Myc、COX-2的表达抑制786-0细胞的增殖。

As_2O_3对肾癌细胞786-0细胞周期的影响及其机制的研究

目的:探讨三氧化二砷(As2O3)对人肾癌细胞系786-0的细胞周期、周期素(Cyclin)和周期素依赖性激酶抑制剂(DKI)的影响,探讨As2O3抗肾癌作用的机制。方法:采用细胞培养、流式细胞技术观察As2O3作用786-0细胞后细胞周期的改变,以免疫细胞化学和RT-PCR技术等检测As2O3致细胞Cyclin蛋白和CDKI基因的改变。结果:以2μmol/L或5μmol/LAs2O3作用786-0细胞24h、48h、72h,使其细胞周期停滞于G2/M和G0/G1期,并出现细胞凋亡,周期素蛋白CyclinA、B1、D1、E表达均不同程度降低(P<0.05),而其CDKI基因p16、p21WAF/CIPI、p27kip1表达升高(P<0.05)。结论:As2O3通过降低CyclinA、B1、D1、E蛋白的表达和增强p16、P21WAF/CIPI、p27kip1活性,将786-0细胞阻滞于G2/M和G0/G1期,达到其抑制增殖和诱导细胞凋亡的作用。

冬虫夏草菌丝体水提液对SP2/0细胞周期的作用

用四唑篮比色法试验,琼脂糖凝胶电泳方法及流式细胞仪研究了冬虫夏草菌丝体水提液对小鼠骨髓瘤细胞生长、凋亡及细胞周期的影响。结果发现浓度为100mg/ml水提液抑制瘤细胞的增殖,抑制率为70%,使细胞周期阻滞,在DNA电泳出现明显凋亡带,这提示水提液对瘤细胞抑制作用可能是由于细胞周期阻滞诱导细胞凋亡的结果。

人参皂苷Rg3对常氧和缺氧条件下Eca-109和786-0细胞VEGF、HIF-1α和COX-2表达的影响

目的:探讨人参皂苷Rg3对常氧和缺氧条件下Eca-109和786-0细胞血管内皮生长因子(VEGF)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)和环氧合酶-2(COX-2)表达的影响。方法:Eca-109和786-0细胞分别于常氧和缺氧条件下培养,并分别给予不同浓度的Rg3处理。采用MTT法检测Rg3对2种细胞增殖的影响,Real-timePCR检测2种细胞VEGF和HIF-1αmRNA的表达,ELISA法检测2种细胞VEGF蛋白的表达,Westernblot检测2种细胞HIF-1α和COX-2蛋白的表达。结果:在常氧或缺氧环境中,Rg3均能抑制Eca-109和786-0细胞增殖;抑制2种细胞VEGFmRNA和蛋白的表达及COX-2蛋白的表达,同时抑制HIF-1αmRNA的表达,其作用呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:Rg3抑制常氧和缺氧状态下Eca-109和786-0细胞的增殖,其机制可能与其抑制HIF-1α和COX-2的表达,从而抑制VEGF的表达有关。

鞣花酸对骨髓瘤SP2/0细胞的作用

目的探讨五倍子提取物鞣花酸抗骨髓瘤的生物学活性及相关机制。方法 20,40和60μg·mL-1鞣花酸体外孵育骨髓瘤SP2/0细胞株,采用细胞形态学、细胞增殖实验和流式细胞仪检测鞣花酸对SP2/0细胞株增殖、凋亡和细胞周期的影响,通过Western blotting技术检测肿瘤细胞增殖与凋亡相关基因COX-2的表达。结果 20,40,60μg·mL-1鞣花酸孵育骨髓瘤SP2/0细胞株48 h后,细胞周期阻滞于G1期,G1期细胞百分率分别为(55.21±3.01)%,(64.48±0.43)%,(75.10±2.46)%,与对照组(34.04±1.74)%比较,差异有统计学意义(P<0.01)。20,40和60μg·mL-1鞣花酸细胞抑制率分别为(21.18±5.92)%,(44.58±3.43)%和(70.15±2.90)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。细胞早期凋亡率分别为(9.60±0.56)%,(19.30±1.51)%和(35.10±5.26)%,与对照组(3.23±0.85)%比较,差异有统计学意义(P<0.01),随药物浓度的增加COX-2的表达逐渐下降。结论鞣花酸能够抑制骨髓瘤SP2/0细胞增殖,促进其凋亡。

线粒体DNA缺失细胞（ρ^0细胞）的构建与鉴定

目的探讨构建线粒体缺失细胞(ρ0细胞)的方法,为后继研究提供细胞模型。方法采用5μg/mL和7.5μg/mL两种浓度溴化乙锭持续作用于SH-SY5Y细胞构建线粒体缺失细胞,透射电镜观察和PCR法鉴定。结果 SHSY5Y细胞经过7.5μg/mL溴化乙锭持续作用95d后可见细胞线粒体肿胀变圆,基质消失,变成只剩外壳的"鬼影样"结构,线粒体嵴极少且变形;mtDNAPCR扩增未见目的条带。结论成功构建线粒体缺失细胞,为后继研究奠定细胞模型基础。

白花蛇舌草乙醇提取物对人肾癌786-0细胞体外生长及体内成瘤的影响

目的:探讨白花蛇舌草乙醇提取物(Ethanol extract of Hedyotis Diffusae Herba,EEHDH)对人肾癌786-0细胞体外生长及体内成瘤的影响。方法:体外实验采用MTT法检测EEHDH对人肾癌786-0细胞的生长抑制作用;体内实验采用人肾癌786-0细胞实体瘤小鼠动物模型,取30只昆明小鼠,6只为正常对照组,余24只昆明种小鼠每只左后肢腋窝皮下接种0.2 m L肿瘤细胞悬液,24 h后称质量,随机分为模型对照组、EEHDH低剂量组、EEHDH中剂量组和EEHDH高剂量组,每组各6只。正常组和模型对照组灌胃等体积饮用水,EEHDH低剂量组、EEHDH中剂量组和EEHDH高剂量组分别灌胃含生药量5.0 g·kg-1、10.0 g·kg-1、20.0 g·kg-1的EEHDH溶液,每日1次,连续给药14 d,末次给药24 h后颈椎脱臼处死动物,切开肿瘤部位,剥离瘤块,用滤纸吸净其上液体,称瘤块质量,计算抑瘤率。同时分离胸腺、脾脏,精密称质量,计算胸腺指数、脾脏指数。结果:EEHDH在体外可显著抑制人肾癌786-0细胞的增值,其效果与剂量和作用时间相关。体内试验表明,与模型组比较,EEHDH低剂量组、EEHDH中剂量组、EEHDH高剂量组均能明显减轻瘤块的质量,差异具有统计学意义(P<0.05),抑瘤率分别为16.02%、31.22%和34.26%,差异有统计学意义(P<0.05)。小鼠荷瘤后,其脾脏指数、胸腺指数比较正常组显著升高,差异有统计学意义(P<0.05);与模型组比较,EEHDH低剂量组、EEHDH中剂量组、EEHDH高剂量组能显著提高脾脏指数,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:EEHDH在体外能明显抑制人肾癌786-0细胞的增值,体内能显著抑制荷瘤小鼠肾癌786-0细胞生长,与调节免疫器官功能有关。

叶下珠抑制人肾癌786-0细胞增殖作用的研究

目的观察叶下珠提取物对人肾癌786-0细胞增殖抑制作用并探讨叶下珠提取物发挥该作用的机制,为叶下珠的临床应用更进一步的提供理论依据。方法用不同浓度的叶下珠(浓度分别为1、10、100、1000μg/m L)作用于人肾癌786-0细胞株,采用CCK-8法检测叶下珠对肾癌786-0细胞增殖效应的影响,采用流式细胞术(FCM)检测叶下珠对肾癌786-0细胞周期的影响,采用蛋白印迹法检测叶下珠对Survivin蛋白表达水平的影响。结果 CCK-8法结果提示,不同浓度的叶下珠均可显著抑制肾癌786-0细胞的增殖,且抑制率呈时间、剂量依赖关系。FCM检测发现叶下珠可使肾癌786-0细胞周期中的G0/G1期比例增加,S期缩短。蛋白印迹法显示,叶下珠可使肾癌786-0细胞中Survivin蛋白表达水平降低。结论通过建立人肾癌786-0细胞的体外抗肿瘤实验模型,预试验结果表明叶下珠乙醇提取物对人肾癌786-0细胞增殖具有抑制作用。

GKP细胞与SP2/0细胞融合的试验

该试验将长成单层的尕里巴牛肾第三代细胞用胰蛋白酶消化后,加入SP2/0细胞,经反复吹打,在没有促融合因子及电场的条件下,36℃恒温培养,筛选出了能稳定连续传代60代次以上。

刃天青法检测mtDNA缺失C6ρ0细胞的活力

目的建立以刃天青为氧化还原指示剂测定mtDNA被完全清除的大鼠胶质瘤C6细胞(C6ρ0)增殖及活力的方法,并对其有效性进行验证。方法取对数生长期的C6ρ0细胞,采用刃天青法比较不同细胞数量、刃天青浓度、孵育时间对荧光强度的影响,优化测定C6ρ0细胞活力的条件。比较MTT法和刃天青法测定C6ρ0和C6细胞活力的灵敏性,并以天然化合物熊果酸对C6ρ0和C6细胞活力的影响对该方法进行验证。结果 C6ρ0细胞数为0~30 000/孔,25μg/mL刃天青培养基避光孵育1~4 h,细胞数量与荧光强度呈良好线性关系,灵敏性高于MTT法。熊果酸0~50μmol/L对C6ρ0和C6细胞具有增殖抑制作用,且增殖抑制率差异有统计学意义(P<0.05),IC50分别为20.82、14.62μg/mL。结论刃天青法灵敏、简单、安全无毒、经济便宜、重复性好,特别适用于生长代谢缓慢的细胞系,可用于其细胞增殖测定、活力分析及化合物细胞毒的高通量筛选。

小鼠SP2/0细胞移植瘤的遗传修饰位点

背景与目的:我们的研究发现BALB/c小鼠是SP2/0细胞移植瘤的敏感小鼠,而C57BL/6J小鼠则是抗性小鼠。本研究利用这两种近交系小鼠和它们杂交的F2代进行移植肿瘤重量遗传修饰位点的检测。方法:对208只BALB/c×C57BL/6J的F2代小鼠左后腿皮下注射5.0×106个SP2/0细胞,在注射后第17天处死小鼠,记录移植瘤的数量和重量。采用覆盖小鼠所有染色体的85个微卫星标记,对208只F2代小鼠进行全基因组扫描,并进行复合区间作图。结果:发现8个变异解释率>10%的位点与肿瘤生长有关(P<0.01),它们分别位于1号(D1Mit113,55cM和D1Mit407,52cM)、4号(D4Mit226,41cM)、9号(D9Mit302,55cM)、10号(D10Mit264,42cM)、11号(D11Mit115,35cM)、14号(D14Mit125,45cM)和18号染色体(D18Mit123,31cM)上。结论:个体对SP2/0细胞移植瘤的易感性受多位点变异控制,找到目标位点有助于基因单倍型确认和肿瘤易感性/抗性基因的精细研究。

小鼠CD_8分子α链在SP2/0细胞中的表达及鉴定

目的构建CD8α真核表达载体,为构建膜型细胞因子提供重要工具。方法采取RT-PCR从磁珠分选的CD8α+T细胞中得到CD8α的cDNA基因,将其克隆入表达载体pVITRO。经测序后转染SP2/0细胞,通过流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测CD8α分子在SP2/0细胞中的表达情况。结果构建的pVITRO/CD8α载体测序后,Genebank比对证实为CD8α的cD-NA分子,流式细胞仪和激光共聚焦显微镜结果均说明CD8α在SP2/0细胞的细胞膜上得到表达。结论 CD8α在真核细胞膜上能成功表达,为进一步构建膜表达型细胞因子奠定了基础。

索坦对肾透明细胞癌786-0细胞生长与Tiam1表达的影响

目的:探讨索坦对肾透明细胞癌786-0细胞生长与Tiam1表达的影响。方法:将对数生长期肾透明细胞癌786-0细胞分为4组:索坦低、中、高浓度处理组和正常对照组。索坦低、中、高浓度处理组细胞分别用2、4和8μmol/L索坦培养24、48和72h。采用免疫细胞化学和原位杂交技术检测各组细胞中Tiam1蛋白和mRNA的表达。采用MTT和TUNEL法检测培养48h各组细胞凋亡和存活情况。结果:各组细胞培养24、48和72h时间点的Ti-am1蛋白及mRNA表达比较,差异有统计学意义(F=898.782、551.191、510.484,294.803、460.127、358.019,P均<0.05)。索坦高、中、低浓度处理组不同时间点Tiam1蛋白及mRNA表达比较,差异有统计学意义(F=38.601、81.324、262.601,120.671、509.902、56.464,P均<0.05)。同一时间点随着索坦浓度增加,细胞Tiam1蛋白及mRNA的表达减弱(P<0.05);同一浓度处理组中,随着时间延长,Tiam1蛋白及mRNA的表达降低(P<0.05)。培养48h,各组细胞存活率和凋亡率比较,差异有统计学意义(F=123.432和120.341,P均<0.001),随着索坦浓度增加,细胞存活率降低,凋亡率增加(P<0.05)。结论:索坦可能通过抑制Tiam1基因在肾癌细胞株786-0中表达,促进肿瘤细胞凋亡,抑制细胞生长。

牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体的构建及其在SP2/0细胞中的表达

目的构建牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体,并在SP2/0细胞中表达。方法利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64、esat-6基因和mpb64-ag85b融合基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcMAE。将该重组质粒体外转染SP2/0细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达。结果真核表达质粒pcMAE经酶切鉴定及测序,证实构建正确,转染后SP2/0细胞膜上出现均质的蓝绿色荧光。结论已成功构建了牛分枝杆菌mpb64-ag85b-esat-6融合基因真核表达载体,并在SP2/0细胞中获得表达,为进一步研制牛结核病多基因融合DNA疫苗奠定了基础。

缺氧对786-0细胞体外黏附和迁移能力的影响

目的:探讨缺氧条件下肾癌786-0细胞体外黏附和迁移能力的变化。方法:将786-0细胞分别置于正常氧(37℃体积分数为5%CO2和21%O2饱和度,正常组)和缺氧(37℃体积分数为10%O2、5%CO2及85%N2,缺氧组)环境中培养,采用MTT法和Boyden小室法检测2组细胞的黏附能力和侵袭能力。结果:正常组786-0细胞的黏附率为(71.6±6.1)%,与缺氧组的(84.2±4.4)%相比,差异有统计学意义(t=3.748,P=0.006)。缺氧组786-0细胞的穿膜细胞数为(48±6),高于正常组的(28±5)(t=5.722,P=0.001)。结论:缺氧条件下肾癌786-0细胞的黏附和迁移能力增强。