猪链球菌2型38000蛋白主要功能区基因的克隆与表达

根据GenBank中已发表的猪链球菌2型38000蛋白基因核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,采用PCR方法,以四川分离株猪链球菌2型基因组DNA为模板扩增38000蛋白主要功能区基因。将PCR产物纯化后与pMD18-T连接转化宿主菌DH5α,提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定。将目的片段定向克隆到表达载体pET32a中,经测序正确后,重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3),于37℃、0.8mmol/LIPTG条件下进行诱导表达,结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子质量约为35000的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法(Western blotting)证实该重组蛋白可以与猪链球菌2型阳性血清发生特异性反应。

DNA甲基化和缺氧对食管癌细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B19000相互作用蛋白3基因表达的影响

目的 观察DNA甲基化及缺氧与沉默缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）对食管癌细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2（bcl-2）/腺病毒E1B 19 000相互作用蛋白3（BNIP3）基因表达的影响.方法 收集食管癌细胞株KE4、Kyse-140、Caes-17和TE-7,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot分别检测BNIP3 mRNA和蛋白表达水平,甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测BNIP3启动子区甲基化状态.MIC-101乏氧培养系统模拟肿瘤缺氧微环境,实时荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）和Western blot检测缺氧（1％O2）、常氧及小干扰RNA（siRNA）沉默HIF-1α后Caes-17细胞中BNIP3mRNA和蛋白表达水平.结果 BNIP3在KE4和Caes-17细胞中表达水平均较高,而在TE-7和Kyse-140细胞中表达较低;同时MSP结果显示,在TE-7和Kyse-140细胞中BNIP3启动子区发生了明显的甲基化,经5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理2个细胞株后,BNIP3启动子区甲基化状态得到了逆转,同时其表达水平显著升高.缺氧条件下,Caes-17细胞中BNIP3 mRNA （4.35±0.20）和蛋白（1.23±0.04）的表达水平较常氧时（BNIP3 mRNA：1.07 ±0.12,BNIP3蛋白：0.28 ±0.03）显著升高（P＜0.05）,siRNA转染Caes-17细胞后能显著下调HIF-1α的表达（抑制率为90％）,并导致BNIP3基因的表达（BNIP3 mRNA：1.12 ±0.14,BNIP3蛋白：0.34±0.03）受到明显的抑制.结论 BNIP3基因启动子区甲基化是导致其在食管癌细胞中表达较弱的重要原因之一,甲基化酶抑制剂可逆转BNIP3的甲基化状态重新恢复其表达;缺氧能使HIF-1α蛋白的表达升高,同时上调BNIP3的表达水平.

PRRSV受体CD163与Marc-145细胞蛋白的相互作用

本研究旨在分析CD163受体与Marc-145细胞中230000蛋白的相互作用区域。使用Scanprosite软件对MARC-145细胞的CD163蛋白结构和功能域进行预测，结合稀有密码子分析软件对CD163进行分段，分别构建原核表达载体pET-28a-（M1、M2、M3），利用镍柱纯化重组蛋白，通过免疫共沉淀分析分段蛋白M1、M2和M3与230000蛋白的相互作用。经PCR、双酶切及测序鉴定表明所构建的原核表达载体是正确的；SDS-PAGE检验抗独特型单克隆抗体Mab2-5G2能够识别和沉淀MARC-145细胞中230000蛋白；通过Westernblot鉴定证明230000蛋白与M1和M3蛋白相互作用。230000蛋白与CD163蛋白相互作用位点主要在60～777，2143-3120nt区域内，为深入探索CDl63与230000蛋白相互作用位点奠定基础。

抗炎多肽对内毒素诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用

目的研究抗炎多肽AF2（antiflammin-2）和重组多肽R2（recombinant peptide sequence2）对内毒素（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤（ALI）的保护作用，及其对肺组织clara细胞16000蛋白（CCl6）和表面活性蛋白A（SP—A）表达的影响。方法Balb／c雄性小鼠随机分为5组：对照组，ALI模型组，AF2治疗组，R2治疗组和氢化可的松（HC）治疗组。ALI模型组和各治疗组分别腹腔注射LPS复制小鼠肺损伤模型；治疗组随后注射AF2（2mg／kg）、R2（2mg／kg）或氢化可的松（25mg／kg），对照组和Au模型组注射等量的生理盐水。在6h记录动物的呼吸频率；在12h处死动物，肺组织切片观察肺病理变化；肺组织研磨提取总RNA，半定量法检测CC16和SP—A的表达。结果（1）各治疗组动物6h呼吸频率均低于ALI模型组[（112±4）次／30S]，分别为AF2治疗组（108±2）次／30S、R2治疗组（101±2）次／30S、HC治疗组（96±2）次／30S，其中R2和HC治疗组与ALI模型组比较，差异有统计学意义。（2）肺组织病理学观察显示AF2、R2对LPS诱导的小鼠ALI肺组织的渗出、炎症细胞浸润有一定的抑制作用，各治疗组病理评分与ALI模型组比较差别均有统计学意义。（3）与ALI模型组比较，AF2治疗组CC16的表达上调，差异有统计学意义，R2和HC治疗组SP—A的表达上调，差异有统计学意义。结论抗炎多肽AF2和重组多肽R2对内毒素诱导的小鼠ALI有一定的保护作用。

缺氧诱导因子及其应答基因BNIP3和血管内皮生长因子在胃腺癌中表达及临床意义

目的检测缺氧诱导因子（HIF）及其应答基因bcl-2／腺病毒E1B19000相互作用蛋白3（BNIP3）和血管内皮生长因子（VEGF）在胃腺癌中的表达，探讨它们之间的关系以及在胃腺癌中表达的临床意义。方法采用免疫组化S-P法，检测70例胃腺癌组织和12例癌旁正常组织中HIF-1α、HIF-2α、BNIP3和VEGF的表达。结果70例胃腺癌组织中，HIF—1α、HIF-2α、BNIP3和VEGF的阳性表达率分别为61．4％、37．1％、51．4％和62．9％；而在正常对照组中的阳性表达率分别为8．3％、0、0和0，4种基因在不同组织间的表达率差异均有统计学意义（P〈0．01）。HIF—1α和VEGF的表达与胃腺癌淋巴结转移密切相关，BNIP3的表达与淋巴结转移呈负相关；HIF-1α的表达与BNIP3和VEGF的表达呈正相关。结论HIF通过调节其下游基因的表达在胃癌的发生和发展中发挥着重要作用；VEGF的表达与胃腺癌的不良生物学行为相关，而BNIP3的表达则提示预后较好。