大肠杆菌O157∶H7 CVa9株O抗原变异的研究

目的 研究本实验室保藏的大肠杆菌O15 7:H7(E coliO15 7:H7)日本分离株CVa9O抗原的变异。方法 血清凝集试验检测CVa9菌株O和H抗原 ,区分O抗原变异株与非变异株。聚合酶链反应 (PCR)法分别检测O15 7和H7特异性基因。生化试验检测生化特性。观察菌株在麦康凯、山梨醇麦康凯、棉子糖麦康凯及ChromagarO15 7显色培养基上菌落形态 ,菌落计数法计算变异率。结果 抗 -O15 7抗血清与CVa9菌株进行玻片凝集试验出现强凝集 (CVa9- 8)和不凝集 (CVa9- 1、CVa9- 15 )两种菌落 ,试管凝集试验结果相同 ,证实不凝集菌落O抗原发生变异。抗 -HT 抗血清分别与变异株和非变异株H抗原进行试管凝集试验 ,均为强凝集。两种菌株O15 7和H7特异性基因均为阳性。变异株与非变异株生化特性基本相同 ,但变异株不发酵棉子糖。两种菌株在麦康凯及山梨醇麦康凯培养基上菌落形态特征没有区别。在ChromagarO15 7显色培养基上培养 4 8h ,变异株为浅紫红色 ,菌落周边呈毛边状 ,非变异株为紫红色 ,菌落边缘整齐。变异株在用棉子糖代替乳糖制备的棉子糖麦康凯培养基上菌落呈粉红色 ,非变异株呈红色。菌落计数显示变异率为 99 80 %。结论 CVa9菌株在保存过程中O抗原发生变异 ,菌落形态及部分生化特征亦有所改变。

广州市人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株监测与基因进化分析

目的通过对广州市人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株基因变异和进化特点进行分析,掌握本地区H7N9病毒病原学特点,为疾病防控提供参考。方法选取2017年广州市人感染H7N9禽流感病毒阳性标本10份,提取核酸扩增HA、NA、M基因进行测序,通过生物信息学软件分析病毒重要蛋白突变情况和遗传进化特点。结果广州地区H7N9禽流感病毒基因同源性差异较大,大部分毒株基因与广东毒株同源性最高,部分毒株基因与河南、内蒙古等地毒株同源性最高。监测到5株病毒为H7N9禽流感病毒高致病性变异株,部分病毒出现了HA蛋白Q226L的突变,提示对人呼吸道上皮细胞SAα-2, 6Gal受体结合能力增加。HA蛋白和NA蛋白上糖基化位点均有一定的增加和缺失突变。HA、NA和M1蛋白上毒力相关位点均突变增强。M2蛋白均呈现耐药突变,同时监测到2株高致病性突变株出现对神经氨酸酶抑制剂的耐药突变。遗传进化结果显示,HA基因和NA基因在华南和华东分支均有分布,M1基因进化特点相对复杂,分别与华南地区H9N2、H7N9病毒,及北方地区的H7N9病毒重组。结论 2017年广州地区发现2株对达菲耐药的人感染H7N9禽流感病毒高致病性变异株。H7N9禽流感病毒在广州地区不断发生进化重组,具有遗传多样性和复杂性,提示高致病性耐药株有向华南以外地区传播的风险。

H7N9亚型禽流感病毒反向遗传操作系统的建立及其疫苗候选株的构建

为建立H7N9亚型禽流感病毒(AIV)反向遗传操作系统,本研究以H7N9亚型(AIV)A/CK/Shanghai/S1053/2013(CK/53)株为亲本病毒,构建了该病毒株的8质粒反向遗传操作系统,并拯救出救获株rCK/53。全基因组序列测定结果表明,rCK/53与亲本病毒的核苷酸序列完全一致。同时以A/PueaoRico/8/34(PR8)的内部基因为骨架,以CK/53的HA和NA的表面基因为供体,构建H7N9亚型AIV疫苗候选株CK53/PR8,疫苗株的8个基因来源与预期完全一致。对rCK/53以及疫苗候选株CK53/PR8在MDCK和A549两种细胞中进行生物学特性的比较,在A549中复制差异不显著,而在MDCK中48 h和72 h两者复制具有明显差异。rCK/53反向遗传操作系统的建立和疫苗候选株CK53/PR8的构建为进一步开展H7N9亚型AIV跨宿主传播机制、致病机理及进一步的免疫保护实验奠定了基础。

一起鸡感染H7N9流感病毒变异株的调查

[目的 ]通过对鸡H7N9流感病毒(变异株)感染临床解剖特征的描述以及H7N9流感病毒变异株来源的探讨,为今后该病的临床诊断以及防控提供借鉴。[方法 ]采用流行病学调查、临床解剖、实时荧光定量RTPCR、病毒分离测序等方法。[结果 ]病鸡外观症状与解剖症状均明显;H7、H9流感病毒核酸检测阳性;该分离株与2013年分离毒株(A/Anhui/1/2013(H7N9)的HA、NA基因核苷酸同源性分别为97.8%~97.9%、97.8%。[结论 ]鸡的感染死亡是由H7N9流感病毒(变异株)引起的;该变异株引发疫情迅猛,传染速度快,致死率高,应加强对其防控。

重组人禽流感H7N9疫苗株在Vero细胞上的适应性和传代稳定性研究

本文主要研究重组人感染高致病性禽流感H7N9株作为主工作种子批在Vero细胞连续传代中的高产特性和传代稳定性,为疫苗开发提供前期研究。将重组获得的H7N9流感病毒Vero细胞适应株(A/Anhui/1/2013Va)按照病毒感染复数(MOI)0.01的病毒量接种于Vero细胞,并连续传15代。血凝试验检测每代病毒血凝效价,并绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线;每代病毒用MDCK细胞检测病毒的感染性滴度;通过单向免疫扩散试验对重组病毒H7N9的第1及第16代进行型别鉴定;取第1、5及16代病毒,用鸡胚半数感染量及致死量检测病毒在传代过程中毒力变化;分别提取第1和16代H7N9流感病毒的RNA,反转录及克隆后测序,对比病毒在连续传代过程中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因的变化。试验结果表明:在连续传代过程中,病毒效价越来越趋于稳定,血凝效价稳定维持在384~448;病毒感染性滴度维持在7 Log10TCID50/mL左右;病毒在传代过程中毒力未发生显著变化;HA和NA在连续传代过程中并未出现因基因变异导致的编码氨基酸改变的状况。H7N9安徽株病毒在Vero细胞传代过程中不仅产量稳定,其毒力和基因也很稳定,可以将其作为H7N9流感疫苗候选株。

重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK悬浮细胞中培养条件的优化

目的:探索重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株的最佳培养条件,为规模化生产提供参数。方法:通过分析病毒培养液的血清浓度、温度、pH、胰酶终浓度和病毒接种量、收获时间来优化病毒在MDCK上的最佳培养条件。结果:重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK悬浮细胞上增殖的最佳培养条件为按接种量MOI 10^(-3),于胰酶终浓度为5μg/L、温度35.0℃、pH7.3±0.1的无血清病毒培养液中培养,收获时间为48~60 h,以48 h最佳。

A型禽流感病毒H7N9株NS1基因的克隆和真核表达

目的:构建H7N9亚型禽流感病毒NS1基因真核表达载体,并在293T细胞中表达其编码的蛋白。方法:提取H7N9亚型禽流感病毒分离株总RNA,RT-PCR扩增获得NS1的全长基因,克隆至真核表达载体pRK中构建pRK-FLAG-NS1,经酶切及测序鉴定正确后将质粒转染到293T细胞中,Western blot技术鉴定NS1蛋白的表达。结果:成功克隆了NS1全长基因,构建了H7N9毒株的NS1蛋白真核表达载体pRK-FLAG-NS1并转染于293T细胞中。结论:Western blot分析表明,NS1蛋白得到成功表达,为开展流感病毒蛋白功能及与真核细胞中的蛋白相互作用奠定了基础。

首株H7N9病毒疫苗种子株中国造

不久前,我国科学家首次宣布,成功研制出人感染H7N9禽流感病毒疫苗株。这是由浙大一院与香港大学联合研发的针对H7N9禽流感病毒的疫苗"种子株"。该成果打破和改变了中国流感疫苗株需由外国提供的历史,为及时应对新型流感疫情提供了有力的技术支撑。首次摆脱外国疫苗依赖症今年3月。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 StxⅡ基因表达

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157∶H7StxⅡ基因表达,并评价其对细菌生长的影响及细胞毒性。方法针对EHEC O157∶H7StxⅡ基因设计引物,构建CRISPR/Cas9表达质粒pdCas9-StxⅡ并转化EHEC O157∶H7感受态细胞,采用RT-PCR及胶体金法检测StxⅡ基因表达情况,绘制菌株生长曲线,将菌株培养上清液接种Vero细胞观察细胞病变情况。结果测序分析显示pdCas9-StxⅡ表达质粒被成功构建;转化EHEC O157∶H7(00G097)感受态细胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表达均受抑制,EHEC O157∶H7生长曲线未受影响(P值均>0.05)。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培养上清液对细胞的毒性效应(CPE为30%)显著低于对照菌株00G097和pdCas9-00G097(CPE均>80%)。结论成功构建的pdCas9-StxⅡ表达质粒能特异抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表达、降低细胞毒性,为进一步研究志贺毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病机理和基因工程减毒活菌苗奠定了基础。

鉴别H7N9流感病毒强毒和弱毒实时荧光RT-PCR方法的建立

为建立可以区分H7N9流感病毒强毒株和弱毒株的方法,通过比对Gen Bank和GISAID中H7N9流感病毒的HA基因序列以及本实验室保存的病毒序列,设计1对特异性引物和2条探针,建立了区分H7N9流感病毒强弱毒株的实时荧光RT-PCR方法,同时对该方法的反应体系和反应参数进行优化,并开展特异性和敏感性试验以及临床应用试验。特异性试验显示,该方法具有良好的特异性,对其他常见亚型的禽流感病毒和其他禽病病毒检测均为阴性。敏感性试验显示,该方法对H7N9流感强毒和弱毒HA基因的检测下限分别为0.004 fg和0.1 fg RNA模板,高于两种商品化试剂盒的灵敏度。利用该方法对40株经实验室分离鉴定的H7N9流感病毒进行对比验证,发现检出率和符合率均为100%。结果表明,该方法具有特异、敏感、准确的优点,可用于H7N9流感病毒的快速检测,同时还可区分强弱毒株,对H7N9流感病毒,尤其是高致病性流感病毒的早期诊断和有效防控具有重要意义。

野生H7N9流感病毒与H7N9/PR8重组病毒的生物学特性比较研究

A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(PR8)是高滴度鸡胚适应流感病毒株,WHO 1969年将其推荐为流感病毒疫苗株内部基因供体株,本世纪以来其也被广泛用于H5N1流感疫苗株的内部基因供体株。本研究利用反向遗传技术以携带PB2基因K627E突变的PR8内部基因为骨架,以一株H7N9亚型低致病力禽流感病毒CK/HN的表面基因为供体,并在其HA基因引入V^(186)G和L^(226)Q双点突变,构建了一株重组病毒H7N9(HN)/PR8。固相ELISA受体结合特性分析结果显示,野生病毒CK/HN可同时结合α-2,6-糖链(人源受体成分)和α-2,3-糖链(禽源受体成分),并且与前者的亲和力高于后者;重组病毒H7N9(HN)/PR8对α-2,3-糖链的亲和力明显增高,对α-2,6-糖链的亲和力则显著下降。以10~6鸡胚半数感染量(EID_(50))接种SPF鸡后,CK/HN病毒可在鸡体内复制,通过呼吸道和泄殖腔向外排泄,感染鸡血清均转阳;H7N9(HN)/PR8接种的鸡泄殖腔和呼吸道均无病毒排出,也无血清转阳,表明H7N9(HN)/PR8病毒不能在鸡体内复制。本研究为H7N9疫苗株的构建奠定了重要基础。

H7亚型流感病毒通用及区分强弱毒RT-PCR方法的建立

为建立可以区分H7亚型流感病毒强弱毒的方法,根椐Genbank和GISAID中H7病毒的HA基因序列,设计2条特异性引物,建立了扩增H7病毒HA裂解位点区域的通用RT-PCR方法。在此基础上,在裂解位点处设计1条引物,建立了可以区分H7强弱毒的RT-PCR方法。该方法对弱毒株可以扩增出约337 bp的片段,对强毒株可以扩增出约349 bp和227 bp的片段,对其他常见亚型流感病毒的RT-PCR扩增均为阴性。敏感性试验结果表明,该RT-PCR方法的检测下限为1 fg的H7N9病毒模板。该方法对10份实验室已鉴定好的H7N9病毒进行对比验证,两者的符合率为100%。试验结果表明,该方法具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7亚型流感病毒的快速检测,同时还可区分强弱毒,对H7N9病毒,尤其是高致病性病毒的早期诊断和有效防控可提供有效技术支撑。

成都市2021年秋季重组禽流感(H5+H7) 三价灭活苗免疫抗体水平的监测与分析

为监测成都市重组禽流感(H5+H7)三价灭活苗(H5N2 rSD57株+rFJ56株,H7N9 rLN79株)的免疫抗体水平,从成都市15个区(市)县的部分规模化养殖场、散养户中采集禽血清样本1320份,利用血凝和血凝抑制(HA-HI)试验监测H5和H7亚型禽流感的免疫抗体水平。结果得出:2021年秋季成都地区15个区(市)县禽流感的免疫抗体合格率为93.9%~99.8%;规模场H5亚型禽流感(rFJ56株、rSD57株)、H7亚型禽流感(rLN79株)的免疫抗体合格率分别为93.6%(674/720)、99.0%(713/720)、99.7%(718/720),散养户免疫抗体合格率分别为94.3%(566/600)、98.2%(589/600)、100.0%(600/600),各区(市)县之间免疫抗体合格率差异较小。本研究结果表明,重组禽流感(H5+H7)三价灭活苗能够使禽群产生有效的抗体水平,该结果为做好H5、H7亚型高致病性禽流感的预防与控制工作提供了参考。

贵州省首例人感染高致病性禽流感H7N9突变株血凝素分子特征与溯源分析

目的了解贵州省人感染H7N9禽流感病毒血凝素（hemagglutinin, HA）基因的分子特征、溯源和疾病风险，为高致病性禽流感H7N9病毒的预防和控制提供依据。方法采用实时PCR对5株高致病性禽流感H7N9毒株标本（1株人感染鼻咽拭子标本，4株活禽市场环境标本）进行核酸的提取、HA基因的扩增和测序，运用生物信息学软件对H7N9禽流感病毒HA基因的同源性、遗传进化、受体结合关键位点、致病相关位点和糖基化位点变异情况进行分析。结果贵州省威宁县人感染H7N9禽流感病毒HA基因与当地活禽市场环境中H7N9禽流感病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为99.8%和99.6%，而4株活禽市场环境中的H7N9禽流感病毒核苷酸和氨基酸同源性分别为100.0%和100.0%。与2017年广西人感染的A/Guangxi/5/2017毒株同源性最高，分别为99.7%～99.9%和99.4%～99.8%；与2016年底广东环境中分离的毒株A/Environment/Guangdong/ C16283222/2016同源性为99.0%～99.2%和98.9%～99.2%，而与WHO推荐的A/Shanghai/2/2013和A/Anhui/1/2013候选疫苗株的同源性为96.8%～97.0%和95.8%～96.2%。与广西毒株A/Guangxi/5/2017遗传进化距离最近。5株毒株HA蛋白裂解位点突变为PEVPKRKRTAR↓GLF，为高致病性禽流感突变株；受体结合关键位点均发生了G186V的突变，均未发生Q226L突变，5株毒株均发生的新突变为A363S，仅感染人的毒株发生的突变是R56K和I297V；5个潜在糖基化位点中仅421NWT和493NNT发生位置后移的变异。结论贵州省威宁县5株H7N9禽流感病毒均为高致病性禽流感突变株，候选疫苗株匹配保护效果可能已经降低，HA蛋白裂解位点、G186V和新的突变位点的变异可能增强了H7N9禽流感病毒对人体的易感性和致病性。

高致病性H7N9禽流感病毒神经氨酸酶R292K、E119V突变型耐药株感染MDCK细胞转录组学研究

人感染高致病性H7N9禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza H7N9,HPAI H7N9)神经氨酸酶抑制剂(Neuraminidase inhibitors,NAIs)耐药株在哺乳动物细胞中适应性较好,是其导致病死率高的原因之一。本文研究HPAI H7N9耐药株对流感病毒敏感细胞MDCK细胞转录的影响。用0.1 MOI含NAIs耐药突变位点(NA R292K,E119V)的HPAI H7N9重组病毒及其敏感株感染MDCK细胞,于感染后0h、7h和24h取样,进行RNA测序并分析。结果三株病毒感染细胞0h和7h时,各组差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)较少。24h时敏感株、R292K株和E119V株感染后的DEGs均显著增加,数量相似,分别为10508、10663和10711,其中三者共同DEGs为83%~85%,每组特有DEGs为3%~8%。3株病毒感染细胞24 h时DEGs涉及的KEGG通路分类及各通路下基因个数及所占比例均较相似,且3者前20条KEGG通路中多数(11条)通路相同。结果说明,含R292K或E119V耐药突变位点的HPAI H7N9病毒与其敏感株相似地能在MDCK细胞中引起较强烈的转录改变并影响细胞代谢及免疫通路。

H7N9甲型流感病毒Vero细胞高产疫苗候选株的构建

目的构建1株基于Vero细胞高产的H7N9亚型流感病毒疫苗候选株，为应对人感染H7N9病毒提供细胞介质的疫苗候选株。方法利用流感病毒反向遗传学技术，将H7N9亚型流行株的HA和NA基因与高产疫苗骨架株PR8-4mut的6条编码病毒内部蛋白的基因，通过6：2重组法拯救出4mut-H7N9病毒。通过病毒学方法检测病毒在Vero细胞上的生长性状和病毒蛋白产量。结果4rout-H7N9病毒在Vero细胞上生产速度更快，可收获更多的病毒蛋白。同时，4mut-H7N9病毒没有改变胰酶依赖性，并保持在小鼠中的低致病性，保证了该高产疫苗候选株的安全性。结论通过6：2重组法，以反向遗传学技术构建的4mut-H7N9疫苗候选株能够极大地提高病毒在Vero细胞中的增殖速度，可作为以Vero细胞为生产介质的H7N9高产疫苗备选株。

我国从人感染病例中发现H7N9病毒变异株

2017年1月,广东省疾病预防控制中心对2例人感染H7N9病例分离到的病毒分别进行了基因测序分析,发现在该2株病毒的血凝素链接肽位置发生了基因插入性突变,检测结果已经中国CDC病毒病所国家流感中心复核确认。经组织专家研判，并与农业部门相关专家沟通后认为，H7N9病毒在血凝素链接肽位置发生的基因插入性突变，提示该病毒突变为对禽高致病性的病毒；根据病毒序列分析结果，尚未出现该变异病毒发生对人感染力、毒力和人际传播能力增强的突变。

2017年淮南市外环境H7N9病毒HA和NA基因特征分析

目的分析淮南市2017年外环境标本中H7N9禽流感病毒血凝素基因(hemagglutinin,HA)及神经氨酸酶基因(neuraminidase,NA)的基因特征。方法采集活禽市场禽类咽拭子、肛拭子、粪便、笼具、台面或砧板、脱毛机、禽类饮水、污水等标本,进行禽流感病毒Real-time PCR分型检测,选取H7N9核酸阳性标本(CT值≤28),对其HA和NA基因进行特异性扩增,并对扩增产物进行基因序列测定。采用Bioedit5.0.9、DNASTAR7.1软件对测序结果拼接,并选取国内外H7N9参考序列使用Mega 6.06软件构建HA和NA基因遗传进化树。结果淮南市外环境3株H7N9禽流感毒株HA基因其核苷酸同源性为98.7%~100.0%,氨基酸序列同源性为99.3%~100.0%,基因进化分析显示,该3株H7N9禽流感毒株与安徽、江苏、浙江分离毒株亲缘性较近,处于长三角分支内,与2017年安徽株A/Anhui/13449/2017/H7N9(EPI258029)核苷酸同源性为98.7%~99.9%,氨基酸同源性为99.3%~100.0%,HA发生G186V、Q226L突变;NA基因核苷酸同源性为98.3%~100.0%,氨基酸同源性为99.5%~100.0%;基因进化分析显示,淮南株HN-3、HN-4与2017年安徽分离株A/Anhui/13449/2017/H7N9(EPI 258029)亲缘性最近,核苷酸同源性为98.7%~99.7%,氨基酸同源性为99.5%~100.0%,NA蛋白R294K耐药位点无变异,NA茎区69~73位缺失了"QISNT"序列。结论淮南市活禽市场外环境H7N9病毒HA基因和NA基因与人感染H7N9安徽株(EPI 258029)A/Anhui/13449/2017/H7N9高度同源,处于同一进化分支,有共同的进化来源;HA受体结合位点氨基酸发生G186V、Q226L变异,NA茎区69~73位缺失"QISNT"序列均加强了病毒感染人类的能力。

H7N9亚型禽流感疫苗将投入使用 首批6月底运抵广东等地

据农业部网站消息,为有效防控H7N9亚型禽流感,农业部积极推进科技攻关,组织国家禽流感参考实验室开展H7N9禽流感疫苗研究。国家禽流感参考实验室采用反向遗传技术,构建出安全高效的H7N9灭活疫苗生产种毒,经严格评价,新的疫苗毒株对禽类和哺乳动物均无致病力。