羊痘病毒宿主范围基因063缺失表达载体的构建

为研究羊痘病毒宿主范围基因(Hrg)063的特性及生物学功能,采用overlap PCR技术将绿色荧光蛋白(GFP)基因与063基因两侧的同源臂连接起来,把扩增的目的基因插入到PEASY-T1克隆载体中,构建以GFP基因为报告基因的063基因缺失表达载体,并测序鉴定;用脂质体Lipofectamine 2000转染表达载体到羊痘病毒感染的羊睾丸原代细胞中,挑取荧光显微镜下表达为绿色荧光的063基因缺失的羊痘重组病毒,并传代纯化。成功的构建了Hrg 063缺失的表达载体(PEASY-Δ063-GFP),测序结果表明063基因的上下游同源臂与GFP报告基因大小约900 bp,与理论相符。转染后表达载体与羊痘病毒重组,得到了063基因缺失的山羊病毒SS株、TS株和疫苗株3个毒株重组病毒,但纯化时重组病毒不能正常传代。该研究中063基因缺失表达载体的构建为其生物学特性及功能的研究奠定了基础。

羊痘病毒063载体构建及蛋白纯化

为研究羊痘病毒宿主范围因子063基因的特征及其生物学功能,采用PCR方法扩增063基因,通过双酶切和基因同源重组的方法与PGEX-KG载体连接构建成融合表达GST标签的原核表达载体,经酶切和测序鉴定正确的克隆转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达063蛋白,产物经SDS-PAGE电泳检测和Western Blot鉴定,大量诱导表达063蛋白,通过谷胱苷肽琼脂糖亲合层析法,得到063纯化蛋白。