山羊痘病毒ORF103蛋白的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

将山羊痘病毒ORF103蛋白基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)中进行重组ORF103蛋白的诱导表达,对表达产物进行纯化,并进行Western-blot鉴定;用纯化后的重组ORF103蛋白作为包被抗原,优化反应条件,建立血清间接ELISA检测方法,并进行特异性、灵敏性和重复性试验,最后对临床样品进行检测。结果,原核表达获得了大小约为35 ku的重组ORF103蛋白;Western-blot结果表明,此重组蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。山羊痘病毒间接ELISA的优化反应条件为:抗原包被量每孔500 ng,血清以1∶200稀释后作用1 h,酶标二抗以1∶5 000稀释后作用1 h,TMB显色时间为10 min。在该优化条件下,D_(450)≥0.362为阳性,反之为阴性;特异性试验表明,对小反刍兽疫病毒、口疮病毒、马耳他布氏杆菌和产气荚膜梭菌阳性血清的检测结果均为阴性;对60份山羊痘病毒阳性血清进行检测,敏感性为96.6%;重复性试验表明,批内和批间D_(450)值的变异系数分别在1.81%~3.20%和1.34%~7.38%之间;用本研究建立的方法对临床上162份血清进行检测,阳性率为70.4%。上述结果表明,本研究建立的ELISA可用于山羊痘病毒抗体水平的检测。