p53半剂量缺失纠正1,25(OH)_(2)D_(3)缺乏小鼠的骨质疏松

目的:探索p53半剂量缺失杂合子小鼠能否通过增强抗氧化能力纠正活性维生素D(1,25(OH)_(2)D_(3))缺乏引起的骨质疏松。方法:取10周龄高钙高磷饮食喂养的同窝野生型(wild type,WT)小鼠、p53半剂量缺失杂合子(p53^(+/-))小鼠、1α-羟化酶基因敲除[1α(OH)ase^(-/-)]小鼠及p53半剂量缺失的1α羟化酶基因敲除[1α(OH)ase^(-/-)p53^(+/-)]小鼠的长骨,利用X线、micro-CT、组织病理学和分子生物学等方法,比较各组小鼠血清学、长骨骨矿化、骨形成、骨吸收以及氧化应激等表达变化。结果:与WT小鼠相比,p53^(+/-)小鼠血清钙、磷、甲状旁腺素(parathyroid hormone,PTH)和1,25(OH)_(2)D_(3)水平差异无统计学意义,骨密度、总胶原(total collagen,T-col)阳性面积、成骨细胞数量、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ,Col-Ⅰ)阳性面积均有所增加,活性氧水平降低,抗氧化酶SOD1表达增加。与1α(OH)ase^(-/-)小鼠相比,1α(OH)ase^(-/-)p53^(+/-)小鼠血清钙、磷和PTH差异无统计学意义,血清中检测不到1,25(OH)_(2)D_(3),骨密度、T-col阳性面积、成骨细胞数量、ALP和Col-Ⅰ阳性面积均明显增加,破骨细胞数量减少,活性氧水平降低,抗氧化酶SOD1表达增加。结论:p53半剂量缺失可通过增强抗氧化能力纠正1,25(OH)_(2)D_(3)缺乏小鼠的骨质疏松。

1,25(OH)_(2)D_(3)及VDR敲除对山羊附睾头上皮细胞β防御素家族表达的影响

旨在研究1,25(OH)_(2)D_(3)是否通过VDR途径调节山羊附睾头上皮细胞β防御素基因表达。本试验选取3只6月龄太行黑山羊,分别采集附睾头组织。采用差速贴壁法分离山羊附睾头上皮细胞,用细胞免疫荧光鉴定上皮细胞纯度。添加100 nmol·L^(-1)1,25(OH)_(2)D_(3)处理附睾头上皮细胞以及筛选出敲除效率最高的pCas9/gRNA1质粒载体进行细胞转染,同时设置阴性对照组和空白对照组,每组3个重复孔。附睾头上皮细胞经1,25(OH)_(2)D_(3)处理以及VDR基因敲除后,分别用qRT-PCR检测VDR和17种β防御素基因的表达,用Western blot检测VDR蛋白和3种β防御素蛋白的表达。结果表明,1,25(OH)_(2)D_(3)能极显著提高VDR、gBD124、gBD126和gBD104a的mRNA和蛋白表达(P<0.01),同时极显著提高gBD104、gBD 109tr1、gBD 109tr2、gBD113、gBD116、gBD120、gBD 121以及gBD 123基因的表达(P<0.01),显著提高gBD106、gBD127、gBD 129以及gBD 134基因的表达(P<0.05),而对gBD 110like和gBD 128基因没有显著影响(P>0.05);3个基因敲除载体进行细胞转染后,pCas9-VDR-V1组VDR蛋白表达极显著降低(P<0.01)。VDR基因敲除极显著降低gBD124的mRNA和蛋白表达(P<0.01),显著降低gBD126和gBD104a的mRNA和蛋白表达(P<0.05),同时VDR基因敲除组gBD 109tr1、gBD 109tr2、gBD116、gBD123、gBD127、gBD 128以及gBD 134基因的表达极显著低于其他组(P<0.01),VDR基因敲除组gBD104、gBD106、gBD 120以及gBD 129基因的表达显著低于其他组(P<0.05),而对gBD121、gBD 110like以及gBD 113的相对表达则无显著影响(P>0.05)。综上所述,1,25(OH)_(2)D_(3)可以上调VDR和部分β防御素表达;VDR基因敲除后降低部分β防御素表达,结果表明1,25(OH)_(2)D_(3)通过上调VD/VDR信号通路关键基因VDR的表达调控山羊附睾头上皮细胞部分β防御素表达。

1,25(OH)_(2)VD_(3)对血管紧张素Ⅱ诱导的足细胞内质网应激的抑制作用

目的探讨1,25(OH)_(2)VD_(3)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的足细胞内质网应激的影响,为临床上应用骨化三醇治疗足细胞损伤产生的蛋白尿提供理论依据。方法体外培养小鼠足细胞系(MPC5),随机分为对照组、AngⅡ组(10^(-6)mol/L的AngⅡ)、1,25(OH)_(2)VD_(3)组[10^(-6)mmol/L的AngⅡ+10^(-8)mol/L的1,25(OH)_(2)VD_(3)]。各组均在给药处理6、12、18、24 h后收集细胞,分别应用实时定量PCR、免疫荧光技术检测不同时间点各组样本中葡萄糖调节蛋白(GRP78)及蛋白激酶样内质网激酶(PERK)的mRNA表达量和蛋白表达情况。结果与对照组比较,AngⅡ组GRP78、PERK mRNA表达量在各个时间点均显著增加(P<0.01)。与AngⅡ组比较,1,25(OH)_(2)VD_(3)组GRP78、PERK mRNA表达量在各个时间点均显著降低(P<0.01或<0.05),相应的GRP78、PERK蛋白表达均较低。AngⅡ组给药处理12 h后GRP78、PERK mRNA表达量较6 h mRNA表达量均显著增加(P<0.01);AngⅡ组给药处理18 h后GRP78、PERK mRNA表达量较12 h mRNA表达量均显著增加(P<0.01,P<0.05)。结论AngⅡ可以诱导足细胞发生内质网应激,其发生强度与药物作用时间有关,而1,25(OH)_(2)VD_(3)能通过抑制AngⅡ诱导的足细胞内质网应激,起到保护足细胞的作用。

1,25(OH)_(2)D_(3)通过调节Th17/Treg比值和RANKL/OPG轴缓解胶原诱导的关节炎

目的 探讨1,25-二羟基维生素D_(3)[1,25-dihydroxy vitamin D3,1,25(OH)_(2)D_(3)]对胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型小鼠关节滑膜炎症和骨破坏的抑制作用及机制。方法 30只DBA/1J小鼠被均分为3组:对照组(CON)、模型组(CIA)和模型干预组(VD)。CIA组和VD组小鼠建立CIA模型,用1,25(OH)_(2)D_(3)对VD组CIA模型进行治疗。用游标卡尺测量小鼠后足爪的肿胀程度。用Micro-CT测量小鼠后足爪的骨密度。酶联免疫吸附剂测定法检测小鼠血清1,25(OH)_(2)D_(3)和炎症细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)的水平。流式细胞术检测小鼠脾脏Th17细胞和Treg细胞的比例。采用苏木精-伊红染色观察膝关节的病理特征。Western blot检测小鼠踝关节的蛋白OPG、RANKL、NF-κB和VDR的表达水平。结果 1,25(OH)_(2)D_(3)并没有降低CIA模型的发病率,但却明显缓解了关节炎症。VD组的脚掌厚度、关节炎评分以及膝关节HSS评分均较CIA组明显降低(P均<0.05)。CIA组的骨破坏程度更加明显,BMD及BV/TV明显低于VD组(P均<0.05)。VD组的IL-1β、IL-6、TNF-α水平和Th17/Treg细胞比例明显低于CIA组(P均<0.05)。与CIA组相比,VD组踝关节的VDR和OPG蛋白水平明显增加(P均<0.05),NF-κB和RANKL蛋白水平明显低于CIA组(P均<0.05),RANKL/OPG的比例也明显低于CIA组(P<0.05)。结论 1,25(OH)_(2)D_(3)可能通过调节Th17/Treg比值和RANKL/OPG轴缓解CIA模型小鼠的关节滑膜炎症并抑制骨破坏。

1,25(OH)_(2)D_(3)对miR-130b转染的高糖条件下HMC细胞TGF-β1/Smad3及Col-Ⅳ表达的影响

目的观察高糖环境下1,25(OH)_(2)D_(3)对miR-130b转染肾小球系膜细胞TGF-β1/Smad3、Col-IV表达水平的变化,探索1,25(OH)_(2)D_(3)是否可通过miR-130b改善糖尿病肾病肾脏纤维化的过程。方法HMC细胞传代培养,miR-130b mimics及miR-130b inhibitor经LipofectamineTM 2000转染肾小球系膜细胞,依据分组加入1,25(OH)_(2)D_(3)1.0×10^(-8) mol/L,37℃、5%CO_(2)饱和湿度条件下继续培养48 h,共分为6组:①空白对照组;②细胞+无水乙醇组(A组);③细胞+miR-130b mimics+无水乙醇组(B组);④细胞+miR-130b mimics+1,25(OH)_(2)D_(3)组(C组);⑤细胞+miR-130b inhibitor+无水乙醇组(D组);⑥细胞+miR-130b inhibitor+1,25(OH)_(2)D_(3)组(E组)。以实时荧光定量PCR检测细胞miR-130b及TGF-β1、Smad3、Col-IVmRNA的表达水平,以Western blot方法检测细胞TGF-β1、Smad3、Col-IV蛋白的表达水平。采用多组间比较的单因素方差分析及组内两两比较采用LSD、Dunnett s T3法比较各组数据。结果空白对照组与A组细胞miR-130b、TGF-β1、Smad3、Col-IV表达水平,差异无统计学意义(P>0.05),与A组相比,B组miR-130b、TGF-β1、Smad3、Col-IV表达水平明显升高(P<0.05),D组miR-130b、TGF-β1、Smad3、Col-IV表达水平明显降低(P<0.05)。经1,25(OH)_(2)D_(3)治疗发现,与B组相比,C组miR-130b、TGF-β1、Smad3、Col-IV表达水平明显降低(P<0.05),与D组相比,E组miR-130b、TGF-β1、Smad3、Col-IV表达水平明显降低(P<0.05)。结论1,25(OH)_(2)D_(3)可降低miR-130b转染肾小球系膜细胞miR-130b及纤维化相关因子TGF-β1、Smad3、Col-IV的表达水平,1,25(OH)_(2)D_(3)可能通过miR-130b改善糖尿病肾病肾脏纤维化的过程。

1,25-(OH)_(2)D_(3)通过lncRNA-uc.412抑制TGF-β1诱导的系膜细胞增殖的机制研究

目的:研究1,25二羟基维生素D 3[1,25-(OH)_(2)D_(3)]通过长链非编码RNA uc.412(lncRNA-uc.412)抑制转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠系膜细胞增殖的可能机制。方法:用TGF-β1、1,25-(OH)_(2)D_(3)、SIS3分别干预系膜细胞,用lncRNA-uc.412过表达慢病毒转染系膜细胞,MTT法、流式细胞术检测系膜细胞增殖率,RT-PCR法检测ki67、p27、PCNA及lncRNA-uc.412的表达,Western blot检测smad3及p-smad3的表达。结果:①与TGF-β1组相比,1,25-(OH)_(2)D_(3)+TGF-β1干预后的ki67、PCNA、lncRNA-uc.412的表达下调,p27的表达上调(P<0.01),细胞增殖率下降(P<0.01);②TGF-β1+SIS3组p-smad3蛋白表达、lncRNA-uc.412的表达量较TGF-β1组下降(P<0.01);③与过表达lncRNA-uc.412组比较,过表达lncRNA-uc.412+1,25-(OH)_(2)D_(3)组的ki67、PCNA的表达下调,p27的表达上调(P<0.01)。结论:1,25-(OH)_(2)D_(3)可抑制TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞增殖,其机制可能与1,25-(OH)_(2)D_(3)阻滞细胞周期及下调lncRNA-uc.412的表达水平有关。

1,25(OH)_(2)D_(3)对实验性自身免疫性神经炎大鼠肠道菌群的影响

目的:16S rDNA高通量测序观察1,25(OH)_(2)D_(3)对实验性自身免疫性神经炎肠道菌群的影响。方法:采用人工合成P0180-199肽段与完全弗氏佐剂混合免疫Lewis大鼠建立EAN模型,1,25(OH)_(2)D_(3)末次灌胃后无菌收集粪便,采用Illumina Miseq PE300型高通量测序仪检测肠道菌群16S rDNA V3-V4可变区,分析肠道菌群结构和丰度变化。结果:1,25(OH)2D3干预可调节EAN大鼠肠道菌群Alpha、Beta多样性,提高菌群丰度、多样性指数。EAN大鼠粪便Verrucomicrobiaceae、Enterobacteriaceae显著增加,Lachnospiraceae、Ruminococcaceae显著减少,均在1,25(OH)_(2)D_(3)干预后回调。结论:1,25(OH)_(2)D_(3)对EAN大鼠肠道菌群有调节作用,肠道微生态的变化可能用于解释EAN的发病机制。

1,25-(OH)_(2)D_(3)干预糖尿病大鼠模型对P38MAPK与TGF-β1的影响及肾保护作用研究

目的研究1,25-二羟维生素D3[1,25-(OH)_(2)D_(3)]干预糖尿病大鼠模型对P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)与转化生长因子β1(TGF-β1)的影响。方法选用雄性大鼠作为实验动物,采用随机数字表法将大鼠分为A、B、C 3组,每组各28只。A组给予常规饲料喂养,B、C组给予高脂高胆固醇饲料喂养6周,糖尿病大鼠模型建模成功后,A组继续常规饲料喂养,B、C组继续给予高脂高胆固醇喂养,同时B组给予1,25-(OH)_(2)D_(3)干预,共7次。处死大鼠,分别在喂养开始时(T1)、建模成功时(T2)及1,25-(OH)_(2)D_(3)干预完成后2周时(T3)取血,检测血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)、血尿素氮(BUN)和胱抑素C(Cys-C)肾功能指标水平,计算内生肌酐清除率(Ccr)。处死大鼠后取肾组织,采用免疫组化法和Western blot法检测P38MAPK与TGF-β1表达情况。分析P38MAPK与TGF-β1的关系。结果 3组大鼠T2和T3时Ccr、BUN及Cys-C水平比较有统计学意义(P<0.05),其中T2时B、C 2组Ccr、BUN及Cys-C水平显著高于A组(P<0.05),T3时B组Ccr、BUN及Cys-C显著低于C组(P<0.05)。3组大鼠肾组织P38MAPK与TGF-β1表达差异具有统计学意义(P<0.05)。3组大鼠肾组织P38MAPK与TGF-β1蛋白相对表达量差异有统计学意义(P<0.05),B组大鼠P38MAPK与TGF-β1显著低于C组(P<0.05)。3组大鼠肾组织P38MAPK与TGF-β1蛋白相对表达量呈显著正相关性(r=0.418,P<0.05)。结论 1,25-(OH)_(2)D_(3)干预能显著改善糖尿病大鼠肾功能,这可能与其抑制P38MAPK与TGF-β1表达有关。

1,25-(OH)_2D_3通过调节miR-146a表达抑制大鼠肝纤维化发生发展机制的研究

目的本研究旨在探讨1,25(OH)_2D_3是否能通过调节肝脏内miR-146a的表达阻碍肝纤维化的进展。方法将SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、药物对照组、药物治疗组,采用皮下肌注CCl_4方式建立肝纤维化模型,药物治疗组同时给予同剂量的CCl4皮下肌注及3 mL/kg的1,25(OH)_2D_3灌胃,药物对照组给予同剂量的CCl_4皮下肌注及3 mL/kg的橄榄油灌胃。于第8周处死大鼠,采用心脏取血法行肝纤维化四项的检测,留取肝脏相同部位行石蜡切片HE染色,qreal-time PCR法检测比较各组肝组织内miR-146a的表达差异。结果与正常对照组相比,模型组SD大鼠肝纤维化程度明显增加,即肝纤维化四项中ColⅣ、PⅢNP、HA、LN明显上升(P<0.05),病理切片示模型组肝组织周围血管炎症细胞浸润,肝组织中可见大量的脂滴空泡,而药物治疗组两者程度均有明显减轻。结论 1,25(OH)_2D_3可明显减轻肝损伤,可能通过调节肝组织内miR-146a的表达量从而达到改善肝功能、阻碍肝纤维化发生发展的目的。

1,25(OH)2VD3在过敏原特异性免疫治疗花粉过敏哮喘中的应用

以1,25(OH)_2VD_3为佐剂制备软叶针葵花粉变应原疫苗,以小鼠致敏哮喘模型为研究对象进行特异性免疫治疗.通过检测小鼠气道高反应性、血清中特异性抗体、细胞因子以及肺组织病理学切片等指标对治疗模型的构建进行评价,探讨1,25(OH)_2VD_3在过敏原特异性免疫治疗花粉过敏哮喘免疫机制中的作用.结果表明:以1,25(OH)_2VD_3为变应原疫苗能有效抑制花粉特异性Ig E的产生和Th2细胞因子IL-4分泌,促进封闭性抗体Ig G2a产生和Th1细胞因子IFN-γ的分泌,增加耐受性细胞因子IL-10生产,使Th2反应向Th1反应转变.1,25(OH)_2VD_3在花粉过敏性哮喘治疗中能大幅提高过敏原特异性免疫治疗的疗效.

1,25(OH)_2VD_3诱导小鼠胚胎干细胞向成骨细胞分化的研究

目的探讨1,25(OH)2VD3在诱导小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)向成骨细胞分化过程中的重要作用。方法取2d龄昆明小白鼠颅盖骨进行成骨细胞分离培养;参照并改进zur Nieden等的方法制备拟胚体(embryoid bodies,EBs)。将EBs根据培养液不同分为4组:A组:不含白血病抑制因子EBs培养液;B组:EBs培养液中添加50μg/mL维生素C、50mmol/Lβ-磷酸甘油;C组:培养液同B组,另每孔接种5×104个第3代成骨细胞;D组与C组相同,另添加4×10-9mol/L1,25(OH)2VD3。检测ALP活性,实时定量PCR检测骨钙素mRNA的表达,茜素红S染色进行矿化骨结节计数。结果EBs贴壁后前5d,各组ALP表达未发生明显变化,5d后ALP表达逐渐增加,其中D组在第20天表达水平最高。光镜下可见轮廓清晰大小不等的红色结节。茜素红S染色测得A、B、C、D组骨结节数分别为(20±8)、(18±5)、(31±1)、(50±1)个;实时定量PCR测得A、B、C、D组骨钙素mRNA分别为10.18±1.17、20.29±1.03、18.84±4.07、32.15±5.23;C、D组与A、B组比较差异均有统计学意义(P<0.05),A、B组间比较差异无统计学意义(P>0.05),C、D组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论在浓度为4×10-9mol/L1,25(OH)2VD3和维生素C、β-磷酸甘油共同作用下,有效促进了ESCs源性成骨细胞的产生。

1，25-(OH)_2D_3对体外培养围产期奶牛外周血淋巴细胞转化率及γ-干扰素(IFN-γ)的影响

体外培养围产期奶牛外周血淋巴细胞,分别添加0、0.01、0.1、1、10和100nM的1,25(OH)_2D_3,研究1,25-(OH)_2D_3对奶牛外周血淋巴细胞免疫功能的影响。结果表明,1,25-(OH)_2D_3对淋巴细胞转化率没有影响,但可以通过抑制IFN-γ的分泌影响奶牛的细胞免疫功能。添加0.01～100nM的1,25-(OH)_2D_3对淋巴细胞的转化率没有显著影响,但剂量依赖性抑制了ConA和PWM诱导的淋巴细胞IFN-γ的产量。当1,25(OH)_2D_3浓度达到0.1nM、1nM时与对照组相比分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)抑制ConA诱导的淋巴细胞IFN-γ的产量。以PWM激活的细胞在培养48h、72h,1,25-(OH)_2D_3添加量在0.1～100nM范围均极显著抑制IFN-γ的产生(P<0.01)。添加0.01nM 1,25(OH)_2D_3对IFN-γ的抑制作用相对较小(P>0.05),在培养48h后并未表现出显著的抑制作用,但培养72h后也极显著的抑制了IFN-γ的产生(P<0.01)。

1,25(OH)_(2)D_(3)联合NF-κB p65 siRNA保护肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤

目的:探讨1,25(OH)_(2)D_(3)与核转录因子-κB(NF-κB)p65 siRNA单独或联合作用对肺炎链球菌(SP)感染的肺泡上皮细胞增殖、凋亡的影响。方法:分别使用1,25(OH)_(2)D_(3)、NF-κB p65 siRNA及二者联合处理SP感染的肺泡上皮细胞A549,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测NF-κB p65 mRNA表达,Western blot检测NF-κB p65、Bcl2相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病2(Bcl2)、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB p-p65蛋白表达,MTT比色法和流式细胞术分别检测细胞活力与凋亡。结果:SP明显促进A549细胞中NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达、细胞凋亡率、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB p-p65表达(P<0.05),显著抑制相对细胞活力、Bcl2表达(P<0.05)。1,25(OH)_(2)D_(3)、NF-κB p65 siRNA以及1,25(OH)_(2)D_(3)联合NF-κB p65 siRNA处理均明显抑制SP感染的A549细胞中NF-κB p65 mRNA、NF-κB p65蛋白表达、细胞凋亡、Bax、IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-κB p-p65表达(P<0.05),提高细胞活力、Bcl2表达(P<0.05),并且1,25(OH)_(2)D_(3)联合NF-κB p65 siRNA对SP损伤A549细胞增殖、抑制细胞凋亡的作用更强。结论:1,25(OH)_(2)D_(3)联合NF-κB p65 siRNA对SP感染的肺泡上皮细胞损伤具有保护作用,且效果优于1,25(OH)_(2)D_(3)或NF-κB p65 siRNA单独作用,机制可能与调控炎症因子、NF-κB信号通路有关。

1,25(OH)_(2)D_(3)以双向方式影响猪前体脂肪细胞增殖分化的研究

1,25(OH)_(2)D_(3)是维生素D的主要活性形式,影响人和动物脂肪形成,为探究其在猪脂肪细胞增殖分化中的作用,试验从3~5日龄仔猪皮下脂肪组织分离培养前体脂肪细胞,并以浓度为0、0.1、1、10、100和1000 nmol/L的1,25(OH)_(2)D_(3)分别处理,在培养的0、1、2、4、6、8和10 d采用MTT比色法检测细胞增殖活性;在诱导分化后0、1、2、4、6、8和10 d,以油红O染色提取法和实时荧光定量PCR检测细胞成脂分化及分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸合成酶(FAS)表达。结果显示,0.1和1 nmol/L 1,25(OH)_(2)D_(3)显著促进猪前体脂肪细胞增殖(P<0.05),而浓度为10~100 nmol/L时则抑制细胞增殖(P<0.05);0.1和1 nmol/L 1,25(OH)_(2)D_(3)显著抑制猪前体脂肪细胞分化(P<0.05),降低PPARγ和FAS mRNA表达水平(P<0.05),但在浓度为10和100 nmol/L时,显著促进猪前体脂肪细胞分化(P<0.05),上调PPARγ和FAS mRNA表达(P<0.05);浓度达1000 nmol/L时,可能对细胞有毒性作用。综合以上结果,低浓度1,25(OH)_(2)D_(3)促进猪前体脂肪细胞增殖,而通过下调PPARγ表达抑制分化;高浓度1,25(OH)_(2)D_(3)抑制猪前体脂肪细胞增殖,通过上调PPARγ表达促进分化。1,25(OH)_(2)D_(3)对猪前体脂肪细胞增殖和分化具有双向作用。

1,25(OH)_(2)D_(3)调控ERK通路对食管鳞状细胞癌细胞生物学行为的影响

目的:探讨1,25-二羟维生素D3[1,25(OH)_(2)D_(3)]对食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)细胞增殖、迁移和细胞周期的影响及其相关机制。方法:用不同浓度1,25(OH)_(2)D_(3)处理ESCC细胞TE-11、KYSE30、TE-1和KYSE510后,用CCK-8法检测细胞的增殖能力。再用浓度分别是0、0.1、0.15、0.2μmol/L的1,25(OH)_(2)D_(3)处理TE-11和KYSE30细胞,划痕愈合实验、流式细胞术分别检测细胞的迁移能力和细胞周期分布情况,WB法检测细胞中cyclin D1、P27、ERK和p-ERK蛋白的表达水平。结果:1,25(OH)_(2)D_(3)显著抑制TE-11和KYSE30细胞的增殖能力,其抑制程度呈时间依赖性和浓度依赖性。0.1和0.2μmol/L的1,25(OH)_(2)D_(3)处理48 h后,与空白对照组比较,TE-11和KYSE30细胞的迁移能力均显著降低(P<0.05或P<0.01),处于G0/G1期细胞显著增加(P<0.05或P<0.01),细胞中cyclin D1和p-ERK蛋白水平显著下调、P27蛋白水平明显上调(P<0.05或P<0.01)而ERK蛋白的表达无明显变化。结论:1,25(OH)_(2)D_(3)显著抑制ESCC细胞的增殖和迁移能力并阻滞细胞周期进程,其可能通过调控ERK信号通路而发挥作用。

慢性肾衰竭血液透析患者血清1,25(OH)_(2)D_(3)水平变化及与甲旁亢的相关性

目的探究慢性肾衰竭血液透析患者血清1,25(OH)_(2)D_(3)水平变化及与甲状旁腺功能亢进(简称“甲旁亢”,HPT)的相关性。方法回顾性分析2018年3月至2019年6月我院收治80例慢性肾衰竭患者的临床资料,其中40例接受血液透析治疗,余40例接受常规治疗,分别为血透组、对照组,治疗3个月后比较两组血清1,25-二羟维生素D[1,25(OH)_(2)D_(3)]、甲状旁腺激素(PTH)水平及随访1年内HPT发生率,并选择Pearson法分析HPT与血清1,25(OH)_(2)D_(3)、PTH水平的相关性。结果治疗后,血透组患血清1,25(OH)_(2)D_(3)、PTH水平明显低于对照组(P<0.05),HPT发生率明显高于对照组(P<0.05);血液透析治疗患者中,发生HPT者的血清1,25(OH)_(2)D_(3)水平低于无HPT者,而PTH水平高于无HPT者(P<0.05);Pearson相关性分析显示,血液透析治疗慢性肾衰竭患者HPT与PTH水平呈正相关,与血清1,25(OH)_(2)D_(3)水平呈负相关(P<0.05)。结论血液透析治疗慢性肾衰竭患者可导致血清1,25(OH)_(2)D_(3)、PTH水平降低,且增加HPT发生风险,HPT与血清1,25(OH)_(2)D_(3)水平密切相关。

1,25(OH)_2VD_3对Zucker糖尿病肥胖大鼠肝线粒体损伤的保护作用

目的探讨1,25(OH)_2VD_3对Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty,ZDF)大鼠肝线粒体损伤的保护作用及相关机制。方法雄性5～6周龄Zucker瘦型(Zucker lean,ZL)大鼠(对照鼠)及ZDF大鼠(模型鼠)按照体重随机分为3组,即对照组(ZL)、模型组(ZDF)及维生素D(vitamin D,VD)干预组(ZDF+VD)。各组大鼠喂养至12周龄后,检测肝损伤、线粒体损伤相关指标及潜在信号通路蛋白的变化。结果与ZL组相比,ZDF组大鼠肝出现严重的脂质沉积,氧化损伤[活性氧簇(ROS)生成增加、丙二醛(MDA)水平明显升高,而谷胱甘肽(GSH)水平明显降低],线粒体肿胀、变性、膜电位显著下降,线粒体生物合成关键蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)、核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor 1,NRF1)和线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)及上游调控蛋白沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin 1,SIRT1)表达均明显下降,1,25(OH)_2VD_3干预减轻了ZDF大鼠肝氧化损伤、线粒体损伤,上调了SIRT1、PGC-1α、NRF1和TFAM的水平,增强了线粒体生物合成。结论 1,25(OH)_2VD_3可能通过SITR1/PGC-1α介导的线粒体保护机制减轻ZDF大鼠肝损伤。

1,25(OH)_(2)D_(3)通过抑制TLR2/NF-κB信号通路保护实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠甲状腺功能研究

目的基于TLR2/NF-κB信号通路研究1,25(OH)_(2)D_(3)对实验性自身免疫性甲状腺炎大鼠的保护作用机制。方法将大鼠随机分为对照组、模型组、硒酵母片对照组和1,25(OH)_(2)D_(3)低、中、高剂量组。除对照组外,其余大鼠采用皮下注射甲状腺球蛋白(PTg)建立自身免疫性甲状腺炎大鼠模型,1,25(OH)_(2)D_(3)低、中、高剂量组分别给予腹腔注射0.5、1.0、1.5μg/kg 1,25(OH)_(2)D_(3)注射剂,对照组和模型组注射等量蒸馏水,硒酵母片对照组注射等量硒酵母混悬液(每天1次),连续4周。观察大鼠甲状腺组织变化,检测大鼠甲状腺功能因子、血清炎性因子、甲状腺自身抗体含量及TLR2/NF-κB信号通路相关蛋白水平及基因表达量。结果与模型组大鼠比较,1,25(OH)_(2)D_(3)各组大鼠血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)及促甲状腺激素(TSH)水平、甲状腺球蛋白抗体(TGAb)、甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及甲状腺组织TLR2、MyD88、TRAF-6和NF-κB mRNA和蛋白表达均不同程度降低,而白细胞介素-10(IL-10)不同程度增加,高剂量1,25(OH)_(2)D_(3)组与模型组差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1,25(OH)_(2)D_(3)对自身免疫性甲状腺炎大鼠的甲状腺功能有一定的改善作用,并能提高自身免疫抗体水平,其机制可能与1,25(OH)_(2)D_(3)抑制TLR2/NF-κB信号通路活性,从而调控IL-6、IL-10、IL-12和TNF-α等炎症因子释放有关。

1,25(OH)_(2)D_(3)通过抑制IκB/NF-κB信号通路抑制破骨细胞生成

目的研究维生素D和维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)在破骨细胞分化各阶段的作用及其机制。方法从C57BL/6小鼠四肢骨骨髓中提取原代单核巨噬细胞(bone marrow derived macrophages,BMMs),使用核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear kappa B ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stlimulating factor,M-CSF)将BMMs诱导成破骨细胞。同时使用不同浓度(0.1、10、1 000 nmol/L)的1,25(OH)_(2)D_(3)进行干预,激活VDR。采用TRAP和FAK染色、噬骨实验、q PCR和Western blot等实验分析1,25 (OH)2D3对破骨细胞生成的影响。结果 1,25(OH)_(2)D_(3)作为VDR的强激动剂,在1 000 nmol/L时能高效激活VDR,在mRNA和蛋白水平均抑制破骨细胞分化早期c-Fos和NFATc1的表达,以及抑制成熟期Cts K和MMP-9的表达(P<0.05)。1 000 nmol/L 1,25(OH)_(2)D_(3)显著下调IκBα的磷酸化水平(P<0.05),从而抑制p65的核转位与磷酸化。结论 1 000 nmol/L 1,25(OH)_(2)D_(3)显著上调VDR的表达,1,25(OH)_(2)D_(3)激活VDR可通过IκBα/NF-κB p65信号通路抑制破骨细胞分化、融合和骨吸收活性。

1,25(OH)_(2)D_(3)对2型糖尿病大鼠心肌损伤的改善作用

目的:探讨1,25(OH)_(2)D_(3)对2型糖尿病大鼠心肌损伤的改善作用。方法:采用高脂高糖喂养联合腹腔注射链脲佐菌素构建2型糖尿病大鼠模型。将造模成功的大鼠分为2型糖尿病组及低、中、高剂量干预组,另设正常对照组,每组8只;低、中、高剂量干预组分别每日给予0.075、0.150、0.300μg/kg溶于玉米油的1,25(OH)_(2)D_(3)灌胃,正常对照组和2型糖尿病组每日给予等量玉米油灌胃,干预12周。全自动生化分析仪检测干预前后大鼠血清空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。干预后,比色法检测血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)水平,HE染色观察大鼠心肌组织形态学变化,酶标法检测大鼠心肌组织中丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western blot法检测心肌组织中PI3K、p-Akt、Caspase-3蛋白表达水平。结果:干预前,与正常对照组相比,2型糖尿病组及各剂量干预组大鼠血清FBG、TC、TG水平升高(P<0.05)。干预12周后,2型糖尿病组大鼠心肌组织细胞肥大、排列紊乱,与正常对照组相比,血清CK和LDH水平升高,心肌组织中MDA水平上升、SOD活性下降,PI3K和p-Akt蛋白表达水平下降,Caspase-3蛋白表达水平升高(P<0.05)。与2型糖尿病组相比,中剂量或高剂量干预组大鼠FBG、TC、TG、CK和LDH水平下降(P<0.05),心肌组织损伤得到改善,心肌组织中MDA水平下降、SOD活性上升,PI3K、p-Akt蛋白表达水平升高,Caspase-3蛋白表达水平下降(P<0.05)。结论:1,25(OH)_(2)D_(3)可能通过激活PI3K/Akt通路,改善糖脂代谢紊乱,抑制氧化应激,减少心肌细胞凋亡,从而改善2型糖尿病大鼠心肌损伤。