槲皮素预处理ALI大鼠肺组织损伤、炎症/氧化应激反应、铁死亡及Nrf2/HO-1信号通路激活情况观察

目的观察槲皮素灌胃预处理的LPS诱导急性肺损伤(ALI)大鼠肺组织损伤、炎症反应、氧化应激反应、铁死亡及Nrf2/HO-1信号通路激活情况,以探讨槲皮素对ALI的预防作用及机制。方法24只SD大鼠分为槲皮素低、中、高剂量组和阳性对照组(地塞米松)、模型组、正常对照组。槲皮素低、中、高剂量组以25、50、100 mg/kg槲皮素灌胃,1次/天,连续7 d;槲皮素灌胃处理的第4天在大鼠气管内滴注5 mg/kg LPS;阳性对照组以地塞米松1.04 mg/kg灌胃,其余处理同槲皮素组;模型组以生理盐水灌胃,1次/天,连续7天,其余处理同槲皮素组;正常对照组以生理盐水连续灌胃7 d。末次灌注给药后,观察各组肺组织损伤(肺功能及肺组织病理改变、纤维组织阳性表达率、肺泡上皮细胞凋亡率)、炎症反应(肺泡灌洗液TNF-α、IL-6、IL-1β)、氧化应激反应(肺泡灌洗液SOD、GSH、MDA,肺组织ROS)、铁死亡(Fe^(2+)水平)及Nrf2/HO-1信号通路激活[肺组织核因子红细胞2相关因子2(Nfr2)、血红素加氧酶1(HO-1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)、过氧化氢酶(CAT)蛋白]情况。结果与正常对照组比较,模型组PaCO_(2)水平升高,PaO_(2)、SaO_(2)水平降低(P均<0.01);肺组织可见肺泡上皮细胞变性坏死,纤维组织阳性表达率高;肺泡上皮细胞凋亡率高;肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高,SOD、GSH水平降低,MDA水平升高,肺组织ROS表达水平升高,肺泡灌洗液中Fe^(2+)水平升高(P均<0.05)。与模型组相比,槲皮素中、高剂量组和阳性对照组中PaCO_(2)均降低(P均<0.05),槲皮素高剂量组PaO_(2)和SaO_(2)水平升高(P均<0.05);槲皮素高剂量组与阳性对照组肺组织炎性浸润与纤维增生明显减少,肺泡恢复正常生理结构;槲皮素低、中、高剂量组和阳性对照组肺纤维组织阳性表达率均下降(P均<0.05),其中槲皮素高剂量组肺纤维组织阳性表达率最低;槲皮素低、中、高剂量组和阳性对照组肺泡上皮细胞凋亡率均降低(P均<0.01);槲皮素低、中、高剂量组和阳性对照组肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低、SOD、GSH水平升高、MDA水平降低,肺组织ROS表达水平降低(P均<0.01),肺泡灌洗液中Fe^(2+)水平降低。与正常对照组比较,模型组肺组织中CAT、HO-1、Nrf2、SOD2蛋白表达水平低(P均<0.01);与模型组比较,槲皮素中、高剂量组和阳性对照组肺组织中CAT、HO-1、Nrf2、SOD2蛋白表达水平高(P均<0.05)。结论槲皮素灌胃预处理的ALI大鼠肺组织损伤、炎症反应、氧化应激反应、铁死亡情况减轻,Nfr2/HO-1信号通路激活;槲皮素灌胃预处理可预防LPS诱导的大鼠ALI,可能通过抑制炎症反应、氧化应激反应及铁死亡而起作用;槲皮素可能通过上调Nfr2/HO-1信号通路而抑制炎症反应、氧化应激反应及铁死亡;50、100 mg/kg槲皮素均对LPS诱导的大鼠ALI起预防作用,以100 mg/kg槲皮素的作用效果更佳。

基于PPARγ/LXRα/ABCA1信号通路探讨芪黄疽愈方对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化形成的影响及其作用机制

目的 基于过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ/肝X受体(LXR)α/三磷酸腺甘结合盒转运体(ABC)A1信号通路探讨芪黄疽愈方影响对ApoE^(-/-)小鼠动脉粥样硬化(AS)形成及其作用机制。方法 选取25只C57BL/6小鼠作为空白组给予普通饲料喂饲配合生理盐水灌胃,68只ApoE^(-/-)小鼠随机分为模型组(24只)、中药组(22只)、对照组(22只)给予高脂饲料喂饲配合对应药物灌胃,12 w后通过主动脉苏木素-伊红(HE)染色证实造模成功,通过小鼠状态了解小鼠一般状况;主动脉HE染色、油红O染色观察动脉硬化及脂质沉积情况;肝脏HE染色、油红O染色观察肝脏病理变化、红染脂滴情况,并通过Western印迹、聚合酶链反应(PCR)检测PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达情况。结果 空白组皮毛水润光泽,精神状态良好,活跃,饮食饮水正常;模型组精神萎靡,皮毛晦暗,倦怠懒动,饮食差,饮水正常;与模型组相比,中药组及对照组给药后各症状均有不同程度改善。各组主动脉HE、油红O染色显示,空白组主动脉切片未见AS斑块,主动脉大体标本未见明显红染脂质;与空白组相比,模型组主动脉切片可见斑块,大体标本可见明显红染脂质;与模型组相比,中药组及对照组动脉切片中AS斑块面积较小,大体标本中红染脂质面积较小。小鼠肝脏HE、油红O染色显示,空白组肝细胞结构正常,细胞核位于细胞中央,细胞沿中央静脉为中心向四周放射排列,未见脂肪变性;油红O未见红染脂质;与空白组比较,模型组肝细胞排列紊乱,胞内可见形态不同、大小不等、数量不一的脂滴空泡,油红O切片可见大量红染脂质。与模型组比较,对照组、中药组肝脏病变程度减轻,肝细胞结构大部分清晰可见,脂滴数量减少,油红O红染脂质明显减少。Western印迹检测肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白的表达;与空白组相比,模型组PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达均明显降低(P<0.05);与模型组相比,中药组均显著升高(P<0.05)。PCR检测肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA的表达,与空白组相比,模型组PPARγ、LXRα、ABCA1 mRNA表达均明显降低(P<0.05);与模型组相比,中药组显著升高(P<0.05)。结论 芪黄疽愈方能够影响小鼠动脉硬化,升高肝脏PPARγ、LXRα、ABCA1蛋白表达,调节肝脏脂质代谢,促进胆固醇逆转运,延缓AS进展。

常压高浓度氧对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤与Nrf2/HO-1信号通路的影响分析

目的探究常压高浓度氧(NBO)对新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤及核因子E2相关因子2/血红素氧合酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路的影响。方法取新生SD大鼠45只,采用随机数字表法分为常氧组、NBO组和NBO+Nrf2激活剂组,每组各15只。常氧组大鼠置于普通空气(21%氧气)中饲养,NBO组和NBO+Nrf2激活剂组大鼠置于90%常压氧气饲养,NBO+Nrf2激活剂组每日灌胃5 mg/kg Nrf2激动剂莱菔硫烷。测定脑组织伊文思蓝(EB)含量,采用酶联免疫法检测血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)含量,干湿重法检测脑组织含水量,HE染色和TUNEL染色观察脑组织病理变化,蛋白质印迹法检测海马组织Nrf2/HO-1信号通路蛋白表达,水迷宫检测大鼠认知功能。结果与常氧组比较,NBO组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组脑组织EB、VEGF、MMP-9含量及脑组织含水量降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。病理染色结果显示,常氧组大鼠神经细胞形态及结构完整,未见明显病理变化和细胞凋亡;NBO组神经细胞形态及结构不规则,出现明显的水肿和空泡,并伴有大量的凋亡细胞;NBO+Nrf2激活剂组脑组织病理损伤较NBO组明显减轻。与常氧组比较,NBO组脑组织Nrf2、HO-1蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组Nrf2、HO-1蛋白相对表达量升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与常氧组比较,NBO组第2~4天逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,差异均有统计学意义(P<0.05);与NBO组比较,NBO+Nrf2激活剂组第2~4天逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增多,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论NBO可诱导新生大鼠脑微血管内皮细胞损伤,导致远期认知功能障碍,可能与下调Nrf2/HO-1信号通路表达有关。

乳岩宁对三阴乳腺癌荷瘤裸鼠Notch1信号通路的作用机制

目的 观察乳岩宁方与卡培他滨联用对MDA-MB-231乳腺癌荷瘤裸鼠的瘤组织中Notch1信号通路的作用。方法 用对数生长期的MDA-MB-231细胞悬液,于裸鼠左侧胸壁接种,成功长出瘤组织后将其移植到未接种裸鼠的胸壁,建立三阴乳腺癌模型,共40只荷瘤裸鼠,分5组,每组8只,日1次灌胃,连续21 d灌药。观察裸鼠状态并计算肿瘤组织的抑制率;免疫印迹法测定Notch 1、Notch1受体的细胞内结构(Notch1 intracellular domain, NICD1)、与YRPW基序相关的发状分裂增强子1(Hairy and enhancer of split related with YRPW motif 1,Hey1)、发状分裂相关增强子1(Hairy and enhancer of split Homolog 1,Hes1)、髓细胞增生原癌基因(Cellular myelocytomatosis oncogene, C-myc)的蛋白表达量;实时荧光定量PCR测定Notch 1、Hey1、Hes1、C-myc的基因表达量。结果 与模型组对比,中药、西药和中药+西药组的肿瘤质量均有明显减轻,差异有统计学意义(P<0.01),3组的抑瘤率分别为33.11%、59.60%、65.93%。免疫印迹法结果表明,与模型组相比,中药组、西药组、中药+西药组的Notch 1、NICD1、Hey1、Hes1、C-myc蛋白水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);而Notch 1和Hes1的蛋白表达水平在中药组和西药组中水平相当,差异无统计学意义(P>0.05);中药+西药组较西药组中Hes1蛋白表达水平明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量结果表明,与模型组相比,中药组、西药组、中药+西药组Notch 1、Hey1、Hes1、C-myc的mRNA水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01);与西药组相比,中药组与西药组Notch 1、Hes1、C-myc的mRNA水平相当,差异无统计学意义(P>0.05);中药+西药组较西药组中Notch 1及Hey1的mRNA水平明显减低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 疏肝理气中药复方乳岩宁能够抑制三阴乳腺癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长,其作用机制与三阴乳腺癌中的Notch1信号通路受到抑制相关。为疏肝理气中药治疗三阴乳腺癌,尤其是影响乳腺癌Notch1信号通路方面提供了实验依据。

扁蒴藤素调节Shh/Gli1信号通路对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和血管生成拟态的影响

目的:探讨扁蒴藤素(Pris)调节Shh/Gli1信号通路对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡和血管生成拟态(VM)的影响及其机制。方法:采用MTT法检测不同浓度Pris对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用,以选取合适的干预浓度。将HeLa细胞分为对照组、环巴胺组、Pris组、Pris+pc-NC组和Pris+pc-Shh组。采用MTT法、EdU法检测各组细胞的增殖能力,Transwell小室法、流式细胞术检测各组细胞的迁移及侵袭能力和细胞凋亡率,体外血管生成实验观察VM形成情况,qPCR法检测各组细胞中Shh和Gli1 mRNA表达水平,WB法检测细胞中血管内皮生长因子A(VEGF-A)、血管内皮钙黏素(VE-cadherin)、Ki-67、caspase-3及与Shh/Gli1信号通路相关蛋白表达水平。结果:0.25~2.5μmol/L的Pris对HeLa细胞增殖均有显著抑制作用,选择1.5μmol/L的Pris进行后续实验。对照组细胞形成良好的管腔结构,与对照组相比,环巴胺组、Pris组和Pris+pc-NC组HeLa细胞管腔结构被明显破坏,细胞增殖活力和增殖率、迁移及侵袭细胞数目、Shh和Gli1 mRNA、VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67、Shh、Gli1蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率和caspase-3表达均显著升高(均P<0.05);环巴胺组与Pris组HeLa细胞各项检测指标比较差异均无统计学意义(均P>0.05);与Pris+pc-NC组相比,Pris+pc-Shh组细胞管腔结构形成明显改善,细胞增殖活力和增殖率、迁移及侵袭细胞数、Shh和Gli1 mRNA、VEGF-A、VE-cadherin、Ki-67、Shh、Gli1蛋白表达均显著升高(均P<0.05),细胞凋亡率和caspase-3表达均显著降低(均P<0.05)。结论:Pris抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖、迁移与侵袭和VM的形成并促进细胞凋亡,可能与阻断Shh/Gli1信号通路有关。

牛蒡子苷元调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响

目的:探究牛蒡子苷元(ARC)通过调控Notch/Hes-1信号通路对口腔鳞状细胞癌(OSCC)HSC-3细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及其机制。方法:使用不同质量浓度的ARC处理人HSC-3细胞,CCK-8法检测ARC对细胞增殖活力的影响,以选择适宜的药物浓度。将HSC-3细胞分为对照组、ARC-L组(10 mg/L ARC)、ARC-M组(20 mg/L ARC)、ARC-H组(40 mg/L ARC)和ARC-H+Jagged1/FC组(40 mg/L ARC+1.2μg/mL Jagged1/FC)。采用EdU法检测细胞增殖能力,划痕愈合实验、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞的迁移、侵袭能力及细胞周期和细胞凋亡率,WB法检测增殖(c-Myc、cyclin D1)、凋亡(BAX、Bcl-2、survivin)、EMT(E-cadherin、vimentin、Snail)及Notch/Hes-1通路(Notch 1、Hes-1、NICD)相关蛋白的表达水平。结果:与0 mg/L相比,10~80 mg/L的ARC均能显著降低HSC-3细胞增殖活力(均P<0.05)。与对照组相比,ARC-L组、ARC-M组和ARC-H组HSC-3细胞EdU阳性率、划痕愈合率、侵袭细胞数、S期和G2/M期细胞占比及c-Myc、cyclin D1、Bcl-2、survivin、vimentin、Snail、Notch 1、Hes-1和NICD蛋白表达均显著降低(均P<0.05),细胞凋亡率、G0/G1期细胞占比及BAX、E-cadherin的蛋白表达均显著升高(均P<0.05),且呈浓度梯度依赖性。同时使用Notch激动剂Jagged1/FC,则可部分逆转ARC对HSC-3细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡及相关蛋白表达的作用(均P<0.05)。结论:ARC可能通过抑制Notch/Hes-1信号通路抑制OSCC细胞HSC-3增殖和侵袭并促进细胞凋亡。

针刺调节Shh/Ptch1信号通路对帕金森认知障碍模型大鼠的神经保护作用研究

目的:探讨针刺治疗是否可通过调节Shh/Ptch1信号通路进而改善帕金森(PD)大鼠认知功能。方法:将SD大鼠随机分为对照组、模型组、针刺组、针刺+环巴胺(Shh抑制剂)组、西药组(盐酸多奈哌齐)及针刺+西药组。采用Morris水迷宫检测空间学习记忆能力;ELISA法检测大鼠脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-6、IL-10及IL-1β)水平;商品化试剂盒检测脑组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平;HE染色观察大鼠海马组织形态变化;蛋白质印迹法检测大鼠海马组织活化半胱氨酸蛋白酶(Cleaved-caspase-3)、B淋巴细胞瘤(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、音猬因子(Shh)及补缀同源物1(Ptch1)蛋白表达。结果:与对照组相比,模型组大鼠神经元有明显损伤,Morris水迷宫潜伏期时间、海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、Cleaved-caspase-3及Bax蛋白表达水平显著升高,滞留时间和穿越平台次数、IL-10水平、SOD、CAT活性、Bcl-2、Shh及Ptch1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,针刺组、西药组和针刺+西药组大鼠神经元损伤显著减轻,Morris水迷宫潜伏期时间、海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、Cleaved-caspase-3及Bax蛋白表达水平显著降低,滞留时间和穿越平台次数、IL-10水平、SOD、CAT活性、Bcl-2、Shh及Ptch1蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与针刺组相比,针刺+环巴胺组大鼠神经元损伤显著加重,Morris水迷宫潜伏期时间、海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、Cleaved-caspase-3及Bax蛋白表达水平显著升高,滞留时间和穿越平台次数、IL-10水平、SOD、CAT活性、Bcl-2、Shh及Ptch1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);针刺组和西药组各检测指标差异均无统计学意义(P>0.05);与针刺组和西药组相比,针刺西药组大鼠神经元损伤显著减轻,Morris水迷宫潜伏期时间、海马组织中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA水平、Cleaved-caspase-3及Bax蛋白表达水平显著降低,滞留时间和穿越平台次数、IL-10水平、SOD、CAT活性、Bcl-2、Shh及Ptch1蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。结论:针刺治疗可降低PD认知障碍大鼠炎症反应和氧化应激,减轻神经元损伤,进而改善其认知功能,可能是通过激活Shh/Ptch1信号通路实现的。

基于CX3CL1/CX3CR1信号通路探讨加味补阳还五汤对卒中后抑郁大鼠神经可塑性的影响

目的探究加味补阳还五汤对卒中后抑郁(PSD)大鼠神经可塑性的影响。方法60只大鼠随机分为假手术组、模型组、氟西汀组及加味补阳还五汤低、中、高剂量组,采用复合方法制备PSD模型,加味补阳还五汤低、中、高剂量组给予不同剂量加味补阳还五汤(6.7、13.4、26.8 g/kg)灌胃,氟西汀组给予氟西汀(1.8 mg/kg)灌胃,假手术组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃,连续21 d。给药结束后,进行神经功能、行为学评分,HE、尼氏染色观察脑组织病理变化,免疫荧光染色观察神经元(Neun)和小胶质细胞(Iba1)之间相互作用,Western blot法检测神经趋化因子(CX3CL1)、CX3CR1、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、苏氨酸激酶(Akt)蛋白表达。结果与模型组比较,各给药组神经功能缺损评分降低(P<0.05,P<0.01),旷场活动总距离和进入中央区域频次增加(P<0.05,P<0.01),不动时间缩短(P<0.05);加味补阳还五汤中、高剂量组和氟西汀组新奇摄食潜伏期缩短(P<0.01),缺血侧海马细胞排列整齐,细胞水肿减轻,细胞基本正常,尼氏小体增多,CX3CL1/Neun、CX3CR1/Iba1荧光强度增强(P<0.05),CX3CL1、CX3CR1、PI3K、p-Akt蛋白表达升高(P<0.05,P<0.01)。结论加味补阳还五汤对PSD大鼠具有抗抑郁、神经保护作用,其机制可能与调控CX3CL1/CX3CR1信号通路关键因子、增强神经可塑性有关。

基于磷脂酰肌醇3激酶与苏氨酸蛋白激酶1信号通路小檗碱调节巨噬细胞极化机制研究

目的探究小檗碱对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人髓系白血病单核细胞(THP-1)巨噬细胞极化的影响和可能作用机制。方法采用佛波酯(PMA)将THP-1细胞诱导成巨噬细胞,加入不同浓度的小檗碱,分别为对照组、小檗碱5μmol/L组、小檗碱10μmol/L组、小檗碱20μmol/L组、小檗碱40μmol/L组、小檗碱50μmol/L组,干预24 h或48 h。采用细胞计数8试剂盒检测细胞活力,筛选小檗碱最佳浓度和时间。将PMA诱导的THP-1巨噬细胞分为空白组、模型组、小檗碱组、抑制剂组、小檗碱+抑制剂组。酶联免疫吸附测定检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))的含量;定量聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、精氨酸酶1(Arg1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)mRNA表达情况;Western blot检测Akt1和磷酸化Akt1(p-Akt1)抗体蛋白含量。结果干预24 h时,与对照组比较,小檗碱40μmol/L组和50μmol/L组巨噬细胞活性降低(P<0.05);干预48 h时,小檗碱5μmol/L组、小檗碱10μmol/L组、小檗碱20μmol/L组、小檗碱40μmol/L组、小檗碱50μmol/L组巨噬细胞活性均低于对照组[(0.89±0.02)%、(0.82±0.03)%、(0.71±0.02)%、(0.62±0.03)%、(0.53±0.02)%vs(1.01±0.01)%,P<0.05]。小檗碱20μmol/L组处理24 h时对细胞活力影响不大,作为最佳浓度和时间。与空白组比较,模型组iNOS含量和TNF-αmRNA水平升高,TGF-β_(1)含量、Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,小檗碱组iNOS含量和TNF-αmRNA水平降低,TGF-β_(1)含量、Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平升高(P<0.05);与小檗碱组比较,小檗碱+抑制剂组iNOS含量和TNF-αmRNA水平升高,Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论小檗碱可通过激活PI3K/Akt1通路,抑制ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞炎性反应,并抑制巨噬细胞向M1型极化,促进其向M2型极化。

青蒿琥酯调节AMPK/mTOR/ULK1信号通路对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响

目的探讨青蒿琥酯对肾母细胞瘤细胞增殖、凋亡和自噬的作用及其分子机制。方法体外培养人肾母细胞瘤细胞株SK-NEP-1并以0、12.5、25.0、50.0、100.0、150.0μmol/L浓度的青蒿琥酯处理,采用CCK-8法测定各组细胞活力并筛选出青蒿琥酯最佳作用浓度。将SK-NEP-1细胞随机分为对照组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)组、AMPK抑制剂Dorsomorphin(10.0μmol/L)组、青蒿琥酯(100.0μmol/L)+Dorsomorphin(10.0μmol/L)组,以青蒿琥酯和Dorsomorphin单独或联合处理各组细胞后,采用CCK-8法检测各组细胞活力,采用平板克隆形成实验检测各组细胞的集落形成情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况;采用MDC荧光染色法检测各组细胞的自噬情况;采用蛋白免疫印迹法检测各组细胞中凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、cleaved多聚ADP核糖聚合酶(PARP)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、自噬相关蛋白[轻链3(LC3)Ⅱ、LC3Ⅰ、Beclin-1]及AMPK/mTOR/ULK1信号通路相关蛋白的表达情况。结果不同浓度青蒿琥酯均可抑制SK-NEP-1细胞的活力(均P<0.05),且随浓度升高其抑制作用增强。用100.0μmol/L青蒿琥酯和10.0μmol/L Dorsomorphin分别处理SK-NEP-1细胞后,与对照组相比,青蒿琥酯组细胞的凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均升高(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均降低(均P<0.05);Dorsomorphin组细胞凋亡率、自噬空泡相对量及Bax、cleaved PARP、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1蛋白表达水平均降低(均P<0.05),细胞活力、集落形成率及Bcl-2、p-mTOR/mTOR蛋白表达水平均升高(均P<0.05)。青蒿琥酯和Dorsomorphin联合干预SK-NEP-1细胞逆转了青蒿琥酯的抗肿瘤作用。结论青蒿琥酯可能通过激活AMPK/mTOR/ULK1信号通路增强肾母细胞瘤细胞自噬,进而抑制其增殖并促进其凋亡。

西黄胶囊联合西妥昔单抗通过Nrf2/HO-1信号通路调控结直肠癌细胞凋亡、迁移以及侵袭的作用机制研究

目的研究西黄胶囊联合西妥昔单抗通过Nrf2/HO-1信号通路对结直肠癌细胞凋亡、迁移以及侵袭的调控作用。方法使用细胞计数试剂盒(CCK8)确定西黄胶囊和西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞活力的影响。使用流式细胞术、划痕法和侵袭小室法检测西黄胶囊联合西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞凋亡、迁移以及侵袭的影响。使用蛋白质印迹技术检测西黄胶囊联合西妥昔单抗对结直肠癌HCT-116细胞B细胞淋巴瘤2(BCL2)、BCL2关联X蛋白(BAX)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)、锌指蛋白232(ZNF320)、血管内皮生长因子A(VEGA)、糖原合成酶激酶3β(GSK3β)、核因子E2相关因子2(NRF2)和血红素氧合酶1(HO-1)表达的影响。结果CCK8实验结果显示,西黄胶囊和西妥昔单抗对HCT-116细胞活力最佳抑制时间是72 h,IC 50分别为5.28%和170.20 mg/L。与对照组相比,西黄胶囊和西妥昔单抗增加HCT-116细胞的凋亡(P<0.05)、抑制HCT-116细胞迁移以及侵袭(P<0.05)。与单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗相比,西黄胶囊联合西妥昔单抗对HCT-116细胞的促凋亡效果和对迁移以及侵袭的抑制效果更加明显(P<0.05)。蛋白质印迹技术结果显示,与对照组比较,西黄胶囊和西妥昔单抗促进HCT-116细胞的BAX表达(P<0.05),抑制BCL2、MMP2、MMP9、ZNF320、VEGA、GSK3B、NRF2、HO-1的表达(P<0.05)。此外,与单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗相比,西黄胶囊联合西妥昔单抗的效果更加明显(P<0.05)。结论西黄胶囊联合西妥昔单抗可能通过抑制Nrf2/HO-1信号通路抑制结直肠癌HCT-116细胞的活力、迁移以及侵袭,促进细胞凋亡,且西黄胶囊联合西妥昔单抗的干预效果优于单独使用西黄胶囊或西妥昔单抗。

环腺苷酸激活交换蛋白1/RAS相关蛋白1信号通路在脑缺血-再灌注损伤发病机制中的研究进展

脑缺血-再灌注损伤(CIRI)是缺血性卒中患者恢复患侧脑组织血流时引发的严重并发症。CIRI患者常伴有神经功能减退、认知障碍、情绪障碍等,对日常生活产生严重影响。目前CIRI易被早期诊断,但相关特异性治疗方法相对较少。作者对环腺苷酸激活交换蛋白1/RAS相关蛋白1(Epac1/Rap1)信号通路与CIRI的相关性研究进行综述,以期为CIRI患者的临床治疗提供新思路。

针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB/激活蛋白-1信号通路的影响

目的探讨针刺对脑心综合征大鼠脑组织细胞凋亡、炎症因子及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)/激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)信号通路的影响。方法将36只SD大鼠随机分为针刺组、模型组和对照组,各12只。采用胶原酶加肝素联合注射大鼠尾状核制备脑心综合征大鼠模型,对照组给予等剂量生理盐水向大鼠尾状核注入,手术操作过程同模型组。模型组和假手术组均不予针刺;针刺组选心俞穴、内关穴、风府穴和水沟穴,每日针刺1次,连续3天。采用原位末端凋亡(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)法测定脑组织细胞凋亡情况;神经功能采用Zea-Longa法评估;运用酶联免疫法测定白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平;采用Western Blot法测定MAPK、NF-κB、AP-1蛋白表达。结果模型组和针刺组大鼠脑组织细胞凋亡指数(apoptosis index,AI)高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠脑组织AI低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠神经行为评分高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠神经行为评分低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值高于假手术组(P<0.05);针刺组大鼠MAPK蛋白灰度值、NF-κB蛋白灰度值和AP-1蛋白灰度值低于模型组(P<0.05)。结论脑心综合征大鼠采用针刺可减轻大鼠脑组织细胞凋亡,减轻大鼠炎症因子,且可下调MAPK/NF-κB/AP-1信号通路表达。

金雀异黄酮通过Nrf2/HO-1信号通路减轻皮质神经元低氧/复氧损伤

目的研究金雀异黄酮(GEN)对皮质神经元低氧/复氧(H/R)损伤的影响,并基于核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)信号通路探讨其机制。方法分离并体外培养C57BL/6J小鼠胎鼠(妊娠15 d)皮质神经元,设正常对照(Normal)组、模型(H/R)组、GEN(12.5μmol·L^(-1))组、TBHQ(Nrf2激动剂,10μmol·L^(-1))组、GEN(12.5μmol·L^(-1))+TBHQ(10μmol·L^(-1))组。除正常对照组外,其他组采用低氧(5%CO_(2)+95%N_(2))4 h后复氧(5%CO_(2)+95%空气)24 h的方法制备H/R损伤皮质神经元模型,各组分别于造模前2h给药干预。采用CCK-8法、流式细胞术检测神经元活力和凋亡率,DCFH-DA荧光探针法检测神经元活性氧(ROS)含量,分光光度法检测神经元中丙二醛(MDA)含量和抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]活性,RT-PCR法检测神经元Nrf2、HO-1 mRNA表达,Western blot法检测神经元Nrf2、HO-1、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型Caspase-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达。结果与H/R组比较,GEN组、TBHQ组和GEN+TBHQ组皮质神经元活力明显升高、凋亡率明显降低(P<0.05);神经元中ROS、MDA含量明显降低,SOD、GSH-Px活性明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1 mRNA表达量明显升高(P<0.05);Nrf2、HO-1、Bcl-2蛋白表达量及Bcl-2/Bax比值明显升高,Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达量明显降低(P<0.05)。GEN+TBHQ组对H/R损伤皮质神经元活力、凋亡率、氧化应激指标、Nrf2/HO-1信号通路相关mRNA和蛋白表达的调控作用均明显优于GEN组和TBHQ组(P<0.05)。结论GEN可通过促进Nrf2/HO-1信号通路活化抑制氧化应激损伤和神经元凋亡,对皮质神经元H/R损伤起到保护作用。

督脉隔药灸联合水凝胶多功能复合敷料对压力性损伤大鼠Nrf2/HO-1/NQO1信号通路的影响

目的观察督脉隔药灸联合水凝胶多功能复合敷料对压力性损伤大鼠创面修复及核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)/血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)/NADPH醌氧化还原酶1(NADPH quinone oxidoreductase 1,NQO1)信号通路的影响。方法选取50只SPF级SD大鼠,随机分为假手术组、模型组、水凝胶敷料组、督脉隔药灸组、联合干预组,每组10只。除假手术组外,其余4组借助压力装置构建压力性损伤大鼠模型。分组干预并记录各组大鼠的压力性损伤修复情况及创面组织病理变化;借助ELISA检测各组大鼠的血清炎性因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6以及氧化应激因子丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平;Western blot与RT-PCR检测各组大鼠创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白及mRNA的表达水平。结果HE染色结果显示:假手术组皮肤结构未被破坏;模型组创面肉芽组织可见明显的细胞坏死、变性及炎性细胞浸润;干预各组可见创面修复,表现为散在炎性细胞浸润,“气球样”坏死变性明显减少。Masson染色结果显示:假手术组创面皮肤组织胶原纤维较为整齐;模型组创面肉芽组织可见大面积的胶原纤维沉积、紊乱;干预各组可见不同程度的创面修复。与假手术组对比,模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平和创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、MMP-9蛋白及mRNA的表达水平均升高(P<0.05),而创面修复率、血清SOD、GSH-Px水平均下降(P<0.05);与模型组比较,水凝胶敷料组、督脉隔药灸组、联合干预组的血清TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA水平均下降(P<0.05),而创面修复率、血清SOD、GSH-Px水平和创面肉芽组织Nrf2、HO-1、NQO1、MMP-9蛋白及m RNA的表达水平均升高(P<0.05),且联合干预组较其他干预组更优(P<0.05)。结论督脉隔药灸可有效促进压力性损伤的创面修复,与水凝胶多功能复合敷料联合使用效果更佳,其机制可能与督脉隔药灸抑制创面炎性反应及氧化应激,并激活Nrf2/HO-1/NQO1信号通路相关。

冬凌草甲素介导Sirt1信号轴抑制溃疡性结肠炎的机制研究

目的:利用葡聚糖硫酸钠盐(DSS)构建小鼠溃疡性结肠炎(UC)模型,探讨冬凌草甲素(Ori)通过介导Sirt1信号通路缓解UC的作用及分子机制,寻找治疗UC的新药。方法:60只BALB/c小鼠随机分为正常组(NC)、模型组(DSS)、DSS+美沙拉嗪缓释颗粒组(AC)、DSS+低剂量Ori组(Ori-L)、DSS+中剂量Ori组(Ori-M)和DSS+高剂量Ori组(Ori-H),每组10只。除NC组外,其余各组小鼠自由饮用3%DSS水溶液7 d,造模成功后,Ori-L组、Ori-M组和Ori-H组分别灌胃50、100、150 mg/kg Ori混悬液,NC组及DSS组自由饮用蒸馏水,AC组灌胃美沙拉嗪缓释颗粒100 mg/kg,连续治疗10 d。记录小鼠体质量变化并进行疾病活动指数(DAI)评分;治疗结束后,ELISA检测血清IL-1β和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;摘取完整结肠组织,测量长度,进行HE染色,实时荧光定量PCR和Western blot检测各组结肠组织Sirt1、NF-κB和p53表达。结果:造模成功后,与NC组相比,其余5组小鼠出现体质量下降、DAI评分升高以及结肠长度缩短现象,Sirt1表达受到明显抑制,NF-κB和p53表达显著升高,且伴有明显炎症病理学特征。相较于DSS组,Ori-L、Ori-M和Ori-H以及AC组小鼠实验期间体质量减轻幅度较小,DAI评分显示其疾病活动较低,且结肠长度缩短程度相对较小,Sirt1表达受抑制程度较低,NF-κB和p53表达上升幅度相对较小,AC组结果证明Ori对UC有治疗效果。结论:Ori能改善小鼠UC,其作用可能与调控Sirt1信号有关。

HDAC3抑制剂RGFP966通过下调TGF-β1/SMAD3/STAT-1信号通路抑制AIM2炎症小体活化和EMT缓解子宫内膜纤维化

目的探讨HDAC3抑制剂RGFP966缓解子宫内膜纤维化的分子机制。方法将18只6~8周雌性SD大鼠随机分为3组,Control组、IUA模型组(即宫内粘连大鼠模型组)、RGFP966治疗组(IUA模型组给予HDAC3抑制剂RGFP966治疗),每组6只。建立IUA大鼠模型。ELISA测定大鼠血清炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。qPCR法测定大鼠子宫内膜组织上皮间质转化标志物E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin mRNA相对表达水平。蛋白质印迹法测定大鼠子宫内膜组织TGF-β1、SMAD3、p-STAT-1、STAT-1、AIM2、IL-18、cleaved-IL-1β、IL-1β的表达水平。结果与Control组相比,IUA模型组大鼠子宫角壁变薄,血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(P<0.05);E-cadherin mRNA相对表达水平降低,N-cadherin、α-SMA、Vimentin mRNA相对表达水平升高(P<0.05);TGF-β1、SMAD3、p-STAT-1蛋白质表达水平增强(P<0.05);AIM2、IL-18、cleaved-IL-1β的表达水平增强(P<0.05)。与IUA模型组相比,RGFP966治疗组部分逆转(P<0.05)了上述指标。STAT-1和IL-1β的表达水平在上述3个分组中无明显差异(P>0.05)。结论HDAC3的抑制剂RGFP966可通过下调TGF-β1/SMAD3/STAT-1信号通路抑制AIM2炎症小体和EMT,缓解子宫内膜纤维化。

益气活血托毒方对慢性非细菌性前列腺炎大鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响

目的观察益气活血托毒方对慢性非细菌性前列腺炎(CNP)大鼠Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响,探讨其治疗CNP作用机制。方法采用去势结合雌激素诱导法制备CNP大鼠模型。48只SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组、塞来昔布组和益气活血托毒方组,每组12只。塞来昔布组予塞来昔布混悬液0.035 g/kg灌胃,益气活血托毒方组予益气活血托毒方水煎剂8.64 g/kg灌胃,空白组和模型组灌胃等体积生理盐水,连续28 d。Von Frey纤维丝测痛仪测定大鼠机械痛阈值,HE染色观察前列腺组织病理变化并进行病理评分,化学荧光法检测前列腺组织活性氧(ROS)含量,比色法测定前列腺组织谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量,Western blot检测前列腺组织Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素氧合酶-1(HO-1)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠机械痛阈值、前列腺指数显著降低(P<0.01);前列腺组织腺腔大小不一,腔内分泌物消失,间质疏松、水肿,有大量纤维组织增生和炎性细胞浸润,病理评分显著升高(P<0.01);前列腺组织ROS、MDA含量显著升高,GSH-Px活性显著降低(P<0.01),Keap1、Nrf2蛋白表达显著降低,HO-1蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。与模型组比较,益气活血托毒方组大鼠机械痛阈值显著升高(P<0.01);前列腺组织轻微损伤,有少量纤维增生和炎性细胞浸润,病理评分显著降低(P<0.01,P<0.05);前列腺组织ROS、MDA含量显著降低,GSH-Px活性显著升高(P<0.01),Keap1、Nrf2蛋白表达显著升高,HO-1蛋白表达显著降低(P<0.01,P<0.05)。结论益气活血托毒方可有效改善CNP大鼠前列腺组织病理形态,提高痛阈值,其作用机制可能与激活Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,降低大鼠前列腺组织氧化应激损伤有关。

基于Keap1/Nrf2/HO-1信号通路研究当归醇提物对多囊卵巢综合征大鼠的保护作用

目的使用来曲唑联合高脂饮食建立多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)大鼠模型,探讨当归醇提物(ethanol extract of Angelicae Sinensis Radix,EEA)对PCOS大鼠的保护作用及其作用机制。方法来曲唑联合高脂饮食诱导雌性SD大鼠建立PCOS模型,并用EEA干预。阴道涂片染色、HE染色、酶联免疫吸附法(ELISA)和生化指标检测评价EEA对PCOS大鼠的治疗作用,并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测EEA对Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响。结果阴道涂片和HE染色结果表明,EEA改善了PCOS大鼠动情周期紊乱和卵巢组织病变,ELISA和生化指标检测结果表明EEA可以调节激素紊乱,改善血脂异常;且在模型组中Keap1蛋白和mRNA表达明显上调,Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达明显下调而经过EEA治疗后Keap1蛋白和mRNA表达明显下调,Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表达明显上调(P<0.05或P<0.01)。结论EEA可以减轻大鼠PCOS,其机制可能是通过促进Keap1/Nrf2/HO-1信号通路,从而抑制氧化应激。

基于RAP1信号通路探讨右归丸延缓膝骨关节炎的软骨退变

目的通过右归丸治疗膝骨关节炎(KOA)模型大鼠,观察大鼠关节软骨形态及检测右归丸对RAP1信号通路表达和大鼠血清中的炎性因子表达,探讨右归丸对RAP1信号通路的表达及防治KOA的作用机制,为治疗提供理论基础。方法72只SPF级SD大鼠(雌雄各半)随机数字表法分为假手术组12只和造模组60只。造模组采用改良Hulth法建立膝关节OA模型,假手术组接受假手术。将造模成功的大鼠分为模型组(n=11)、右归丸低剂量组(n=12)、右归丸中剂量组(n=12)、右归丸高剂量组(n=12)及塞来昔布组(n=12)。给药阶段模型组、假手术组给予0.9%氯化钠溶液;右归丸低剂量组为等效浓度的1/2为0.5 g/d、右归丸中剂量组等效浓度为1 g/d、右归丸高剂量组为等效浓度2倍为2 g/d,塞来昔布组配置成悬浮(等效浓度为0.0072 g/d)。驱赶7周后检测并比较各组大鼠软骨病理,血清TNF-α、IL-1β和IL-18含量,以及大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平。结果各组大鼠软骨病理检测结果显示:假手术组大鼠软骨组织未见异常,模型组大鼠关节软骨部分区域出现明显缺损,右归丸低剂量组大鼠关节软骨表面磨损较模型组有所减轻,而中、高剂量组及塞来昔布组大鼠软骨表面可见侵蚀现象明显改善。右归丸对KOA大鼠血清中的IL-1β、TNF-α、IL-18含量与模型组相比,右归丸高、中、低剂量组和塞来昔布组在大鼠血清中表达显著降低,差异具有统计学意义。与软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路活化水平检测结果显示:与假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun的表达水平均显著升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结果提示,在KOA发生时,RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号转导通路激活,介导软骨组织中炎症反应及细胞凋亡的发生,这与以往研究结果一致。右归丸干预后,软骨组织中RAP1、RAF、MEK1/2、ERK1/2、CREB、MMP3、MMP13、ADAMTS、C-fos、C-myc和C-Jun蛋白表达水平均显著降低,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结论右归丸能够抑制KOA大鼠软骨组织中RAP1-RAF-MEKl/2-ERKl/2-CREB信号通路的活化,降低炎性因子表达,从而延缓软骨退变。