剪接因子3B亚单位1在乳腺癌组织中的表达及与患者临床病理特征关系

目的:探讨剪接因子3B亚单位1(SF3B1)在乳腺癌组织中的表达及与患者临床病理特征的关系。方法:分析88例乳腺癌患者乳腺癌组织和癌旁组织SF3B1的表达水平,评估SF3B1对乳腺癌的诊断价值,比较SF3B1高表达组与低表达组临床病理特征差异。结果:乳腺癌组织SF3B1表达明显高于癌旁组织(P<0.05);SF3B1诊断乳腺癌的AUC为0.713;SF3B1诊断乳腺癌的最佳截断值为110.72。高表达组年龄明显高于低表达组,淋巴结转移为N 0的比例明显低于低表达组,两组病理学分级比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:SF3B1在乳腺癌组织中的表达明显上调,在诊断乳腺癌方面效能较好,与临床病理参数有关,可能参与了乳腺癌的发生、侵袭和转移过程的调控。

基于模型视角 凸显单位“1”——分数乘、除法“解决问题”的教学策略

在小学阶段,有关分数乘、除法的“解决问题”是学习的难点。教师可引导学生通过“表达单位‘1’,借助图式模型理解关系;变换单位‘1’,借助模型理解数量关系;统一单位‘1’,解构模型来解决问题”等过程,提升问题分析技巧,提高对分数意义的理解与应用水平,改善对分数问题的认知结构,发展数学思维。

在“分数混合运算”教学中探寻单位“1”的数学本质

教学“分数混合运算”,要让学生明白计算的关键是找到一个合适的单位“1”,并能根据它与其他量之间的关系将分数的混合运算转化为分数的乘、除法来解决,体会借用单位“1”的本质是代数式的数值化表示,会用方程方法来解决分数混合运算的问题,并明白其易于实现问题解决方式的多样化。

吗啡诱导大鼠镇痛耐受和脊髓GIRK1-2表达减少

【目的】观察G蛋白门控内向整流钾离子通道(GIRK)亚单位GIRK1和GIRK2在吗啡耐受大鼠脊髓背角的表达变化并探讨其调控机制。【方法】成年雄性SD大鼠连续7 d鞘内注射吗啡(15μg/d)建立吗啡耐受模型。在每天吗啡注射前30 min,鞘内注射蛋白激酶C-ε(PKCε)选择性抑制剂εV1-2(10μg),观察对吗啡耐受以及脊髓背角GIRK1和GIRK2表达的影响。24只大鼠随机平均分成四组:生理盐水组(saline)、吗啡组(morphine)、吗啡+生理盐水组(morphine+saline)和吗啡+εV1-2组(morphine+εV1-2)。所有大鼠在1 d、3 d、5 d和7 d,药物注射前和吗啡注射后30 min后检测热痛阈值,在第7天行为学测试结束后,免疫荧光检测脊髓背角GIRK1和GIRK2的表达。【结果】荧光双染显示,GIRK1和GIRK2主要分布于大鼠脊髓背角I-Ⅱ板层,且与μ阿片受体(MOR)共染。与生理盐水组相比,连续7 d鞘内注射吗啡导致吗啡镇痛效应显著下降(P<0.001),同时导致脊髓背角GIRK1(22.45±10.58vs.62.83±20.80,P<0.001)和GIRK2(23.67±8.78 vs.50.17±11.05,P=0.001)表达显著降低。荧光双染显示,PKCε与GIRK1和GIRK2在脊髓背角共染。鞘内注射εV1-2可以有效抑制吗啡耐受的形成(P<0.001),且抑制吗啡诱导的GIRK1(54.50±10.37 vs.19.33±9.48,P<0.001)和GIRK2(39.83±6.24 vs.15.83±9.58,P=0.001)表达降低。【结论】脊髓背角GIRK1和GIRK2下调与吗啡耐受密切相关,PKCε是吗啡诱导GIRK1和GIRK2下调的重要原因。

SF3B1/FOXM1信号通路调控细胞周期干预宫颈癌进展的机制研究

目的:基于剪接因子3B亚单位1(splicing-factor-3B-subunit-1,SF3B1)/叉头框蛋白M1(Forkhead Box M1,FOXM1)轴探讨调控细胞周期宫颈癌进展的作用机制。方法:通过转染SF3B1过表达质粒(SF3B1 overexpression plasmid,pSF3B1)和2个SF3B1特异性短发夹RNA(short hairpin RNA)(shSF3B1-1、shSF3B1-2)过表达HeLa细胞或敲低SiHa细胞SF3B1。通过试验和乙炔基-2'-脱氧尿苷分析细胞的增殖活力和增殖率。流式细胞术分析细胞周期分布。应用细胞周期聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)阵列分析、流式细胞术、染色质免疫共沉淀-定量聚合酶链式反应(chromatin immunoprecipitation-quantitative polymerase chain reaction,ChIP-qPCR)和荧光素酶实验明确SF3B1和FOXM1的靶向关系。结果:SF3B1过表达后,HeLa细胞的生长率和增殖能力均显著增加(P<0.05)。此外,SF3B1敲低后,SiHa细胞的生长率和增殖能力均显著降低(P<0.05)。在HeLa细胞中,与pENTER组相比,pSF3B1组细胞在细胞周期的G_(0)/G_(1)期降低。然而,在SiHa细胞系中,敲低SF3B1提高了G_(0)/G_(1)期比率。此外,SF3B1过表达促进了HeLa细胞中G_(1)期相关蛋白细胞周期蛋白D1表达,而敲低SF3B1抑制了SiHa细胞中周期蛋白D1表达。上调SF3B1表达明显增强FOXM1的表达,而下调SF3B1导致FOXM1的明显抑制。ChIP-qPCR分析进一步显示SF3B1在HeLa细胞系中与FOXM1启动子位点结合。在野生型FOXM1启动子中,与shNC组相比,荧光素酶活性在SF3B1敲低组中受到抑制(1.30±0.08 vs.0.73±0.02、0.70±0.04,均P<0.01),突变型FOXM1启动子不能在SiHa细胞中引发对shSF3B1的应答。HeLa细胞的增殖能力通过SF3B1过表达而增强(shNC+pENTER vs.shNC+pSF3B1:25.1±1.9 vs.61.2±3.8,P<0.01),并被shFOXM1降低(shNC+pSF3B1 vs.shFOXM1+pSF3B1:61.2±3.8 vs.18.5±1.9,P<0.001),并且SF3B1过表达诱导的细胞G_(0)/G_(1)周期降低通过敲低FOXM1而部分逆转(shNC+pSF3B1 vs.shFOXM1+pSF3B1:35.0±1.5 vs.58.0±1.8,P<0.05)。结论:SF3B1可以作为宫颈癌中的潜在肿瘤促进基因,其可能通过上调FOXM1的表达来促进宫颈癌细胞增殖并扰乱细胞周期。

大鼠海马NMDA受体NR1亚单位蛋白的基础表达量与学习记忆相关

目的 :探讨大鼠海马 N-甲基 - D-门冬氨酸 (NMDA)受体 NR1亚单位蛋白表达水平与学习记忆的关系。方法 :用新事物识别模型 (novel object recognize model)和 Morris水迷宫 ,分析 SD大鼠的新事物探究能力和空间学习能力 ,根据指标最强的 2 0 %和最弱的 2 0 % ,分别选取新事物探究能力强和弱 2组 ,以及空间学习能力强和弱 2组。分离制备上述各组大鼠海马的膜蛋白 ,用 NR1亚单位特异性抗体作免疫印迹分析 ,测定 NR1亚单位蛋白的含量。结果 :新事物探究能力强组大鼠海马的 NR1亚单位蛋白含量比弱组高 6 0 % (P<0 .0 1) ,空间学习能力强组大鼠海马 NR1亚单位蛋白含量比弱组高 4 5 .4 % (P<0 .0 5 )。结论 :大鼠海马 NMDA受体 NR1亚单位蛋白的基础表达量与新事物探究能力和空间学习能力相关。

缺氧对大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位磷酸化的影响

目的观察缺氧模型大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位酪氨酸磷酸化的变化。方法成年大鼠置于模拟海拔5500m高度的低压氧舱内,每天缺氧8h,分别缺氧3、7、14d和21d。采用免疫组化、Western blot+免疫共沉淀方法检测皮层、海马NR1及其酪氨酸磷酸化的变化。结果免疫组化显示缺氧皮层、海马NR1表达都明显高于对照组(P<0.01)。Western blot检测进一步证明NR1的表达显著高于对照组(P<0.01),且随着缺氧时间的延长而增加。缺氧各组酪氨酸磷酸化水平亦显著高于对照组(P<0.01),缺氧14d后酪氨酸磷酸化达到最高峰,而后开始下降,21d时仍显著高于对照组(P<0.01)。结论高原缺氧条件下大鼠皮层、海马NMDA受体NR1亚单位表达及酪氨酸磷酸化水平显著增加,酪氨酸磷酸化的变化可能是影响NMDA受体功能的主要原因。

人Na^+、K^+-ATPase α1亚单位M1～M2膜外区片段结合活性的研究

目的研究包含人Na+、K+-ATPaseα1亚单位M1～M2膜外区的多肽片断(HES1衍生物),是否具有与哇巴因结合的能力。方法采用Fmoc固相合成法进行多肽合成,产物经HPLC纯化,并进行质谱分析。然后采用放射性配体受体结合法检测其与哇巴因的结合能力。结果人Na+、K+-ATPaseHES1衍生物与3H-哇巴因具有一定的结合能力。3H-ouabain与Na+,K+-ATPaseHES1衍生物结合的平衡解离常数为24.58nmol·L-1,受体密度为492.43fmol·mg-1蛋白。IC50=3.078×10-7mol·L-1。结论人Na+、K+-ATPaseHES1衍生物具有与哇巴因结合的活性,为其作为一种新型药物奠定实验基础。

单眼斜视和剥夺猫视皮质17区N-甲基-D-天冬氨酸受体1亚单位的表达

目的 :探讨敏感期内单眼斜视 (monocularstrabis mus,MS)和单眼剥夺 (monoculardeprivation ,MD)幼猫视觉系统中有可塑性变化的N 甲基 D 天门冬氨酸受体 1亚单位 (N methyl D aspartatereceptor 1 subunit,NMDAR 1)基因的表达规律 ,为临床防治斜视 (MS)和剥夺性弱视 (MD)提供参考依据。方法 :以 6导程图形视觉诱发电位仪 (6 channel patternvisualevokedpotential,6CPVEP)检测MS和MD弱视的形成 ,应用生物素过氧化物酶标记链酶卵白素复合物 (strept avidinbiotin peroxidaecomplex,SABC)技术处理NMDAR 1单克隆抗体标记的正常 (normal)组、MS组及MD组幼猫的同侧视皮质 17区组织连续切片 ,照相观察并行计算机图像分析和t test处理。结果 :视皮质 17区可见NMDAR 1免疫阳性神经元呈棕褐色 ,神经元胞浆及轴突、树突着色 ,但轴突更明显 ,核色淡或空染 ,具有明显的突触形态学特征。它主要分布在Ⅱ /Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ层。比较各组猫视皮质 17区Ⅳ层NMDAR 1免疫阳性细胞染色浓度和数密度 ,MS、MD与N组比较 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1) ,MS组和MD组幼猫视皮质 17区的NMDAR 1与正常组相比 ,其活性 (染色浓度 )减弱 ,数量明显减少。结论 :①敏感期内 ,单眼斜视和剥夺猫视皮质 17区神经元NMDAR 1表达表现?

L型钙通道_α1C亚单位在成年大鼠心脏中的表达

目的研究L型钙通道α1C亚单位在成年大鼠心脏中的空间表达情况。方法制备成年大鼠心脏冰冻切片,结合大体位置和HE染色结果快速辨认出窦房结、房室结和结后延伸。采用免疫荧光和免疫印迹技术检测L型钙通道α1C亚单位在大鼠窦房结、房室结、结后延伸、右房、右室的表达,用共聚焦显微镜观察其表达部位,通过凝胶成像及图像分析系统对实验结果进行分析。结果荧光呈现点状、斑状或不规则的短线状,主要分布于细胞膜及细胞内的膜性结构,其荧光强度由弱到强依次为窦房结、房室结、结后延伸、右心房、右心室,房室结和结后延伸之间无显著性差异(P>0.05),其余两两相比均有显著差异(P<0.05),其中右心房、右心室明显强于窦房结、房室结和结后延伸(P<0.01)。各部位在相对分子质量200000左右可见一特异性蛋白条带。对蛋白条带进行灰度值分析,结果与免疫荧光相一致。结论L型钙通道α1C亚单位在成年大鼠心脏分布广泛,在不同部位表达量不同,在工作肌组织的表达量明显高于传导组织,提示钙电流在心脏不同部位有不同的分子基础。

百日咳毒素S1亚单位的表达及其免疫原性研究

目的 研究百日咳毒素S1(Pertussis toxin s1 subunit)亚单位在大肠杆菌中的表达及其免疫学特性。方法 采用PCR法从百日咳杆菌染色体中获得S1亚单位的结构基因并克隆到质粒pCR2.1-TOPO中,转化宿主菌DH5α和TOPO10。用抗S1的单抗1B7检测表达产物。用粗制的重组S1(rS1)免疫小鼠,做主动免疫保护实验。rS1免疫家兔,检测rS1的免疫原性。并以家兔免疫血清在小鼠进行被动免疫保护实验。结果 rS1可在大肠杆菌中稳定高效表达,表达量分别占细胞总蛋白量的14％(DH5α)和24.2％(TOPO10)。rS1能被1B7识别,在小鼠主动免疫实验中,保护率可达56.3％。家兔免疫血清ELISA效价为1:32 000。抗rS1血清对小鼠被动的免疫保护率为100％。结论 rS1具有良好免疫原性,为百日咳基因工程疫苗或亚单位疫苗研制及百日咳免疫机理研究提供了依据。

Dravet综合征患儿临床表型与神经元钠离子通道α1亚单位基因突变的相关性分析

目的探讨神经元钠离子通道α1亚单位(SCN1A)基因突变阳性的Dravet综合征患儿的临床表型特点,从而了解Dravet综合征患儿的病变程度与SCN1A基因突变的相关性。方法回顾性分析2014年1月至2017年1月在海南省农垦三亚医院小儿门诊就诊的43例Dravet综合征患儿及其家系成员的临床资料和SCN1A基因检测结果,以及患儿的心电图、脑电图及核磁共振检查结果。结果 31例Dravet综合征患儿发现SCN1A基因突变阳性,突变类型包括错义突变,移码突变、大片段缺失。SCN1A^+组患儿发病年龄为(4.32±0.84)月,小于SCN1A^-组(t=2.354;P<0.05)。1岁前月发作频率SCN1A^+组为3.24±1.13,而SCN1A^-组为1.77±0.45(t=2.435;P<0.05)。SCN1A^+组患儿1年内发生癫痫持续状态次数明显高于SCN1A^-组(t=2.311;P<0.05)。SCN1A^+组中19例患儿出现不同程度的智力减退,而SCN1A^-组中3例患儿出现智力减退(P<0.05)。SCN1A^+组中16例患儿EEG出现背景弥漫性慢波活动,21例为多棘慢波。SCN1A^-组中,2例患儿EEG出现背景弥漫性慢波活动,3例为多棘慢波,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究表明,相比于SCN1A^-组,SCN1A^+组Dravet综合征患儿发病年龄小,1月前发病次数及平均每年发生癫痫持续状态次数多,智力减退患儿比例大,以及脑电图出现背景弥漫性慢波活动、多棘慢波等异常活动比例大。

百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。

百日咳杆菌毒素S_1亚单位与谷胱甘肽S-转移酶融合基因在大肠杆菌中表达及其一步纯化

研究了百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位与谷胱甘肽Ｓ－转移酶融合蛋白（ＧＳＴ－Ｓ１）在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达，并一步纯化了重组ＧＳＴ－Ｓ１。首先用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增出长度为５６０ｂｐ的编码百日咳毒素Ｓ１亚单位的ＤＮＡ片段。该片段比原编码Ｓ１蛋白的ＤＮＡ片段在其３′端缺失了１３８个碱基，将其按正确的阅读框克隆入质粒ｐＧＥＸ中ＧＳＴ基因的３′端，构成ＧＳＴ－Ｓ１融合基因表达载体ｐＧＥＸ－Ｓ１。经异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达和十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ），可见所表达的ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白存在于细菌上清，为可溶性蛋白。分子量为４９ｋｕ处有明显的蛋白表达带。用谷胱甘肽（ＧＳＨ）亲和层析系统，一步纯化出ＧＳＴ－Ｓ１融合蛋白。最后经凝血酶的消化，得到２３ｋｕ的重组百日咳杆菌毒素Ｓ１亚单位蛋白。

人类T型钙通道α_(1H)亚单位基因在细胞增殖中的功能研究

将人类T型钙通道α1H 亚单位基因 (CACNA1H)cDNA转染到HEK 2 93(humanembroyonickidney)细胞系得到稳定过量表达的细胞株 ,以此为体外模型来研究T型钙通道在细胞增殖中的直接作用。RT -PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α1H 亚单位的过量表达。生长曲线结果表明 ,T型钙通道α1H 亚单位基因的过量表达能显著促进HEK - 2 93细胞增殖 ,将细胞群体倍增时间从对照细胞的 2 2 1± 1.1h缩短到稳定转染细胞的 14 0± 0 .4h ,细胞群体倍增时间缩短了约 8h ;流式细胞分析结果表明 ,在稳定转染细胞处于S期的细胞百分率比对照细胞高 ,相反地处于G1 期的百分率比对照细胞低 ,以上结果证明了过量表达T型钙通道亚单位α1H 基因能促进细胞增殖。Western印迹结果提示 ,T型钙通道α1H 亚单位基因表达产物是通过某种信号途径 ,提高了与细胞周期有关基因 (CDK2、cyclinA和cyclinE)的蛋白质表达水平 ,从而刺激了细胞周期的进程。

鸭疫里默氏杆菌ATP合成酶F1亚单位α亚基的部分生物学特性研究

为筛选和鉴定鸭疫里默氏杆菌(RA)的感染相关蛋白,本研究采用血清1型RA CH3株活菌和灭活菌体免疫鸭的阳性血清分别与血清2型Th4株的全菌蛋白进行交叉免疫蛋白质组学分析,结果表明ATP合成酶F1亚单位α亚基(ATP-F1-α)、Gro EL蛋白和TPR repeat-containing protein等的抗体仅存在于活菌免疫鸭的血清中,推测其可能为感染相关的交叉性抗原;而Tbd R1的抗体在活菌和灭活菌免疫鸭的血清中均存在。利用自杀质粒同源重组的方法构建了ATP-F1-α的基因缺失株,并将其与野生株CH3的生长曲线进行比较。结果表明,缺失株菌体形态与野生株相似,但其在TSB培养基中的生长几乎停滞。以上结果表明RA ATP-F1-α既是一种交叉抗原,又与细菌的生长相关。

三叉神经痛大鼠中钙通道α2δ-1亚单位表达的变化

目的研究大鼠眶下神经结扎后钙通道α2δ-1亚单位(Cavα2δ-1)表达的变化,探讨Cavα2δ-1与三叉神经痛的关系。方法将12只SD大鼠随机分为神经结扎组和假手术对照组,每组6只。用铬肠线轻松结扎神经结扎组大鼠的眶下神经,建立三叉神经的神经病理性疼痛动物模型;假手术对照组仅暴露神经,不结扎。术前1 d,术后第3、6、9、12、15天测定机械刺激反应阈值。术后第15天收集三叉神经节(TG)和三叉神经脊束核尾侧亚核及颈段第一、二脊髓背侧角(Vc/C2)组织,采用Western印迹杂交法测定Cavα2δ-1蛋白浓度。结果神经结扎组大鼠术侧机械刺激反应阈值在术后逐渐降低,与术前比较,术后第9、12、15天机械刺激反应阈值差异有统计学意义(P<0.05)。术后第15天神经结扎组术侧TG和Vc/C2中Cavα2δ-1表达明显上调(P<0.01)。结论 Cavα2δ-1参与了大鼠三叉神经痛的发生发展,为进一步探讨三叉神经痛发病机制提供实验基础。

老年癫痫大鼠海马NMDA受体亚单位1mRNA表达的研究

目的 研究老年癫痫大鼠海马 NMDA受体亚单位 1 (NMDAR1 ) m RNA表达的变化 ,为进一步探明癫痫发病及损伤的分子生物学机制奠定基础。方法 采用在立体定位仪将海人酸注射至老年大鼠杏仁核制备癫痫模型。将老年大鼠随机分为正常对照组 ,假手术组及致癫痫组 ,分别于不同时间取材 ,进行脑组织 NMDAR1 m RNA原位杂交检测。结果 正常海马各区均有极少量的 NMDAR1 m RNA阳性细胞分布 ;致癫痫组NMDAR1 m RNA水平显著高于正常对照组及假手术组 (P<0 .0 1 )。结论 大鼠海马各区都存在着 NMDAR1 m RNA不同程度的表达 ,癫痫后老年大鼠海马 NMDAR1 m RNA的表达水平上调。

T型钙通道α_(1G)亚单位在细胞增殖中的功能研究

利用稳定过表达人类T型钙通道α_(1G)亚单位的HEK-293细胞研究了T型钙通道在细胞增殖中的作用。RT-PCR和标准全细胞膜片钳记录分别从mRNA转录水平和T型钙通道蛋白功能水平验证了α_(1G)单位的过表达的实现。生长曲线表明,T型钙通道α_(1G)亚单位的过表达能显著促进细胞增殖,HEKα_(1G)^+细胞的细胞群体倍增时间(13.7±0.3h)比对照HEK-293细胞的细胞群体倍增时间(22.1±1.1h)缩短了约8h;流式细胞分析结果也与此吻合,在稳定过表达了人类T型钙通道α_(1G)亚单位的细胞处于S期的细胞百分率比对照HEK-293细胞高,相反地处于G_0/G_1期的百分率比对照HEK-293细胞低,以上结果证明过表达T型钙通道α_(1G)亚单位能促进细胞增殖;T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制HEKα_(1G)^+细胞增殖,IC_(50)为3.5/μmol/L,表明在HEK-293细胞过表达T型钙通道对细胞增殖的促进作用可以被T型钙通道特异性阻断剂mibefradil抑制,这就进一步证明了T型钙通道在促进细胞增殖方面的直接作用。Western杂交结果提示了T型钙通道α_(1G)亚单位的表达是通过某种信号途径提高了与细胞周期有关的蛋白质,cyclin A、cyclin E和CDK2的表达水平,从而刺激了细胞周期的进程。本研究有助于理解细胞增殖的机制并为开发治疗与细胞增殖异常有关疾病的新药提供了理论依据。