基于蛋白质组学探讨Ppp3cb和Ppm1g在NHE1基因敲除模型鼠海马组织中的表达

目的通过NHE1基因敲除模型鼠的海马组织差异蛋白质组学分析,发现并明确Ppp3cb和Ppm1g的表达特征。方法①选取6只2周龄NHE1基因敲除模型鼠作为模型组,同周龄野生型小鼠6只作为对照组,采用琼脂糖凝胶电泳检测其基因型;应用旷场实验和强迫游泳实验对模型组和对照组小鼠进行行为学评估,并按照Racine评分标准对模型鼠进行癫痫发作分级;②通过串联质谱分析技术对模型组和对照组的海马组织进行差异蛋白筛选,基因本体论(Gene Ontology Analysis,GO)分析差异蛋白并进行注释和富集,蛋白网络数据库(search tool for the retrieval of interesting genes,STRING)分析差异蛋白之间的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI);③应用qPCR和Western blot检测Ppp3cb和Ppm1g的转录和翻译水平,应用免疫组织化学技术分别观察其在组织中的表达量。结果①模型组小鼠NHE1基因未见表达,旷场实验中模型鼠的运动总距离较对照组减少(P=0.0073),跨越的格子数比对照组显著减少(P<0.0001)。强迫游泳实验结果显示,模型鼠不动的时间明显延长(P<0.0001);②以表达倍数(FC)≥1.2倍且P<0.05为筛选标准,检测到海马组织中845个差异表达的蛋白质点,其中有9个蛋白表达上调,7个蛋白表达下调。其中Ppp3cb下调,Ppm1g上调。GO功能注释结果表明,NHE1敲除后,分子功能(MF)富集在蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的差异最显著,细胞成分(CC)富集在质膜部分的差异蛋白数量最多,生物过程(BP)富集在负向调节生物过程、免疫系统过程的差异蛋白数量最多。STRING分析显示差异蛋白Ppp3cb和Slc9a1直接作用,Ppm1g通过Ppp3cb和Slc9a1间接作用,Ppp3cb和Ppm1g之间相互作用。③Ppp3cb的转录和翻译水平减少,在组织中的表达量下降,而Ppm1g转录和翻译水平增加,在组织中的表达量上升(P<0.05)。结论本研究确定了NHE1基因敲除小鼠海马组织中差异蛋白Ppp3cb表达下调,而Ppm1g表达上调,为进一步研究Ppp3cb和Ppm1g参与癫痫发病机制提供了依据。

达格列净保护PDK1基因敲除心衰小鼠表达谱系研究

目的探讨钠-葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂达格列净(DAPA)对3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK1)基因敲除心力衰竭(HF)小鼠中长链非编码RNA(lncRNA)表达谱的影响。方法将PDK1敲除HF小鼠分为对照组(KO组,n=10)和达格列净治疗组(KO+DAPA组,n=15);使用Arraystar小鼠lncRNA微阵列通过测序和筛选分析lncRNA表达谱;实时定量PCR验证差异表达的LncRNA;构建lncRNA-mRNA共表达网络。结果KO+DAPA组显著延长HF小鼠生存期;两组表达水平变化>1.5倍lncRNAs有2653个;生信分析表明lncRNAs参与能量代谢过程;差异表达大于3倍以上且人鼠同源的7个LncRNAs构建lncRNA-mRNA共表达网络提示uc.347和uc.321分别关联141个mRNA和108个mRNA;uc.347在心肌细胞中的过表达促进了ATP能量的产生。结论本研究揭示了达格列净影响PDK1基因敲除心衰小鼠lncRNA表达谱,差异表达的LncRNA可能参与能量代谢过程,从而改善心衰预后。

三十日龄Fmr1基因敲除小鼠的水迷宫实验观察

目的实验对30日龄的Fmr1基因敲除(KO)小鼠的经典Morris水迷宫实验进行观察。方法采用Morris水迷宫实验,测试1月龄KO小鼠与WT小鼠的学习记忆功能。水迷宫实验共训练4 d,记录每天的潜伏期与游泳轨迹,第5天去除平台,记录小鼠停留各象限的时间百分比。根据所获得的数据进行多因素方差分析处理。结果①空间航行实验第1天至第3天实验中KO鼠与WT鼠的潜伏期和穿越平台次数差异无统计学意义(P>0.05);在第4天实验中KO鼠的潜伏期和穿越平台次数比WT鼠差异有统计学意义(P<0.05)。②空间搜索实验4周龄WT鼠在目标象限停留时间比其它象限停留时间长;4周龄KO鼠在第二象限停留时间长。结论 30日龄KO小鼠存在认知功能障碍。

GSK3抑制剂氯化锂对FMR1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用

目的:探讨GSK3抑制剂氯化锂对FMR1基因敲除小鼠的自主活动的干预作用及机制。方法:通过对90只30日龄FMR1基因敲除小鼠连续腹腔注射不同剂量氯化锂5d,行自主活动行为学实验,观察能否改善KO鼠的过度活动的表型;同时利用免疫印迹技术检测KO及WT鼠的海马和皮层的GSK3β和P-GSK3β的变化。结果:在自主活动行为学实验中,KO鼠的活动次数比WT鼠的活动次数增多而站立次数比WT鼠减少,差异具有统计学意义(P<0.05);使用氯化锂后,KO鼠的活动次数明显减少及站立次数明显增多,差异均有统计学意义(P<0.05);免疫印迹实验结果:KO鼠P-GSK3β表达比WT鼠少,用氯化锂后,KO鼠P-GSK3β的表达增多。KO鼠和WT鼠使用氯化锂后,总的GSK3β无明显改变(P>0.05)。结论:GSK3β的抑制剂氯化锂能改善KO鼠的活动过度的表型,可能与氯化锂导致的P-GSK3β的表达增加有关,对FMR1基因敲除小鼠有治疗作用。

30日龄FMR1基因敲除小鼠的旷场行为观察

目的观察30日龄FMR1基因敲除小鼠的旷场行为进行。方法在旷场实验中采取4个区域分割采用VIEWER软件及目测对30日龄的FMR1基因敲除小鼠和野生型小鼠进行旷场行为观察,数据采用多因素方差分析处理。结果采用VIEWER软件分析发现:FMR1基因敲除小鼠在第4区域的停留时间、运动长度、进入格次数、伸头较野生型小鼠显著增加,而在在第1区域的Tailmoves较野生型小鼠显著减少,FMR1基因敲除小鼠在各区的速度,站立不动与野生型小鼠无明显差别。FMR1基因敲除小鼠在第3区域的运动长度和进入格次数也较野生型小鼠显著增加,FMR1基因敲除小鼠在第2区域和第3区域的点头较野生型小鼠显著增加,P<0.05。采用目测分析发现:FMR1基因敲除小鼠在第4区域进入次数较野生型小鼠增加(P<0.05),FMR1基因敲除小鼠跨线次数较野生型小鼠显著增加,P<0.05。结论30日龄FMR1基因敲除小鼠的行为异常,运动性和兴奋性较野生型小鼠增高。采用VIEWER软件较目测更更加灵敏、客观、准确。

PCR方法在HSF1基因敲除小鼠基因型分析中的应用

目的 为HSF1基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法 设计两对引物扩增野生型HSF1基因和HSF1缺陷突变基因的DNA片段 ,用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度 ,并将所得基因型结果与经典的Southernblot方法比较。结果 野生型仅在 5 6 2bp处有一条条带 ,突变纯合子仅在 377bp处有一条条带 ,杂合子则在377bp和 5 6 2bp处出现两条条带。用PCR方法获得的HSF1基因分析结果与经典的Southernblot方法获得的结果完全一致。结论 用PCR方法分析HSF1基因敲除鼠的基因型具有快速、简单。

利用IGF-1基因敲除鼠乳腺癌模型研究IGF-1对血管生成的影响

目的探讨在低血清胰岛素样生长因子-1(IGF-1)水平与正常IGF-1水平的小鼠乳腺癌模型中应用血管生长抑制剂人参皂甙(GS)Rg3后,IGF-1对血管生成的影响。方法应用7,12-二甲基苯蒽(DMBA)诱导肝脏特异性IGF-1基因敲除鼠(LID鼠)及对照鼠建立原发乳腺癌模型,应用GSRg3进行干预治疗,利用免疫组化法检测乳腺癌组织中血管内皮生长因子(VEGF)和Ⅷ因子相关抗原(F8-RAg)表达水平,同时利用基因芯片技术检测小鼠乳腺癌及正常乳腺组织中相关基因的表达情况。结果LID鼠乳腺癌的发生率低于对照鼠(P<0.05);LID鼠乳腺癌组织中VEGF表达水平与微血管密度均低于对照组(P<0.05)。LID鼠乳腺癌组织中IGF-1、成纤维细胞生长因子(FGF)-1、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子(TGF)-β1基因较对照组上调,成纤维细胞生长因子受体(FGFR)-2、血小板源性生长因子(PDGF)-A和PDGF-B基因较对照组下调;应用GSRg3后,LID鼠乳腺癌组织中VEGFa、表皮生长因子(EGF)、表皮生长因子受体(EGFR)、PDGF-A和FGFR-2基因较对照组上调,而IGF-1和TGF-β1基因较对照组下调。结论IGF-1促进小鼠乳腺癌的发生、发展,且与血管生长密切相关。血管生长抑制剂可能通过IGF-1及TGF-β1发挥抗肿瘤作用。

Fmr1基因敲除小鼠的听源性惊厥行为的观察

目的对不同年龄Fmr1基因敲除小鼠的听源性惊厥行为观察。方法使用PCR技术对Fmr1基因敲除小鼠鉴定后对不同周龄的Fmr1基因敲除小鼠和野生型小鼠进行听源性惊厥的观察,数据采用多因素方差分析处理。结果经PCR技术证实脆性X综合征小鼠模型是Fmr1基因敲除小鼠。Fmr1基因敲除小鼠在中央区的惊厥阈值较野生型小鼠显著短。Fmr1基因敲除小鼠鼠受声音刺激后表现为惊恐、奔跑明显的AGS前驱表现,最后发生跌倒、惊厥,呈角弓反张状,最后恢复活动能力或者反复发作,或者导致死亡。结论 Fmr1基因敲除小鼠的行为异常,其兴奋性较野生型小鼠增高。

30日龄Fmr1基因敲除小鼠的避暗实验观察

目的实验对30日龄的Fmr1基因敲除小鼠的避暗实验进行观察。方法采用30 d龄的KO鼠和WT鼠分别连续进行2 d的避暗实验,根据所获得的数据进行多因素方差分析处理。结果 KO鼠的电击次数与WT鼠相比显著增多,具有统计学意义P<0.05,潜伏期只有第2天雄性相比显著(P<0.05),其他均无明显差异;同周龄KO鼠潜伏期比WT鼠明显少(P<0.05);而KO鼠的错误次数比WT鼠明显多(P<0.05);不同周龄KO鼠或WT鼠的潜伏期、错误次数无差异(P>0.05);第1天KO鼠的潜伏期和错误次数与第2天相比无差异(P>0.05);第1天WT鼠的潜伏期和错误与第2天相比有差异(P<0.05)。结论 30日龄Fmr1基因敲除小鼠的认知能力相对低下。

C57BL/6小鼠PD-1基因敲除后心房肌细胞氧化应激水平和心房结构重构研究

目的 PD-1基因敲除后会激活T细胞并提高机体炎症水平并可能影响机体氧化应激水平,本研究旨在观察C57BL/6小鼠在PD-1基因敲除后心房细胞氧化应激水平变化及其对小鼠心房结构重构的影响。方法我们同时对两组动物进行了观察:C57BL/6小鼠和C57BL/6-PD-1-/-小鼠。对比观察两组心房肌细胞氧化应激水平和心房肌心肌纤维化水平。结果和对照组相比较,C57BL/6-PD-1-/-小鼠心房肌细胞细胞内活性氧水平明显升高,同时心房肌Masson染色显示基因敲除后心房肌出现了纤维化,而对照组没有出现。结论 PD-1基因敲除后出现心房肌细胞活性氧水平的升高并导致了C57BL/6小鼠的心房结构重构。

氯化锂对FMR1基因敲除小鼠的高架十字迷宫行为的干预作用

目的探讨糖原合成酶激酶3(GSK3)抑制剂氯化锂对FMR1基因敲除(KO)小鼠的高架十字迷宫行为的干预作用及机制。方法给90只30日龄FMR1基因敲除小鼠连续5d腹腔注射不同剂量的氯化锂,用药第6天进行高架十字迷宫行为学实验,通过录像机录像,然后用Smart软件分析录像,观察能否改善KO鼠的高架十字迷宫的表型;同时通过免疫印迹技术检测KO及野生型(WT)鼠的海马和皮层中GSK3β和磷酸化GSK3β(p-GSK3β)的变化。结果在高架十字迷宫实验中,与WT组小鼠比较,KO组小鼠的运动性、兴奋性、探索性明显增强,且KO组小鼠在开放区域的活动时间、次数以及路程均明显高于WT组。KO鼠用氯化锂后,在开放区域的活动时间、次数以及路程均减低,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫印迹实验结果显示,KO鼠p-GSK3β表达比WT鼠少;用氯化锂后,KO鼠p-GSK3β表达增加。WT鼠用氯化锂后,开放区域活动时间、次数以及路程有较少改善,p-GSK3β表达也有增加。未使用氯化锂的KO鼠与WT鼠相比,总GSK3β表达无明显差异,KO鼠和WT鼠使用氯化锂后,总GSK3β无明显改变,P>0.05。结论 GSK3β的抑制剂氯化锂能改善KO鼠的高架十字迷宫表型,对KO鼠有治疗作用,其机制可能与氯化锂导致的p-GSK3β表达增加有关。

N-3不饱和脂肪酸对C57BL/6 PD-1基因敲除小鼠心房结构重构的影响

目的观察N-3不饱和脂肪酸饲养对C57BL/6-PD-1^(-/-)小鼠心房细胞氧化应激水平变化及心房结构重构的影响。方法流式细胞仪检测心房肌细胞活性氧,比较C57BL/6小鼠、C57BL/6-PD-1^(-/-)小鼠和、N-3不饱和脂肪酸饲养的C57BL/6-PD-1^(-/-)小鼠(每组10只,雄性,6-8周龄)的心房肌细胞氧化应激水平,Masson染色检测心房肌纤维化水平,电子天平称重检测心脏/体质量比值变化。结果与C57BL/6小鼠比较,C57BL/6-PD-1^(-/-)小鼠心房肌细胞细胞内活性氧水平明显升高(P<0.05),心房肌Masson染色显示基因敲除后心房肌出现了明显纤维化、心脏/体质量比值明显升高(P<0.001),N-3不饱和脂肪酸饲养后的C57BL/6-PD-1^(-/-)小鼠心房肌细胞内活性氧水平(P<0.05)及心房肌纤维化、心脏/体质量比值(P<0.01)升高趋势得到明显遏制。结论 PD-1基因敲除C57BL/6小鼠的心房肌细胞活性氧水平升高,同时出现了的心房结构重构,N-3不饱和脂肪酸饲养能够遏制这种变化趋势。

Fmr1基因敲除小鼠的ABR阈值观察

目的对不同周龄的KO与WT小鼠听阈进行检测并对比,了解KO小鼠的听阈变化。方法采用PCR法鉴定FMR1基因敲除型(KO)纯合子(-/-)及其野生型(WT)纯合子(+/+)FVB近交系小鼠,实验动物150只分两组:(1)KO组(3、4、6、8、10周龄,每周龄15只,共75只;②WT组(3、4、6、8、10周龄,每周龄15,共75只,用于听性脑干反应(ABR)测试。数据及图像的采集:以ABR图形中Ⅱ波的阈值为小鼠的ABR阈值。结果 ABR阈值:3周及4周年龄组小鼠各基因型间KO小鼠的ABR阈值显著高于WT小鼠,差异有统计学意义(P<0.01);6、8、10周各组中各基因型小鼠的KO小鼠和WT小鼠的ABR阈值的差异无统计学意义(P>0.05)。结论幼年期FMR-1 KO小鼠听阈提高,成熟期FMR-1 KO小鼠听阈无异常,KO小鼠ABR的结果与AGS发生的年龄依赖性相一致。

30日龄Fmr1基因敲除小鼠的自主活动观察

目的 对30日龄的Fmr1基因敲除小鼠的自主活动进行观察.方法 采用30日龄的KO鼠和WT鼠分别连续进行2天的自主活动实验,根据所获得的数据进行多因素方差分析处理.结果 通过第1天的学习与第2天的记忆再现,在自主活动实验中,与WT鼠相比,KO鼠在自主活动实验中的活动和站立次数均增多,具有统计学意义（P＜0.05）,粪便数相比无明显差异.结论 30日龄Fmr1基因敲除小鼠的自主活动异常,运动性和兴奋性较野生型小鼠增高.

中医药抗帕金森病理想的动物模型—Nurr1基因敲除小鼠

简述帕金森病(PD)动物模型研究的发展简史,对各种PD动物模型的优、缺点进行了评价。介绍Nurr1基因敲除模型、PD的修正疗法及中医药可能的神经保护作用。总结Nurr1基因敲除模型具有症状相类性、病理一致性、慢性进行性、可早期神经保护介入及药物作用的可能靶点等特点,可作为中医药抗帕金森病研究理想的动物模型。

电针、手针长强穴对FMR1基因敲除小鼠学习记忆能力的影响

目的观察电针、手针长强穴对FMR1基因敲除小鼠学习记忆能力的影响。方法用Morris水迷宫实验测试电针、手针长强穴对FMR1基因敲除小鼠的学习记忆功能。结果①空间航行实验,手针组比电针组差异具有统计学意义(P<0.05);②空间搜索实验,各象限无明显差异,FMR1基因敲除小鼠在电针干预后,在2、3象限停留的时间比其它2个象限长。结论手针长强穴能提高FMR1基因敲除小鼠的学习和记忆能力。

GSK3抑制剂氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠痛觉敏感性的影响

目的:探讨氯化锂对Fmr1基因敲除小鼠(KO鼠)痛觉敏感性的影响及机制。方法:8周龄KO鼠及野生型(WT鼠)小鼠第1天测定热刺激缩足反射潜伏期(paw withdraw thermal latency,PWTL)值作为基础痛阈,第2～5天腹腔注射氯化锂后测定PWTL值,第6天给药后取脊髓腰骶膨大段组织,通过免疫组化及Western blot检测实验小鼠脊髓GSK3β和P-GSK3β水平的变化。结果:KO鼠的PWTL值比WT鼠明显升高。使用氯化锂后,KO鼠PWTL值恢复至WT鼠水平。KO鼠脊髓P-GSK3β表达较WT鼠明显减少。使用氯化锂后,KO鼠脊髓P-GSK3β表达增多。结论:KO鼠热痛觉敏感性降低。KO鼠脊髓P-GSK3β表达减少可能是KO鼠热痛觉敏感性降低的原因之一;氯化锂可能通过增加脊髓中P-GSK3β的表达而改善KO鼠热痛觉敏感性。

Fmr1基因敲除小鼠大脑的磁共振波谱研究

目的探讨氢质子磁共振波谱成像(~1H-MRS)测定Fmr1基因敲除小鼠(KO小鼠)脑内代谢物的变化及诊断价值。方法 23只4月龄KO小鼠(实验组)和16只野生型FVB小鼠(WT小鼠,对照组)采用3.0T高场强MRI行~1H-MRS,测量小鼠大脑皮质与海马区N-乙酰天门冬氨酸(NAA)、胆碱(Cho)和肌酐(Cr)的峰下面积,计算NAA/Cr和Cho/Cr比值并进行两样本均数t检验。结果与对照组比较,实验组小鼠NAA/Cr比值明显降低(t=-5.912,P<0.01),Cho/Cr比值明显升高(t=3.888,P<0.01)。结论~1H-MRS能定量测定KO小鼠脑内代谢物(细胞膜代谢)异常,可能为诊断及评价脆性X综合征疗效提供重要依据。

PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系的建立

目的:建立PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系,为PLEKHQ1基因功能的研究奠定基础。方法:用慢病毒感染的方法将包装质粒pCDH-SV40/GFP导入野生型和PLEKHQ1基因敲除小鼠的骨髓来源巨噬细胞,建立永生化细胞系;观察永生化细胞的生物学性状,用聚合酶链反应(PCR)检测目的基因的整合,用RT-PCR鉴定目的基因的表达,并对永生化和非永生化骨髓来源巨噬细胞的生长状况进行比较。结果:构建的骨髓来源巨噬细胞系已扩大培养并稳定传代,经鉴定,SV40LT抗原已整合入细胞并稳定表达。结论:通过慢病毒感染细胞的方法成功构建了PLEKHQ1基因敲除小鼠的永生化骨髓来源巨噬细胞系。