重症社区获得性肺炎患者血清1磷酸鞘氨醇受体3水平的变化及临床意义

目的:探讨重症社区获得性肺炎(SCAP)患者血清1磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)水平的动态变化及临床意义。方法:选取2018年1月—2022年12月惠州市中心人民医院收治的67例重症社区获得性肺炎患者及同期轻症社区获得性肺炎患者33例。采用ELISA法测定67例重症肺炎患者入院后第1、4、7、10天血清S1PR3水平,同时计算第1天PSI评分,重症肺炎根据预后分为死亡组(n=31)和存活组(n=36)。结果:重症肺炎组S1PR3水平、PSI评分均明显高于轻症肺炎组,差异有统计学意义(P<0.05);肺炎严重指数(PSI)评分、血清S1PR3诊断重症肺炎的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)分别为0.933、0.841;重症肺炎存活组S1PR3水平逐渐下降,死亡组S1PR3水平一度升高,后逐渐下降,总体呈下降趋势。存活组S1PR3下降幅度≥50%比例高于死亡组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:血清S1PR3可作为重症社区获得性肺炎患者的辅助诊断指标,动态监测S1PR3水平可以有效预测重症社区获得性肺炎患者的预后情况,如快速下降提示预后良好,治疗后水平升高或下降缓慢预示预后不良。

1-磷酸鞘氨醇受体3对脂多糖处理大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)对脂多糖(LPS)处理大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法将培养好的大鼠肾小管细胞(NRK-52E)分为对照组、LPS组、S1PR3激动剂+LPS组。对照组不做处理;LPS组予LPS(20μg/ml)刺激12h后做离心收集待检;S1PR3激动剂+LPS组先用S1PR3激动剂KRX-725预处理2 h后再予LPS(20μg/ml)刺激12 h后做离心收集待检。流式细胞术检测各组细胞凋亡率、钙离子表达及caspase-3表达的差异,ELISA试剂盒检测Calpain 1、Calpain 2的表达差异,Western Blot检测各组细胞中S1PR3的表达差异。结果LPS处理后脓毒症NRK-52E细胞模型成功建立,相比于对照组,LPS组和S1PR3激动剂+LPS组的细胞凋亡率、S1PR3表达、钙离子浓度、Calpain 1与Calpain2的表达、caspase-3表达均显著增加(均P<0.05);与LPS组相比,S1PR3激动剂+LPS组的细胞凋亡率、钙离子浓度、Calpain 1与Calpain2的表达、caspase-3表达均显著增加(均P<0.05),S1PR3表达显著增加(P<0.05)。结论S1PR3的激活能够增加肾小管上皮细胞内的钙离子浓度,从而激活caspase-3细胞凋亡信号通路,导致脓毒症肾小管上皮细胞凋亡增加。

1-磷酸鞘氨醇受体1-3(S1P1-3)在去势雄性大鼠阴茎海绵体组织中的表达

目的:探讨1-磷酸鞘氨醇受体1-3(S1P1-3)在去势雄性大鼠阴茎海绵体内的表达,及其与NOS/NO/c GMP、Rho A/Rho激酶等信号通路的关系。方法:18只8周龄健康雄性SD大鼠,随机分为去势组、对照组及去势后睾酮替代组(替代组)各6只,去势组和替代组大鼠切除双侧睾丸、附睾,替代组大鼠去势术后给予生理剂量丙酸睾酮3 mg/(kg·d)皮下注射4周,对照组为假手术组,去势组及对照组大鼠术后给予等量植物油皮下注射4周,12周龄时,测定各组大鼠阴茎海绵体内压/平均动脉压(ICPmax/MAP)、采用免疫组化和Western印迹分析S1P1-3、e NOS、P-e NOS、ROCK1、ROCK2在阴茎海绵体内的表达变化。结果:去势组大鼠血清睾酮水平[(0.41±0.04)nmol/L]显著低于对照组[(16.01±1.02)nmol/L]及替代组[(15.84±1.32)nmol/L](P<0.01),而替代组与对照组睾酮水平无显著差异。去势组ICPmax/MAP比值在0 V、3 V和5 V电刺激盆神经节时(0.088±0.014、0.323±0.014、0.432±0.012)均显著低于对照组(0.155±0.011、0.711±0.010、0.819±0.024)及替代组(0.153±0.012、0.696±0.017、0.763±0.027)(P<0.01),而对照组与替代组无显著差异。去势组S1P1、e NOS、P-e NOS的蛋白表达量[以目的蛋白占内参GAPDH的百分率表示:S1P1(49.99±3.39)%,e NOS(46.82±3.81)%,P-e NOS(45.42±4.35)%]显著低于对照组[S1P1(72.57±3.06)%,e NOS(89.76±3.98)%,P-e NOS(82.53±8.92)%]和替代组[S1P1(71.77±4.43)%,e NOS(87.19±4.23)%,P-e NOS(79.82±7.38)%](P<0.01),去势组S1P2、S1P3、ROCK1、ROCK2蛋白表达量[以目的蛋白占内参GAPDH的百分率表示:S1P2(82.35±4.13)%,S1P3(61.03±5.14)%,ROCK1(74.50±4.02)%,ROCK2(69.83±5.75)%]显著高于对照组[S1P2(41.67±1.68)%,S1P3(31.66±2.67)%,ROCK1(35.69±5.56)%),ROCK2(39.85±7.17)%]和替代组[S1P2(42.80±3.87)%,S1P3(32.25±4.22)%,ROCK1(38.06±5.21)%,ROCK2(42.36±4.44)%](P<0.01)。结论:雄激素缺乏导致大鼠ICPmax/MAP显著降低,可能与阴茎海绵体内S1P1表达下调、抑制e NOS/NO/c GMP信号通路,S1P2、S1P3表达升高、激活Rho A/Rho激酶信号通路有关。

1-磷酸鞘氨醇受体3调控RhoA/Rho激酶途径影响糖尿病ED大鼠勃起功能的初步研究

目的探讨1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)在Ⅰ型糖尿病所致勃起功能障碍(ED)大鼠阴茎海绵体组织中的表达,为糖尿病ED的机制研究提供依据。方法18只正常8周龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组,建模8周后,测定2组大鼠阴茎海绵体内压/平均动脉压,采用免疫组化、PCR技术和Western blot方法检测S1PR3在2组大鼠阴茎海绵体组织中的表达水平,使用Western blot检测2组大鼠阴茎海绵体组织中RhoA、ROCK1和ROCK2的表达水平。结果与正常对照组相比,糖尿病组大鼠勃起功能明显降低(P<0.05);糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中S1PR3 mRNA及其蛋白、RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白的表达水平均明显升高(P<0.05)。结论Ⅰ型糖尿病可诱导大鼠ED,其原因可能与大鼠阴茎海绵体组织中S1PR3表达上调,进而激活RhoA/Rho激酶通路有关。

1-磷酸鞘氨醇受体3在心血管系统中的作用

1-磷酸鞘氨醇受体是1-磷酸鞘氨醇在细胞内发挥作用的重要靶点,包括5种亚型,广泛存在于包括心血管系统在内的各系统。近年来,许多研究发现1-磷酸鞘氨醇受体3在血管舒张、血管屏障功能、缺血再灌注损伤和动脉粥样硬化等过程中具有重要的生物学作用。现就1-磷酸鞘氨醇受体3在心血管系统中的作用及其机制做一综述。

盐酸芬戈莫德对大鼠颈动脉球囊损伤后1型和3型1-磷酸鞘氨醇受体表达的影响

目的探讨新型免疫抑制剂盐酸芬戈莫德对大鼠颈动脉球囊损伤后1型和3型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1,S1P3)表达的影响。方法 60只SD大鼠随机分为假手术组(n=15)、阴性对照组(n=15)、模型组(n=15)和药物处理组(n=15),采用球囊损伤的方法制备大鼠颈动脉球囊损伤模型,于术后3天、7天和21天取材,行HE染色观察其组织学变化,采用Real-time PCR(RT-PCR)检测大鼠血管中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)的表达,Western Blot检测大鼠血管中S1P1和S1P3的表达水平。结果 HE染色显示模型组与其他组相比血管增殖明显;RT-PCR显示AKT2在药物处理组的表达低于模型组,但只在7天时差异有统计学意义(P<0.05),在同一时间点模型组和药物处理组的表达量均高于假手术组和阴性对照组(P均<0.05),假手术组和阴性对照组在各时间点的表达量差异均无统计学意义(P均>0.05);Western Blot在球囊损伤初期S1P1和S1P3表达增加,随着时间推移特别是药物干预作用后,到21天时的表达与正常组织相比无明显差异。结论S1P1和S1P3参与了球囊损伤后平滑肌细胞的迁移与增殖,新型免疫抑制剂盐酸芬戈莫德可以抑制AKT2及S1P1和S1P3的表达,减轻球囊损伤后的再狭窄。

川芎嗪对脂多糖处理大鼠肾小管上皮细胞S1PR3的抑制作用

目的探讨川芎嗪对脂多糖(LPS)处理大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)中1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR)3的影响以及S1PR3在脓毒症相关急性肾损伤(S-AKI)中的作用及机制。方法将培养好的大鼠NRK-52E细胞分为对照组、LPS组、川芎嗪+LPS组。对照组不予处理;LPS组予川芎嗪等量0.9%氯化钠溶液预处理30 min后,予LPS 20μg/mL刺激12 h后离心收集细胞待检;川芎嗪+LPS组先用川芎嗪200 ng/mL预处理30 min后再予LPS 20μg/mL刺激12 h后离心收集细胞待检。采用流式细胞术检测3组细胞凋亡率及钙离子、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)表达的差异,ELISA法检测钙蛋白酶(Calpain)1、Calpain 2表达的差异,Western blot法检测各组细胞中S1PR3表达的差异。结果经LPS处理后脓毒症NRK-52E细胞模型成功建立。与对照组比较,LPS组的细胞凋亡率、钙离子表达、Caspase-3表达、S1PR3表达、Calpain 1、Calpain 2表达均明显增加(均P<0.01);与LPS组比较,川芎嗪+LPS组的细胞凋亡率、钙离子表达、Caspase-3表达、S1PR3表达、Calpain 1、Calpain 2表达均明显下降(均P<0.05)。结论川芎嗪可以抑制S1PR3的表达,能够降低肾小管上皮细胞内的钙离子浓度,从而抑制Caspase-3细胞凋亡信号通路,减少肾小管细胞凋亡。S1PR3可能在S-AKI的发生、发展中起到重要作用。

1-磷酸鞘氨醇受体1、1-磷酸鞘氨醇受体3和载脂蛋白M在细菌性血流感染中的表达及其诊断效能

目的:探讨细菌性血流感染患者血清1-磷酸鞘氨醇受体1(sphingosine 1-phosphate receptor 1,S1P1)、1-磷酸鞘氨醇受体3(sphingosine 1-phosphate receptor 3,S1P3)和载脂蛋白M的表达及其诊断效能。方法:纳入2018年9月至2019年2月成都中医药大学附属医院的90例细菌性血流感染患者,50例非细菌性血流感染患者和30名健康体检者。比较3组研究对象血清中载脂蛋白M、S1P1和S1P3的表达,以受试者操作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线下面积评估各项指标的诊断效能。组间比较采用方差分析。结果:细菌性血流感染组患者血清载脂蛋白M、S1P1和S1P3表达水平分别为(11.06±8.02)μg/L、(305.26±107.45)ng/mL和(320.83±117.62)ng/mL;非细菌性血流感染组分别为(16.32±5.27)μg/L、(392.38±79.40)ng/mL和(223.76±85.98)ng/mL;健康对照组分别为(25.43±7.05)μg/L、(462.15±115.70)ng/mL和(134.16±51.27)ng/mL,差异均有统计学意义(F=-4.716、4.315、-4.94,均P<0.01)。载脂蛋白M、S1P1和S1P3诊断细菌性血流感染的ROC曲线下面积分别为0.959、0.830和0.939;3项指标联合检测诊断细菌性血流感染的ROC曲线下面积为0.994。菌血症、脓毒症、严重脓毒症和脓毒性休克患者的载脂蛋白M分别为(18.08±1.58)、(11.63±4.85)、(9.32±6.58)和(7.95±2.70)μg/L,S1P1分别为(373.00±95.89)、(286.34±105.52)、(264.21±72.98)和(216.97±75.98)ng/mL,S1P3分别为(230.78±71.40)、(305.32±75.39)、(402.83±88.44)和(455.57±87.14)ng/mL,差异均有统计学意义(F=14.005、11.452、32.988,均P<0.01)。载脂蛋白M、S1P1和S1P3诊断脓毒症的ROC曲线下面积分别为0.837、0.812和0.878;3项指标联合检测诊断脓毒症的ROC曲线下面积为0.956。结论:S1P1、S1P3和载脂蛋白M可作为细菌性血流感染和脓毒症的诊断指标,多指标联合检测可以提高诊断效能。

糖皮质激素对视神经脱髓鞘大鼠S1PR1、S1PR3表达及视觉功能的影响

目的:观察糖皮质激素对视神经脱髓鞘大鼠视觉功能及视神经中1-磷酸鞘氨醇受体(S1PR)1、S1PR3表达的影响。方法:将SD大鼠分为对照组、视神经脊髓炎(NMO)组、糖皮质激素组,每组14只,造模14 d后糖皮质激素组尾静脉注射3 g/d糖皮质激素溶液,对照组、NMO组注射等量生理盐水。末次给药后12 h,视动实验及瞳孔反射实验评估大鼠视觉功能;HE染色观察视网膜及视神经损伤;透射电镜检测视神经脱髓鞘情况;免疫荧光法检测视神经中巨噬细胞、小胶质细胞和星形胶质细胞(AST)数,RT-qPCR及Western blot检测视神经S1PR1、S1PR3 mRNA及蛋白表达;免疫组化法检测视神经S1PR1、S1PR3、IL-17表达。结果:与对照组相比,NMO组大鼠视神经可见脱髓鞘等病变,视锐度、瞳孔收缩度、视网膜厚度及RGC细胞数明显降低,凋亡RGC细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和AST细胞及视神经中S1PR1、S1PR3、IL-17表达明显增多;与NMO组相比,糖皮质激素组大鼠视神经病变减轻,视锐度、瞳孔收缩度、视网膜厚度及RGC细胞数明显增高,凋亡RGC细胞、巨噬细胞、小胶质细胞和AST细胞及视神经中S1PR1、S1PR3、IL-17表达明显减少。结论:高剂量糖皮质激素可降低视神经S1PR1、S1PR3、IL-17蛋白表达,降低视神经炎症细胞比例,改善NMO所致视神经脱髓鞘大鼠视觉功能。

小鼠S1PR3慢病毒表达载体的构建及表达

目的构建小鼠1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)慢病毒表达载体,并检测其表达情况。方法小鼠心肌组织m RNA并逆转录得到c DNA,设计并合成引物,采用亚克隆方式将目的基因克隆至慢病毒表达载体p Lent-IRES-EGFP中,将表达载体与包装质粒共转293T细胞,进行目的基因的过表达慢病毒包装,随后收集培养成功病毒,使用病毒感染小鼠L929细胞,检测感染后L929细胞表达S1PR3情况。结果从小鼠心机组织c DNA中扩增出大小约1 100 bp的目的片段;双酶切后成功将S1PR3克隆到慢病毒表达载体p Lent-IRES-EGFP,表达质粒与包装质粒供转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达绿色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠L929细胞,成功表达出S1PR3。结论本研究成功构建了可以高表达S1PR3的p Lenti6.3-S1PR3-IRES-EGFP慢病毒表达载体,为进一步调控S1PR3相关的细胞功能奠定了基础。

靶向S1PR3基因shRNA慢病毒表达载体构建及功能鉴定

目的构建靶向小鼠S1PR3基因的sh RNA慢病毒表达载体,并验证其对内皮祖细胞迁移能力的影响。方法依照sh RNA设计原则,合成对应的sh RNA序列,将其克隆到PHBLV载体中,使用三载体系统进行病毒包装,收集制备成功的病毒,并用荧光显微镜法测定病毒滴度,使用病毒感染EPC后,测定各组细胞中S1PR3蛋白表达情况,选择合适的病毒感染EPC后,测定其对EPC迁移能力的影响。结果成功将sh RNA序列克隆到慢病毒表达载体PHBLV-U6-RFP,表达质粒与辅助质粒共转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达红色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠EPC,可以不同程度干扰细胞中S1PR3蛋白表达,S1PR3蛋白表达受到抑制后,EPC的迁移能力明显减弱。结论我们成功构建了可以有效干扰S1PR3表达的慢病毒载体,并初步观察了其对EPC细胞的迁移能力的影响,为后续进一步调控S1PR3相关的细胞功能的研究奠定了基础。

推拿㨰法对兔骨骼肌急性钝挫伤组织TNF-α及SphK1、S1PR3表达的影响

目的观察推拿㨰法干预对骨骼肌急性钝挫伤兔肿瘤坏死因子-α(TNF-α)及鞘氨醇激酶-1(SphK1)、1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)表达的影响,探讨㨰法治疗骨骼肌钝挫伤的作用机制。方法将15只新西兰兔随机分为空白组、模型组和㨰法组,每组5只。模型组和㨰法组采用自制重力锤打击装置制备兔股四头肌急性钝挫伤模型。造模成功后第7日开始干预,㨰法组用自制㨰法按摩器在股四头肌损伤处进行㨰法按摩,3 min/次,每日上下午各1次,连续3 d,空白组和模型组捆绑相同时间。HE、Masson染色观察股四头肌损伤部位病理变化,ELISA检测股四头肌组织TNF-α含量,Western blot检测股四头肌组织SphK1、S1PR3蛋白表达。结果模型组肌纤维变形断裂,肌细胞坏死严重,肌膜模糊、不完整,且有肌纤维溶解后形成的空泡结构,炎性细胞浸润较明显,可见少量核居中的新生肌纤维,有大量胶原纤维;与空白组比较,模型组股四头肌组织TNF-α含量明显增加(P<0.01),SphK1、S1PR3蛋白表达明显升高(P<0.01)。与模型组比较,㨰法组炎性细胞浸润明显减轻,可见大量细胞核居中且大小不等的新生肌纤维及多核肌管,胶原纤维明显减少;股四头肌组织TNF-α含量明显减少(P<0.05),SphK1、S1PR3蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论㨰法干预能通过下调骨骼肌急性钝挫伤兔受损组织TNF-α含量及SphK1、S1PR3表达,降低组织炎症反应,减缓纤维化,进而促进骨骼肌损伤修复。

携带S1P3 siRNA慢病毒载体改善自发性高血压大鼠勃起功能

目的:探讨携带S1P3 siRNA慢病毒载体对自发性高血压大鼠(SHR)勃起功能的改善作用。方法:5只12周龄健康雄性WKY大鼠为A组,随机将12周龄健康雄性SHR大鼠分组(每组5只):B1组:携带S1P3 siRNA慢病毒转染的SHR;B2组:空慢病毒载体(GFP)转染的SHR;C组:SHR大鼠对照组。B1组阴茎海绵体中部注射20μl携带S1P3 siRNA慢病毒(2×10~8TU/ml),B2组注射GFP 20μl (2×10~8TU/ml),每侧10μl。1周后测各组大鼠ICPmax/MAP值,免疫组化、Western印迹、RT-qPCR检测S1P3、ROCK1、ROCK2、eNOS mRNA及蛋白在各组大鼠阴茎海绵体中的表达。结果:各组大鼠体重、血清T水平无明显差异。A、B1、B2、C组大鼠在0、3、5 V电压刺激下ICPmax/MAP分别为:0V:0.16±0.01、0.15±0.01、0.10±0.00、0.11±0.01,3 V:0.55±0.03、0.55±0.01、0.22±0.01、0.22±0.01,5 V:0.82±0.02、0.79±0.03、0.43±0.01、0.42±0.02,C、B2组ICPmax/MAP较A、B1组显著降低(P<0.05)。免疫组化结果显示,S1P3、ROCK1、ROCK2在A、B1组大鼠阴茎海绵体组织中表达水平与B2、C组相比明显减少(P<0.05),eNOS则明显增加(P<0.05);Western印迹结果显示,与B2、C组相比,A、B1组大鼠阴茎海绵体组织中S1P3、ROCK1、ROCK2蛋白表达显著减低(P<0.05),eNOS显著升高(P<0.05);A、B1、B2、C组S1P3基因相对表达量分别为:0.72±0.04、0.71±0.07、1.00±0.06、1.00±0.10,ROCK1:0.99±0.05、1.08±0.16、1.85±0.44、2.02±0.38,ROCK2:1.00±0.03、1.08±0.16、2.16±0.78、2.46±0.69,eNOS:1.04±0.15、0.81±0.23、0.32±0.08、0.32±0.04,S1P3、ROCK1、ROCK2在A组和B1组中的表达水平与C组、B2组相比明显减少(P<0.05),eNOS明显增加(P<0.05)。结论:携带靶向S1P3 siRNA慢病毒载体抑制阴茎海绵体组织内S1P3基因的表达,并下调RhoA/Rho激酶信号通路,从而改善SHR大鼠勃起功能。

携带siRNA的慢病毒载体抑制自发性高血压大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞S1PR3的表达

目的:筛选出能够高效特异性沉默自发性高血压大鼠(SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)内1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)基因表达的siRNA慢病毒载体,并观察其对SHR CCSMC ROCK1、ROCK2、e NOS表达的影响。方法:以大鼠S1PR3基因mRNA序列作为干扰靶点,设计并合成3对靶向S1PR3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及1对阴性对照序列,构建并包装成慢病毒载体。体外培养SHR CCSMC及魏-凯二氏大鼠(WKY)CCSMC,随机分为A组(SHR对照组)、B组(携带阴性对照病毒的SHR CCSMC转染组)、C^E组(分别携带靶向S1PR3基因siRNA 1~3号靶点慢病毒的SHR CCSMC转染组),F组(WKY对照组),以感染复数(MOI)=60转染SHR CCSMC,转染后观察细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,并用RT-PCR和Western印迹检测转染后细胞中S1PR3、ROCK1、ROCK2、e NOS mRNA及蛋白的表达情况。结果:经基因测序证明慢病毒载体构建成功。荧光显微镜下观察B^E组细胞转染效率均>80%。与A组相比,B组S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均无明显改变(P均>0.05),C、D、E、F组的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均较A组显著下降(P均<0.05),其中E组抑制作用最为明显,使S1PR3 mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(34.2±2.9)%、(77.7±4.7)%;ROCK1 mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(33.3±1.4)%、(51.1±7.3)%;ROCK2 mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(30.8±3.6)%、(58.32±5.5)%。A组e NOS mRNA及蛋白表达分别与B、C、D、E比较无明显差异(P均>0.05),但较F组显著降低(P<0.05);与F组比较,E组S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均无明显改变(P均>0.05),A、B、C、D组的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白表达均显著高于F组(P均<0.05),A、B、C、D、E组e NOS mRNA及蛋白表达均较F组显著降低(P均<0.05)。结论:本研究构建的3条携带不同位点的S1PR3基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR CCSMC内S1PR3基因的表达,并能有效抑制SHR CCSMC中上调的Rho A/Rho激酶信号通路,其中携带siRNA3慢病毒载体的抑制效率最高。

胡黄连苷Ⅱ对非小细胞肺癌恶性进展的影响

目的探讨胡黄连苷Ⅱ对非小细胞肺癌(NSCLC)恶性进展的影响及机制。方法将A549细胞分组为对照组,胡黄连苷Ⅱ低、中、高浓度组,K6PC-5[鞘氨醇激酶1(SPHK1)激活剂]组,胡黄连苷Ⅱ高剂量+K6PC-5组,检测细胞增殖、迁移、侵袭情况,以及细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9、SPHK1、1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)及胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)蛋白的表达情况。以BALB/c裸鼠为对象,通过皮下接种A549细胞悬液建立NSCLC裸鼠移植瘤模型,并将其分为裸鼠-对照组,裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低、中、高剂量组,裸鼠-K6PC-5组,裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量+K6PC-5组(每组5只),考察胡黄连苷Ⅱ对其瘤体质量及体积的影响。结果与对照组比较,胡黄连苷Ⅱ低、中、高浓度组的细胞OD450值、EdU阳性细胞率、划痕愈合率、细胞侵袭数及PCNA、MMP-2、MMP-9、SPHK1、S1PR3、ERK1/2蛋白的相对表达量均显著降低;与裸鼠-对照组比较,裸鼠-胡黄连苷Ⅱ低、中、高剂量组裸鼠体内的瘤体质量及体积均显著降低或缩小,上述指标均呈浓度/剂量依赖性变化(P<0.05);K6PC-5组细胞和裸鼠-K6PC-5组裸鼠对应指标的变化趋势则相反(P<0.05)。与胡黄连苷Ⅱ高浓度组或裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量组比较,胡黄连苷Ⅱ高浓度+K6PC-5组细胞和裸鼠-胡黄连苷Ⅱ高剂量+K6PC-5组裸鼠的上述定量指标均显著升高或增大(P<0.05)。结论胡黄连苷Ⅱ可能通过抑制SPHK1/1-磷酸鞘氨醇/S1PR3信号通路来抑制NSCLC的恶性进展。

S1PR3激动剂KRX-725促进细菌清除影响脓毒症小鼠预后

目的通过合成特异性S1PR3激动剂KRX-725，探讨S1PR3参与细菌清除的功能及其分子机制。方法20只健康清洁级雄性C57BL/6小鼠以随机数字法分为S1PR3特异性激动剂KRX-725治疗组和对照组。采用大肠杆菌（3×10^6）腹腔注射诱导脓毒症模型，治疗组小鼠于模型后立即腹腔注射KRX-725（10mg／kg），对照组给予等体积的溶剂，比较两组小鼠48h生存率（n=12）。模型后24h检测腹腔及血液细菌负荷（n=5），并取肺组织进行苏木精-伊红染色（HE染色）评估KRX-725治疗组及对照组的肺脏病理损伤程度（n=3）。体外采用大肠杆菌刺激腹腔巨噬细胞（细胞：细菌=1：10），分别加入KRX-725及其对照溶剂，采用CM—H2DCFDA探针标记细胞内活性氧，酶标仪检测检测不同时间点巨噬细胞活性氧水平。庆大霉素保护实验观察KRX-725对巨噬细胞的清除细菌能力的影响。生存率分析采用Log—rank test，组间数据比较采用独立样本t检验分析，P〈0．05为差异有统计学意义。结果KRX-725治疗组脓毒症小鼠48h生存率较对照组显著提高（P〈0．05）。脓毒症模型后24h，KRX-725治疗组较对照组血液及腹腔灌洗液中的细菌负荷显著降低（血液：t=3．17，P〈0．05；腹腔灌洗液：t=4．07，P〈0．01），同时KRX-725可显著降低脓毒症模型肺组织损伤程度（肺损伤评分：KRX-725组1．4±0．25，对照组2．4±0．25）（t=2．89，P〈0．05）。体外实验，KRX-725治疗组较对照组可迅速上调大肠杆菌刺激后20min及30min细胞内活性氧的水平（20min荧光强度：KRX-725组522．9±38．76，对照组385．9±15．90，P〈0．05；30min荧光强度：KRX-725组519．7±25．02，对照组384．5±15．28，P〈0．01）。庆大霉素保护实验发现，KRX-725可显著降低细菌吞噬后3h及6h巨噬细胞内存活的大肠杆菌的数量（3h：KRX-725组286．5±98．35，对照组710．8±107．8，P〈0．05；6h：KRX-725组72．5±6．45，对照组205．8±66．76，P〈0．01）。结论体内应用KRX-725可改善脓毒症小鼠生存率，降低血液及腹腔细菌负荷，减轻肺脏损伤，从而改善脓毒症预后。体外KRX-725通过上调巨噬细胞活性氧的水平，提高巨噬细胞对清除细菌的能力。

Myristoyl—glycine修饰的S1PR3特异性激动肽跨膜激活效应研究

目的拟通过合成1-磷酸鞘氨醇受体3（sphingosine 1-phosphate Receptor 3, S1PP,3）特异性激动肽并经肉豆蔻酰甘氨酸（myristoyl—glycine）修饰，研究其激活丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases, MAPKs）通路的效应。方法设计合成源自七次跨膜受体S1PR3胞内第2个环的短肽，并经Myristoyl—glycine修饰，命名为GPS-725．017。Westernblot检测GPS-725．017对单核巨噬细胞（THP一1）MAPKs通路关键分子细胞外调节蛋白激酶 （ extracellularregulated protein kinase, ERK）及应激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase, JNK）磷酸化水平的影响。组内或组问不同浓度和不同时间点蛋白灰度值比较采用多因素方差分析。结果与溶剂对照组相比，30Ixmol／L或50μmol／L的GPS-725．017处理THP-1细胞10min，P-ERK水平显著升高[30μmol／L组：（3．10±0．27）vs．（7．98±0．45），P〈0．01；50μmol／L组：（4．78±0．44）vs．（25．98±2．32），P〈0．01]；50μmo]／L的GPS-725．017处理THP-1细胞5min、10min、20min和30min，与溶剂组相比，各时间点p-ERK或p-JNK水平均显著上升（均为P〈0．01）。结论源于S1PR3胞内第2个环并经Myristoyl—glycine修饰的短肽GPS-725．017，可跨膜显著活化MAPKs通路，本研究为临床靶向调控S1PR3，治疗炎症及脓毒症提供理论依据。

m^(6)A去甲基化酶ALKBH5对大鼠S1PR3基因3′-非编码区双荧光素酶活性的影响

[目的]明确m^(6)A去甲基化酶ALKBH5对含S1PR3基因3′-非编码区(3′-UTR)双荧光素酶报告基因的调控作用。[方法]以大鼠前额叶皮层脑区cDNA为模板,利用聚合酶链式反应(PCR)扩增S1PR3基因3′-UTR中含有m^(6)A修饰位点的目的片段。利用重叠延伸PCR方法将三个靶序列GGACT、GGACT、AGACT中的第三位A突变为C,并将野生型S1PR3-3′-UTR片段和突变型S1PR3-mut-3′-UTR片段分别正向插入到pmiR-RB-ReportTMvector载体中。将pcDNA3.1-ALKBH5或空载体pcDNA3.1与野生型和突变型双荧光素酶报告载体分别共转染PC12细胞,并检测荧光素酶活性。[结果]成功构建了包含S1PR3基因3′-UTR野生型双荧光素酶报告载体pmiR-S1PR3-3′-UTR和突变型双荧光素酶报告载体pmiR-S1PR3-mut-3′-UTR。荧光素酶活性分析表明与空载体pcDNA3.1组相比,ALKBH5可显著降低野生型及突变型C1和C2报告载体荧光素酶的活性(P<0.05),而对突变型C3没有影响(P>0.05)。[结论]初步证明S1PR3基因3′-UTR区是去甲基化酶ALKBH5的作用靶点,ALKBH5通过识别S1PR3基因3′-UTR区C3处的m^(6)A修饰位点而降低pmiR-S1PR3-3′-UTR荧光素酶的活性。