基于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼检测中药抗氧化成分的方法及其原理研究进展

目的:了解基于1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)检测中药抗氧化成分的方法及其原理的研究进展,为寻找天然抗氧化剂提供参考。方法:以"1,1-二苯基-2-三硝基苯肼""中药抗氧化成分""1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl""Antioxidant ingredients""Traditional Chinese medicine"等为关键词,组合检索2000年1月-2016年3月在Pub Med、Science direct、中国知网、维普、万方数据库中基于DPPH检测中药抗氧化成分方法及其原理的文献并进行综述。结果:共查阅到相关文献249篇,其中有效文献36篇。整理出DPPH-紫外分光光度法、DPPH-酶标仪法、DPPH-薄层色谱法、DPPH-电化学法、DPPH-电子顺磁共振(ESR)法、色谱技术联用法、流动注射分析法、高速逆流色谱法等8种筛选中药抗氧化成分的方法,分别利用了DPPH在特定波长下吸光度变化比例、酶联免疫反应显色与吸光度值大小关系、薄层色谱显色、电化学性质、电子顺磁共振技术、色谱技术、连续流动分析技术、液-液分配色谱技术。结论:基于DPPH筛选中药抗氧化成分方法众多。其中DPPH与新型色谱技术联用法受到研究人员关注,成为了目前广泛应用的检测中药抗氧化成分的方法。

藏茶茶褐素组分特征及其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基活性的比较

借助膜分离技术对藏茶茶褐素进行分级制备,得到4个茶褐素组分(theabrownine fractions,TBFs),其分子质量范围分别为5~10 kDa(TBFs1)、>10~50 kDa(TBFs2)、>50~100 kDa(TBFs3)和>100 kDa(TBFs4),并对这4个组分进行理化特性、微观结构和清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基活性的比较研究。结果表明,藏茶茶褐素的分子质量不低于5 kDa,4个不同分子质量范围的茶褐素组分均呈弱酸性,具有不同含量的酚羟基、羧基以及蛋白质和多糖等络合物。光谱学分析显示,藏茶茶褐素属多羟基酚类物质,在202 nm附近有一特征吸收峰;扫描电镜观察发现,不同茶褐素组分的聚集形态差异明显。活性分析表明,藏茶茶褐素在10~80μg/mL范围内其质量浓度与DPPH自由基的清除率呈线性正相关,且各组分间活性差异显著,其中活性最强的茶褐素组分为TBFs4(>100 kDa)。

含喹啉基片段的水杨醛席夫碱类化合物的合成及其淬灭1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基性能

通过2-甲基-5-氨基喹啉和取代水杨醛缩合反应,合成了10个含喹啉基片段的水杨醛席夫碱类化合物。通过1HNMR、13CNMR、IR、LC-MS和元素分析技术确证了产物的结构,并测定了目标化合物在不同浓度时淬灭1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基活性。结果表明,所有化合物在测试浓度0.02~0.10 g/L时都表现出一定的淬灭DPPH自由基活性,清除率主要集中在19%~35%之间,但是4-溴-2-甲氧基-6-{[(2-甲基-5-喹啉基)亚氨基]甲基}苯酚在浓度0.06 g/L时表现出特别优异的活性,清除率高达43.1%。目标化合物质量浓度的变化对活性的影响不明显或者没有明显的变化规律。

含吗啉基片段的水杨醛席夫碱类化合物的合成及其淬灭1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基性能

通过3-氟-4-吗啉基苯胺和取代水杨醛缩合反应,合成了14个含吗啉基片段水杨醛席夫碱类化合物(Ⅰa-Ⅰn)。通过核磁共振波谱仪(NMR)、傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)、液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)和元素分析等技术手段研究了产物的结构和淬灭1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的活性。结果表明,在0. 02～0. 10 g/L,所有化合物均表现出一定的淬灭DPPH自由基活性。其中,化合物Ⅰd和Ⅰf表现出较为优异的性能,化合物Ⅰd的活性在30%～55%,化合物Ⅰf的活性则大于50%。随着化合物Ⅰd、Ⅰh、Ⅰj和Ⅰn质量浓度的增大,其淬灭DPPH自由基的活性均呈现增强趋势。

1,1-二苯基-2-三硝基苯基肼自由基的合成改进

以氯苯和N,N-二苯基肼盐酸盐为起始原料,经2步硝化、亲核取代和氧化合成目标化合物1,1-二苯基-2-三硝基苯基肼自由基,4步反应总收率59.7%,并对最后一步反应进行优化,目标化合物经熔点和MS确证。

2,2-二苯基-1-苦肼基-高效液相色谱法快速筛选亚麻籽抗氧化活性成分

为了更加迅速地筛选到亚麻籽复杂提取物中的抗氧化活性物质及其活性强弱,以开环异落松树脂酚二葡萄糖苷(SDG)、开环异落叶松树脂酚(SECO)和肠二醇(ED)3种木酚素为研究对象,建立了抗氧化活性能力筛选的2,2-二苯基-1-苦肼基-高效液相色谱法(DPPH-HPLC法)。液相色谱条件为:流动相为乙腈和水,经反相色谱柱Waters XBridge C18分离,检测波长为280 nm。DPPH-HPLC法的步骤是:将单一或者混合抗氧化剂分别与DPPH混合,放置20 min,作为待测液,将同样量的相应抗氧化剂作为对照液,分别进行液相色谱分析获得其含量,计算出相应的抗氧化剂清除率(SRA),活性顺序为:SDG>SECO>ED。结合超高效液相色谱-飞行时间质谱联用法,鉴定出亚麻籽中5种抗氧化物,筛选其抗氧化能力分别为:SDG异构体(5)>SDG(4)>7α-[(β-D-glupyranosyl)oxy]-1-methoxyisolariciresinol(1)>(6R,7R,8S)-1-Methoxyisolariciresinol(2)>蜀葵苷元二葡萄糖苷(3)。结果表明,建立的DPPH-HPLC法能够有效完成复杂亚麻籽提取物的抗氧化活性物质筛选。

1,1-二苯基-2-2苦基肼基游离基法测定调脾护心方及其不同组分清除自由基的能力

目的研究调脾护心方的清除自由基活性及其成分。方法分别采用乙醇或水加热提取调脾护心方成分,并用石油醚、氯仿、醋酸乙酯和正丁醇依次进行萃取,利用1,1-二苯基-2-2苦基肼基游离法(DPPH法)进行清除自由基活性实验,同时与合成抗氧化剂维生素C进行对照。结果各组分均有一定的清除自由基作用,且调脾护心方水提物的醋酸乙酯萃取部分具有最高的清除自由基活性。结论调脾护心方中的多酚类成分是主要的抗氧化活性成分,值得进一步研究。

葡萄糖-牡蛎酶解液美拉德反应体系的抗氧化活性

以牡蛎酶解液与葡萄糖建立美拉德反应体系,以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率、金属离子螯合能力和还原能力为指标,通过葡萄糖质量分数、反应温度、p H值以及反应时间4个因素的单因素试验和正交试验优化得到具有强抗氧化活性的美拉德反应产物适宜反应条件。结果表明,葡萄糖-牡蛎酶解液美拉德反应产物具有较强抗氧化活性的反应条件为葡萄糖质量分数4%、反应温度120℃、p H7.0、反应时间120min。在此组合条件下,牡蛎酶解液美拉德反应得到的反应液的DPPH自由基清除率为93.2%,金属离子螯合能力为22.5%,还原能力为1.436。

山奈酚-铜配合物的合成、表征及其抗氧化活性的研究

以山奈酚和二水合氯化铜为原料,合成山奈酚-铜金属配合物,通过紫外光谱、红外光谱、核磁共振氢谱及差热-热重分析对其结构进行表征,并采用DPPH法测定了配合物清除自由基的能力。结果表明:相比山奈酚,配合物的紫外光谱和红外光谱的吸收峰均发生明显红移;核磁共振氢谱中3-OH信号消失,其他质子信号均向高场移动;差热-热重分析显示山奈酚和Cu^(2+)的配位比为1,且配合物中含三分子的配位水;在6种设定的实验浓度内(1.0~3.5 mol/L),山奈酚和配合物清除DPPH·半抑制浓度(IC_(50))分别为1.63×10^(-4)、1.51×10^(-4)mol/L。Cu^(2+)是通过与山奈酚3位羟基和4位羰基的氧原子结合生成配合物,山奈酚与铜形成配合物后,对DPPH自由基的清除率有提高。

应用均匀设计-高通量筛选技术评价丹参有效单体成分抗氧化及海马神经细胞保护作用的最佳配伍

目的:通过均匀设计-高通量筛选(uniform design-high throughput screening,UD-HTS)技术,对丹参多种有效单体成分进行多因素多水平配伍组合样品抗氧化及海马神经细胞保护作用的筛选。方法:具有生物活性的丹参多种有效单体(脂溶性7种和水溶性7种)。按照均匀设计方案,得到各单体之间不同浓度配比的组合样品,通过抗2,2-二苯基-1-苦肼基自由基(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl,DPPH)氧化法和细胞学实验检测各组合样品药物活性。结果:通过初筛和复筛,得到A13、PA两个抗氧化及海马神经细胞保护作用最佳配伍组合样品。结论:均匀设计-高通量筛选技术可快速筛选出药效较好的组合样品,适合多因素多水平配比的大规模药物筛选。

芹菜素-镁配合物的制备、表征及抗氧化活性的研究

通过加热回流法制备芹菜素与镁离子的配合物,确定其形成配合物的最佳条件为p H值9. 0,反应温度60℃,反应时间3 h,得率为82. 31%。采用紫外-可见光光度法、红外光谱法、元素分析法对形成的配合物进行表征;等摩尔变化法及相溶解度法测定其配合比及稳定常数,结果在研究的溶度范围内,芹菜素与镁离子形成稳定的配合物,配合比1∶1,溶解度增加,在液体中对自由基(DPPH·)的清除能力大大增强。

HPLC-DPPH快速发现重楼果壳总黄酮中抗氧化成分及其活性初步验证

目的:以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)为底物,利用HPLC快速发现重楼果壳总黄酮中的抗氧化物成分,为重楼果壳资源的利用提供研究基础。方法:对重楼果壳用70%乙醇水提取进行总黄酮提取富集后,利用DPPH与重楼果壳总黄酮进行反应,采用HPLC分析反应前后色谱峰的变化,通过制备色谱、高分辨质谱、核磁共振等鉴定潜在的抗氧化成分,并进行其抗氧化活性验证。结果:与DPPH反应后,发现一个色谱峰消失,利用制备色谱对该消失的色谱峰进行制备纯化,利用质谱和核磁共振数据,鉴定为槲皮素-3-O-龙胆二糖苷,该化合物首次从重楼属植物中分离得到,在重楼果壳总黄酮中的含量为3.28%。对其抗氧化活性进行验证,发现其对DPPH自由基半数清除率(IC50)为0.0340 mg·ml^(-1),与维生素C(IC50=0.0240 mg·ml^(-1))的抗氧化活性相当。结论:该法快速从重楼果壳中发现抗氧化活性成分槲皮素-3-O-龙胆二糖苷,为重楼果壳总黄酮的进一步开发提供研究基础。

超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法检测牡丹根皮中抗氧化活性成分及其抗氧化能力

为能准确检测复杂基质牡丹根皮样品中的抗氧化活性成分及其抗氧化能力,进行了题示研究,并推测了1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除过程的反应机理。采用70%(体积分数,下同)乙醇溶液超声提取样品2次,过滤后合并滤液,浓缩、离心、稀释,配制成200 g·L^(−1)样品溶液,并进一步稀释成质量浓度为8,40,100,200,500,1000,5000,10000,25000 mg·L^(−1)的样品溶液系列。取上述配制好的样品溶液系列各300μL(不添加样品的为样品对照组)和无水乙醇600μL,再加入50 mg·L^(−1)DPPH溶液600μL,涡旋1 min,避光反应30 min。用70%乙醇溶液稀释200倍,过0.22μm滤膜,采用超高效液相色谱-串联四极杆飞行时间质谱法(UHPLC-Q-TOF-MS)测量样品加入前后DPPH准分子离子峰面积P_(0)和P,利用100%×(P_(0)-P)/P_(0)计算DPPH自由基清除率。结合自身谱库、标准品谱图以及牡丹根皮相关文献鉴定各抗氧化活性成分。结果显示:样品的质量浓度在8~1000 mg·L^(−1)内与DPPH自由基清除率呈线性关系,较酶标仪法受样品基质和颜色干扰小,且DPPH自由基清除率结果和酶标仪法的基本一致;从牡丹根皮中显著识别出18种抗氧化活性成分,包括15种可鉴定成分(包含两对同分异构体)和3种未知成分,其中氧化芍药苷、丹皮酚、牡丹皮苷H、没食子酰芍药苷、没食子酸甲酯、牡丹皮苷F、对羟基苯甲酸是牡丹根皮中主要的抗氧化活性成分。

杜仲叶多糖的提取、结构及抗氧化活性研究

【目的】探究微波辅助提取杜仲叶多糖的最佳条件,分析杜仲叶多糖的结构组成及抗氧化活性,为杜仲叶综合利用提供依据。【方法】采用微波辅助提取法,以杜仲叶多糖得率为指标,m(杜仲叶粉/g)∶V(H_(2)O/mL)(以下简称质量体积比)、微波时间、水浴温度、微波功率为影响因素设计单因素试验,在此基础上采用正交试验优化得到杜仲叶多糖最佳提取条件。根据该条件提取6个品种杜仲叶(华仲1号、华仲5号、华仲12号、华仲13号、华仲15号、华仲24号)多糖,使用气相色谱-质谱联用仪及红外光谱仪测定杜仲叶多糖结构组成,并通过电子顺磁共振波谱法测定杜仲叶多糖1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)自由基清除率表征其抗氧化活性。【结果】杜仲叶多糖的最佳提取条件是质量体积比1∶30,微波时间1.5 min,水浴温度40℃,微波功率230 W。在该条件下6个品种杜仲叶得率分别为华仲1号6.90%±0.04%、华仲5号6.47%±0.13%、华仲12号6.68%±0.11%、华仲13号6.53%±0.07%、华仲15号7.21%±0.02%和华仲24号7.64%±0.05%。在结构组成方面,单糖组成结果显示,6个品种杜仲叶多糖均由L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖组成,其中D-葡萄糖和D-半乳糖含量最高,但其单糖组成比例存在差异;多糖红外光谱显示,不同杜仲叶多糖具有相似的多糖特征吸收峰。在抗氧化活性方面,6个品种杜仲叶多糖DPPH自由基清除能力顺序为华仲1号>华仲13号>华仲12号>华仲24号>华仲5号>华仲15号。【结论】微波辅助提取可以提高杜仲叶多糖得率,不同杜仲叶多糖均有良好的抗氧化活性,且以华仲1号的DPPH自由基清除能力最强。

基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS的固公果根指纹图谱分析及DPPH抗氧化谱效关系研究

目的 建立固公果根药材的超高效液相色谱串联四极杆-静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS)指纹图谱,并研究其与自由基清除活性的谱效关系。方法 采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS建立固公果根的指纹图谱,评价指纹图谱相似度,结合热图分析,对其中的19个共有峰进行指认;使用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法评价固公果根的抗氧化活性,结合灰色关联度分析(grey relational analysis, GRA)研究谱效关系。结果 建立了固公果根的UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS指纹图谱,选择峰面积>1%的19个色谱共有峰,通过对照品比对法、数据库、参考文献等方法鉴定前述色谱峰。19个色谱峰的热图分析和DPPH抗氧化灰色关联度结果显示,面积颜色变动较大峰为2、4、8、14、15、17,谱效关系表明11、18、17、19、8、6、16、12、1、5、7、15号峰是与抗氧化活性关联较大的正相关峰。各取排名前五相交得以下9个化学成分作为质量评价指标:峰2(儿茶素)、峰4(表儿茶素)、峰8[(+)-喹色亭酚-(4β,8)-表儿茶素]、峰11(鞣花酸)、峰14(野蔷薇苷)、峰15(刺梨苷)、峰17(委陵菜酸)、峰18(蔷薇酸)和峰19(皂皮酸)。结论 固公果根抗氧化活性是酚类和三萜皂苷类等多成分联合效应的结果,为药材质量控制提供更全面的参考。

三种小麦麸皮总黄酮的体外抗氧化活性

研究不同溶剂(乙醇、甲醇、丙酮)提取的3种不同品种小麦麸皮(豫教5号、郑麦7698、西农979)黄酮类化合物的抗氧化活性。结果表明,3种不同的有机溶剂对小麦麸皮的总黄酮提取能力顺序为:乙醇>甲醇>丙酮。其中乙醇提取的总黄酮的总还原力和清除羟基自由基的能力最强。细胞实验结果显示,乙醇提取3种不同品种的小麦麸皮中黄酮类化合物能使人胃腺癌细胞(adenocarcinoma cell line,AGS)内活性氧水平下降,显示良好的抗氧化活性,且活性与总黄酮含量呈正相关性。总的来说,乙醇提取的西农979小麦麸皮的总黄酮的抗氧化能力最好。该研究结果为更好利用979小麦麸皮中黄酮类物质提供了参考依据。

自由基含量对H_2O_2复合固体推进剂贮存稳定性的影响

以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)为指示剂,采用紫外-可见分光光度法实现了过氧化氢复合固体推进剂(HPSP)体系内自由基含量的定量测试。结果表明,HPSP体系内自由基含量与推进剂贮存过程中的质量损失存在正相关关系,可以作为评判稳定剂效果及推进剂贮存性能的标准;CD-n型稳定剂可较好地抑制HPSP体系内的自由基含量,引入该型稳定剂后,HPSP体系内自由基浓度低于原材料H_2O_2中的自由基浓度;HPSP体系内自由基含量(C_(radical))与推进剂质量损失速率(r_(M_R))呈指数关系,常温条件下采用CD-n型稳定剂时,二者的经验公式为r_(M_R)=0.003 65+1.70 66×10^(-8)exp(5.531 78C_(radical))。

毛尖、铁观音和普洱水提物对H_(2)O_(2)诱导的RAW 264.7巨噬细胞氧化应激损伤的影响

目的探究毛尖、铁观音、普洱3种茶叶水提物的体外抗氧化作用及对H_(2)O_(2)诱导的RAW264.7细胞损伤的保护作用。方法用福林酚法测定3种提取物中茶多酚含量。采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法和铁离子还原(FRAP)法对3种茶多酚提物的体外抗氧化活性进行研究。采用噻唑兰比色法(MTT)研究3种茶多酚提物对H_(2)O_(2)诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤的保护作用。结果毛尖、铁观音、普洱茶多酚提取物的茶多酚含量分别为(46.79±0.99)%、(46.22±1.03)%、(33.72±0.60)%。毛尖、铁观音、普洱各自水提物的DPPH自由基半数清除浓度(IC_(50))分别为4.33、4.91、13.49mg/L。毛尖、铁观音、普洱水提物的FRAP值分别为(350.89±3.11)、(261.55±2.98)、(109.97±3.25)mmol/L。3种茶叶的水提物在浓度低于80mg/L时,均对H_(2)O_(2)诱导RAW264.7细胞氧化应激有良好的保护作用。结论茶多酚提取物的DPPH自由基清除能力及FRAP值的大小关系均为:毛尖>铁观音>普洱。提取物的抗氧化活性也与茶多酚含量呈正相关。3种茶叶的水提物在80mg/L浓度以内均对H_(2)O_(2)诱导的RAW264.7细胞氧化应激有保护作用。

当归-桃仁药对配伍特点及其效应物质基础研究

目的:探讨当归-桃仁药对不同配比的应用特点及其效应物质基础。方法:基于自建的中医方剂数据库,采用关联规则分析方法,挖掘归纳出当归-桃仁药对在方剂中的配伍特点;采用HPLC法分析当归-桃仁药对共煎液与单煎液不同配比中苦杏仁苷、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸的含量变化;采用凝血时间、抑制血小板聚集和清除DPPH自由基实验评价配伍效应及其作用特点。结果:挖掘归纳出当归-桃仁药对在方剂中的配伍特点及其出现频度;实验结果表明当归-桃仁配伍有利于苦杏仁苷、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等效应成分的溶出;桃仁当归配伍比同等生药量的桃仁单味药材凝血时间延长,血小板聚集率抑制率增加,DPPH清除率增加;当归桃仁配伍比同等生药量的当归单味药材血小板聚集率抑制率增加,说明两者配伍具有一定的科学性和合理性。结论:当归-桃仁药对具有合理性,有利于两味药中芳香酸类化合物绿原酸、咖啡酸、阿魏酸及苷类化合物苦杏仁苷的溶出;配伍后凝血时间延长,血小板聚集率抑制率增加和DPPH清除率增加,但各配伍比例之间差异不明显。

具有抑制酪氨酸酶活性乳酸菌的筛选及其成分分析

以抑制酪氨酸酶活性为筛选指标,对5株乳酸菌发酵上清液、菌体细胞和破碎提取物的酪氨酸酶抑制活性和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率进行分析,结果表明,菌株发酵上清液抑制酪氨酸酶能力远高于菌体细胞和破碎提取物,其中MNJ-9菌株发酵上清液抑制酪氨酸酶能力可达68.9%。菌体细胞和破碎提取物仅为50.9%和34.8%。MNJ-9菌株发酵上清液对DPPH自由基清除能力可达93.1%。因此,对MNJ-9菌株进行16S rDNA菌种鉴定。基于液相色谱-质谱非靶向代谢组学对MNJ-9菌株发酵上清液进行主要成分分析。对其主要成分的10种化合物进行抑制率测定,结果表明,5-氨基戊酸抑制率最高。将5-氨基戊酸对小鼠黑色素瘤细胞(B16F10)进行细胞毒性实验、黑色素含量测定、细胞酪氨酸酶活性测定评价其美白能力。结果表明,5-氨基戊酸质量浓度为70μg/mL连续培养72 h时细胞存活率≥80%,细胞无明显毒性;质量浓度为10~70μg/mL时,细胞内黑色素含量和酪氨酸酶活性分别为85.4%~45.2%和76.53%~40.5%,说明5-氨基戊酸具有一定的美白能力。