黑莓1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因RuACO 1a和RuACO 1b的克隆及功能鉴定

基于前期黑莓(Rubus spp.)品种‘Navaho’果实转录组测序结果,通过反转录PCR克隆获得2个1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACO)基因,命名为RuACO 1a和RuACO 1b。结果表明:RuACO 1a和RuACO 1b的开放阅读框(ORF)长度分别为939和918 bp,分别含有4和3个外显子。系统进化分析结果显示RuACO1a和RuACO1b与月季(Rosa chinensis Jacq.)、蕨麻〔Argentina anserina(Linn.)Rydb.〕和野草莓(Fragaria vesca Linn.)ACO1蛋白的亲缘关系均较近,且分别属于蔷薇科(Rosaceae)植物中2类ACO1蛋白。RuACO 1a在果实着色后28 d响应乙烯利诱导,其相对表达量急剧升高,而RuACO 1b在果实着色后21 d响应乙烯利诱导,早于RuACO 1a。脱落酸处理后,RuACO 1a和RuACO 1b的相对表达量在果实着色后14和28 d较高。RuACO 1a和RuACO 1b具有组织表达特异性,RuACO 1a在幼果、花蕾和花中的相对表达量较高,RuACO 1b在幼果和幼根中的相对表达量较高。与野生型相比,RuACO 1a和RuACO 1b过量表达转基因拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕植株均表现为叶片中叶绿素相对含量和氮含量升高、开花和角果成熟提前、ACO含量升高。综上所述,黑莓RuACO 1a和RuACO 1b基因均促进拟南芥角果提前成熟。

石蒜1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶基因LrACS的克隆及功能鉴定

为了解1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(ACS)基因在石蒜〔Lycoris radiata(L'Hér.)Herb.〕乙烯合成中的作用,对石蒜ACS基因LrACS进行了克隆,并通过系统进化树和氨基酸序列比对分析明确LrACS与其他同源蛋白的进化关系。利用亚细胞定位分析LrACS在细胞中的定位,对LrACS重组蛋白进行体外活性检测,并利用实时荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析不同生长时期LrACS的组织特异性表达。结果显示:LrACS的开放阅读框长度为1473 bp,编码490个氨基酸。LrACS的理论相对分子质量为54954.97,理论等电点为pI 8.21。系统进化树分析结果表明LrACS与忽地笑〔Lycoris aurea(L'Hér.)Herb.〕LaACS的亲缘关系最近,均属于Ⅰ型ACS蛋白。亚细胞定位结果显示LrACS主要定位于细胞质基质。体外活性检测结果证实LrACS重组蛋白能够催化S-腺苷甲硫氨酸(SAM)生成1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)。qRT-PCR分析结果显示:LrACS在花期和叶期的石蒜各组织中均有表达,但其表达具有组织特异性,其中,花期花瓣中LrACS的相对表达量极显著(P<0.01)高于根、鳞茎、花茎,叶期根中LrACS的相对表达量极显著高于鳞茎和叶。综上所述,LrACS主要定位于细胞质基质并在石蒜不同生长时期行使催化SAM生成ACC的功能。

抗性稗草1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】克隆稗草(Echinochloa crus-galli)乙烯生物合成途径关键酶1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(Ec ACO),对其进行表达分析和酶活性测定,以探究稗草抗二氯喹啉酸的机理。【方法】根据转录组测序所得Ec ACO部分序列设计引物,分别从二氯喹啉酸的抗性和敏感型稗草中克隆Ec ACO的全长序列,用DNAman以及Gene DOC等软件进行序列分析。用q RT-PCR方法分析抗性和敏感性稗草间的Ec ACO表达水平差异。最后分别将抗性和敏感性稗草Ec ACO的开放阅读框(ORF)序列连接至原核表达载体p MAL-c5x中,并转化至大肠杆菌菌株BL21,经终浓度为0.4 mmol·L-1的IPTG于18℃诱导16 h后,检测Ec ACO蛋白的表达情况。采用MBP吸附柱分离纯化Ec ACO蛋白后,通过测定乙烯释放量,测定抗性和敏感稗草Ec ACO蛋白间的活性差异。【结果】克隆得到抗性稗草和敏感稗草Ec ACO,其编码区序列长度为936 bp,预测蛋白含311个氨基酸残基,蛋白分子量大小和理论等电点分别为35 k D和5.4。序列比对表明,抗性稗草Ec ACO氨基酸序列与粟(Setaria italica)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)同源性分别为93%、92%和91%;与敏感性稗草Ec ACO相比,抗性稗草Ec ACO的氨基酸序列存在5个突变位点,其中有3个突变位点位于保守功能域上。q PCR分析显示,Ec ACO在抗性和敏感性稗草中并无明显的表达水平差异。原核蛋白表达和酶活性测定结果表明,敏感型稗草MBP::Ec ACO融合蛋白单位时间内产生的乙烯释放量是抗性稗草MBP::Ec ACO融合蛋白的2.15倍,因而该基因可能解释了稗草的抗药性机理。【结论】从抗二氯喹啉酸的稗草中克隆了Ec ACO,发现了与抗性相关的5个氨基酸突变位点,其中的3个位点突变位于保守结构域,这可能是引起乙烯释放速率降低以及稗草产生二氯喹啉酸抗性的原因。

黄河蜜甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶基因片段的克隆和反义载体的构建

从伤诱导的黄河蜜甜瓜(Cucumismelocv.Huanghemi)成熟果实的中果皮组织中分离总RNA,经反转录和PCR扩增得到974bp的cDNA片段,克隆到质粒载体pGEM-3zf,经测序与Genbank中甜瓜1-氨基环丙烷1-羧酸合成酶(1-amino-cyclopropane-1-carboxylieacidsynthase,ACS)基因同源性为99%。克隆片段经双酶切消化,反向插入到植物表达载体pBI121的35S启动子和NOS终止子之间,构建成ACS基因的反义表达载体。

特异切割番茄1-氨基环丙烷羧酸合成酶mRNA的核酶基因序列的合成与克隆

根据番茄１－氨基环丙烷羧酸合成酶（ＡＣＣ合成酶）基因ｃＤＮＡ序列，按照锤头状核酶作用模式，设计合成长度分别为４０ｍｅｒ和４８ｍｅｒ的一对引物，经体外退火、延伸、连接，插入质粒ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋）的ＫｐｎＩ和ＢａｍＨＩ位点之间，经菌落原位杂交、双酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳和序列分析证明，人工合成了特异切割ＡＣＣ合成酶ｍＲＮＡ第６６７～６６９位点ＧＵＣ序列的核酶基因序列。

结实期籽粒乙烯释放速率和1-氨基环丙烷-1-羧酸浓度与稻米外观品质的关系

为阐明水稻籽粒乙烯与稻米外观品质的关系,试验采用10个不同基因型的水稻材料,测定了结实期籽粒乙烯释放速率、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)浓度和稻米的外观品质,分析了它们之间的关系并用化学调控等方法进行验证。结果表明,灌浆中后期籽粒乙烯释放速率和ACC浓度与稻米的垩白粒率和垩白度均呈极显著的正相关。籽粒中ACC浓度低的品种,胚乳淀粉体排列紧密,间隙较小;而籽粒中ACC浓度高的品种,淀粉体排列疏松,间隙大。在灌浆中后期分别用1μmol/LACC处理稻穗,稻米的淀粉体排列变疏松,垩白粒率、垩白大小和垩白度均显著增加,用1μmol/L氨基-乙氧基乙烯基甘氨酸(ACC合成酶抑制剂)处理稻穗,结果则相反。结实期进行轻干-湿交替灌溉,降低了籽粒乙烯释放速率、ACC浓度和垩白度。说明籽粒中乙烯和ACC对稻米胚乳淀粉结构和外观品质起重要的调控作用,通过品种选育、化学调控和灌溉等措施降低籽粒乙烯释放速率和ACC浓度,可以改善稻米的外观品质。

反式2,3-二芳基取代-1-氨基环丙烷羧酸的合成及其结构研究

芳香醛与马尿酸在Erlenmeyer反应条件下缩合得到 (Z) 2 苯基 4 芳亚甲基 5 ( 4H) 唑酮 ,然后在室温下与芳基重氮甲烷通过非对映高立体选择性 1,3 偶极环加成反应得到螺环化合物 ,再经醇解开环、水解去保护合成出反式 2 ,3 二芳基 1 氨基取代环丙烷羧酸 .通过元素分析 ,IR ,1HNMR ,13 CNMR ,MS和X射线晶体测定 ,确认了它们的化学结构和立体构型 .实验结果表明 ,通过选择适当的芳香醛和芳基重氮甲烷 ,可以得到不同立体构型的反式 2 ,3 二芳基取代 1 氨基环丙烷羧酸 .

黄土高原新造耕地1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACCD)活性菌株的筛选及其功能特性

为了筛选性能良好的新造耕地产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase,简称ACCD)菌株,对菌株进行多项分类鉴定,分离所产生的ACCD菌株并对其性质进行研究。以1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)作为唯一氮源分离纯化普鲁兰酶产生菌,通过形态学鉴定、16S r RNA序列分析等试验确定菌株的分类地位。通过Biolog自动微生物鉴定系统,使用GenⅢ鉴定板进行生理生化测定,以及不同条件下酶活性的检测,研究菌株的产酶特性。通过平皿促生试验,研究菌株不同组分的促生作用。结果表明,从陕北新造耕地样品中分离得到6株ACCD产生菌,经过多项分类鉴定显示,这些菌株主要分为假单胞菌属(Pseudomonas)、肠杆菌属(Enterobacter)、伯克氏菌属(Burkholderia),其中Enterobacter菌株YAnl_w2产酶迅速,在最适温度和p H值条件下ACCD活性达0.54μmol/(mg·h)(以单位质量酶蛋白在单位时间内生成α-丁酮酸的物质的量表示)。促生试验表明,YAnl_w2对麦种具有明显的促生作用,具有促生应用前景。对6株新造耕地分离菌株的多项分类结果鉴定发现,它们均为产ACCD的细菌,其中YAnl_w2菌株ACCD产率、产量较其他来源的酶高,对麦种促生作用明显,具有进一步的研究价值。

应用1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶产生菌提高双孢蘑菇产量

比较了6种覆土处理对双孢蘑菇产量的影响.6种覆土处理分别是常规覆土、常规覆土＋恶臭假单胞菌UW4菌剂（用量为覆土干重的2%）、灭菌常规覆土、灭菌常规覆土＋UW4菌剂（用量为覆土干重的2%）、灭菌蛭石和灭菌蛭石＋UW4菌剂（用量为蛭石干重的2%）.UW4是常用的植物根际促生细菌1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶产生菌.结果表明,灭菌蛭石＋UW4菌剂处理出菇最早,产量最高,无杂菌污染,出菇比其他处理提早1-8 d,比常规覆土提早3 d,第一潮和第二潮菇产量之和比其他处理提高19.8%-115%,比常规覆土提高35.1%.采收二潮菇后,不同处理覆土材料中细菌和ACC脱氨酶产生菌的数量均与菇产量呈显著的正相关.本研究结果提示,灭菌蛭石中添加ACC脱氨酶产生菌剂替代传统覆土是实现双孢蘑菇绿色、高效生产的有效方式。

1-氨基环丙烷-1-羧酸在恶臭假单胞菌趋化双孢蘑菇菌丝中的作用

真菌-细菌生物膜(FBB)在制备高效生物肥料接种剂和生防制剂中发挥着重要作用,探讨FBB的形成机理非常有必要。以双孢蘑菇和恶臭假单胞菌UW4为对象,研究了1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)在双孢蘑菇-细菌生物膜形成过程中的作用。采用PDA平板培养双孢蘑菇菌丝,在距离菌丝尖端边缘处涂布UW4菌悬液,双孢蘑菇菌丝生长速度比涂布超纯水的对照组提高10.85%,同时,显微镜和扫描电镜均可观察到UW4能够在双孢蘑菇菌丝表面形成菌膜。使用ACC合成酶抑制剂氨基氧乙酸(AOA)抑制双孢蘑菇菌丝ACC的合成,则UW4不能在双孢蘑菇菌丝表面形成菌膜。此外,UW4 ACC脱氨酶基因缺失突变株也不能形成菌膜。趋化试验发现,UW4可趋化ACC,趋化强度与双孢蘑菇菌丝分泌物中的强趋化物谷氨酰胺和柠檬酸类似,且ACC最适趋化浓度的趋化强度高于谷氨酰胺和柠檬酸最适趋化浓度的趋化强度。而UW4 ACC脱氨酶基因缺失突变株不能趋化ACC。转录组测序分析ACC对UW4基因表达的影响,发现ACC能够引起UW4中趋化和运动相关基因的表达水平发生显著的上调或下调。以上结果表明,ACC是假单胞菌趋化双孢蘑菇的一种强趋化物质,同时是产ACC脱氨酶细菌在真菌菌丝表面形成菌膜的关键信号物质。

茄子1-氨基环丙烷-1-羧酸合成酶基因的生物信息学及其响应逆境胁迫的表达分析

基于课题组前期得到的茄子低温转录组数据,筛选到1个1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)合成酶基因SmACS。研究发现,SmACS编码的氨基酸序列与大豆ACS的同源性最高,并且含有ACC合成酶特有的7个保守结构域和11个不变的氨基酸残基。该SmACS基因位于第8号染色体上,全长3550 bp,编码序列长1437 bp,含3个内含子和4个外显子,属典型的ACS基因结构。其编码的蛋白质由478个氨基酸组成,分子质量为54.03 kDa,等电点为6.48,亲水系数为-0.206,是一种定位于细胞质的不稳定的非分泌型亲水蛋白;该蛋白的主要构成元件为α-螺旋和无规则卷曲,具有保守的Aminotran_1_2结构域,含有39个磷酸化位点,其中以丝氨酸和苏氨酸为主。SmACS蛋白主要与ACC氧化酶等发生相互作用。该基因启动子中含有脱落酸、乙烯、冷胁迫、水杨酸及伤口响应等有关的顺式作用元件。实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)结果证实,SmACS基因受低温、高温、干旱和盐诱导而上调表达,其中尤以低温胁迫诱导效果最为显著。上述结果可为进一步研究茄子SmACS基因的功能奠定理论基础。

1-氨基环丙烷-1-羧酸的合成方法及其应用

1-氨基环丙烷-1-羧酸是一种非蛋白氨基酸,具有独特的生物活性。本文概述了1-氨基环丙烷-1-羧酸的主要合成方法及其应用。

大豆1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶顺式天然反义转录物的分析鉴定

1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase,ACS)是植物乙烯生物合成途径中的关键酶,催化了乙烯生物合成中由S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)转化为1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate,ACC)这一限速步骤。ACC合酶由多基因家族编码,在转录及转录后水平上受到多种生物和非生物因素的差异调节,其表达调节机制复杂,尚未完全清楚。最近的研究揭示,在植物中发现的一些天然反义转录物(Natural antisense transcripts,NATs)在基因表达调节机制中发挥了不可忽视的作用,因而天然反义转录物的研究受到了广泛的关注。本研究利用RT-PCR法在6种中国东北大豆中克隆出一种ACC合酶基因天然反义转录物,序列测定结果表明这是一种顺式天然反义转录物(cis-NAT),命名为ASACS2。实时定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)测定结果表明,ASACS2与其高丰度表达的正义转录物SACS2伴随表达,并且在营养生长期得到了积累。令人感兴趣的是,6个大豆品种中ASACS2和SACS2的表达量保持一定比例,且表现出品种特异性。目前的研究工作揭示了一种新的NATs可能参与的乙烯生物合成的调控机制,为转基因育种和植物发育调控研究提供了新的思路。

1-氨基环丙烷-1-羧酸的合成工艺研究与优化

以氰乙酸乙酯和1,2-二溴乙烷为起始原料,经环烷化、氰基水解、霍夫曼降解合成得到1-氨基环丙烷-1-羧酸。分两步对该合成工艺进行了研究:第一步考察了环烷化反应的主要影响因素,包括1,2-二溴乙烷、碳酸钾、催化剂、溶剂、反应温度、反应时间;第二步考察了氰基水解反应和霍夫曼降解反应的主要影响因素,包括H2O2的用量、NaOH的浓度、霍夫曼降解的反应温度。在考察各个影响因素的同时,得出了较优的工艺条件。经核磁共振和红外光谱分析,所得产品确为1-氨基环丙烷-1-羧酸。实验结果表明,在优化后的工艺条件下,1-氨基环丙烷-1-羧酸的总收率可以达到67.5%。经高效液相色谱分析,产品的纯度为94.4%。

利用宏基因组学方法对马铃薯中某未培养内生菌的1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶基因(acdS)操纵子进行分析

乙烯前体物1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨基作用对植物十分有利,因而常见于许多植物促生菌中。本研究对马铃薯植株中某内生菌的ACC脱氨酶基因(acdS)进行了分析。采用PCR等方法分析出该内生菌存在2种acdS基因,其中的优势基因与荧光假单胞菌的acdS基因具有较高的同源性。本研究构建了宏基因组文库,并对其进行了功能筛选和序列分析,从PCR文库中成功筛选出含有acdS基因的阳性克隆。对其中一个克隆进行序列分析,从中发现某未培养内生菌acdS基因的整个操纵子,并且acdS基因与该未培养内生菌acdS转录调节因子基因同时出现在操纵子上游,与P.putida UW4菌株中的发现一致。但是,对195个完全测序结果及含有acdS基因的细菌的基因组进行分析,发现大多数菌株(包括许多假单胞菌属的菌株)在acdS基因附近或基因组的其他区域都不含有acdS调节基因,但一些α-和β-变形菌中含有acdR+-acdS+操纵子,其中最主要的是伯克氏菌属。

一种用高效液相色谱-电喷雾/串联质谱(HPLC-ESI/MSn)定量检测植物组织中微量1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)含量的方法

介绍一种用高效液相色谱碳18柱(HPLC-C18)分离、电喷雾串联质谱(ESI-MSn)鉴定和定量检测植物组织中微量1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)含量的方法,其最低检测限达0.7pmol,标准曲线线性符合系数为0.9992。建立了从20～100mg微量植物样品中提取ACC和固相萃取(SPE)预纯化的方法,加样回收率为95.1%±4.2%。此种提取方法结合HPLC-ESI/MSn分析与定性定量检测苹果‘2001富士’中ACC含量为306.6ng·g-1(FW),表明此法适合于定性定量检测植物样品中的微量ACC。

1-氨基环丙烷-1-羧酸及其衍生物的合成研究进展

1-氨基环丙烷-1-羧酸及其衍生物具有重要的生理活性,在植物化学、医药化学及农业科学等方面具有广阔的应用前景。根据三元环部位形成方式的不同,综述了1-氨基环丙烷-1-羧酸及其衍生物的合成方法研究进展。

乙烯和1-氨基环丙烷-1-羧酸处理引起的硬质桃果实的软化和乙烯合成

大多数鲜食桃(Prunus persica L．Batsch)都具有软化质地。这种桃在果实成熟和软化前收获时会快速软化且易于损坏。然而果实品质取决于收获时的成熟度；在树上成熟的桃子品质比收获后成熟的桃子品质优良，因此，收获软化品种的恰当期间很短。

环氧化酶-2的表达与皮肤鳞状细胞癌的关系

环氧化酶（Cyclooxygenase，COX）是前列腺素合成过程中的限速酶，目前发现，COX至少有两种同功酶：即COX-1和COX-2。它们由不同的基因编码，其氨基酸序列的同源性约60％。COX-1是正常细胞的组织蛋白，参与多种生理过程；COX-2则只局限于某些组织如中枢神经系统、眼、肾脏等。但在某些因素如生长因子、内毒素、促肿瘤以及细胞癌基因刺激下可使COX-2诱导性表达。

冷藏后不同处理对1-MCP处理南果梨酯类物质及乙烯合成关键酶的影响

研究1-MCP处理的南果梨冷藏3个月后,乙烯利、水杨酸和茉莉酸甲酯处理对果实常温货架期间酯类物质和1-氨基环丙酸-1-羧酸合成酶(ACS)以及1-氨基环丙酸-1-羧酸氧化酶(ACO)变化的影响。结果表明:经过乙烯利处理的果实丁酸己酯、乙酸庚酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、己酸己酯、乙酸己酯的相对含量均明显高于对照果实;比较3种不同处理果实中ACS和ACO酶活性发现,乙烯利处理的果实ACS酶活性极显著高于对照果实,水杨酸处理果实ACS酶活性显著高于对照果实,而茉莉酸甲酯处理对果实的ACS酶活性无显著影响;乙烯利、水杨酸、茉莉酸甲酯3种处理果实ACO活性与对照差异不显著。由此可知,经1-MCP处理的南果梨冷藏后用乙烯利进行复醒处理可有效提高ACS酶活性,从而提高果实的酯类物质相对含量,使果实表现出浓郁的香气。