1-甲基海因对慢性疼痛大鼠钠离子通道蛋白Nav1.8的干预作用

旨在研究1-甲基海因(1-methylhydantoin,MH)对钠离子通道(Nav channels,Navs)1.8的干预作用,为临床科学治疗疼痛提供理论依据,为实现“疼痛最小化”终极目标拓宽途径。选取60只SPF级SD大鼠通过随机分组设计,各组分别使用1-甲基海因(MH组)、利多卡因(L组)、氨溴索(A组)处理,第21和28天使用蛋白免疫印记法检测大鼠L4~L6段背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)Nav1.8的蛋白表达,采用全细胞膜片钳技术检测MH作用下的Nav1.8通道峰电流。结果表明,与M组相比,MH能使Nav1.8表达显著下降(P<0.05)。MH对Nav1.8通道峰电流具有一定抑制作用,10和100μmol·L^(-1)MH对Nav1.8的电流抑制率分别为6.34%±3.13%和14.6%±1.52%,具有量效关系。提示MH能够下调慢性疼痛大鼠DRG中Nav1.8的表达,同时抑制Nav1.8电流,进而产生镇痛作用。

RP-HPLC测定哈蟆油中1-甲基海因的含量

目的建立哈蟆油中1-甲基海因反相高效液相色谱（RP—HPLC）含量测定方法。方法采用ZORBAX Eclipse XDB—C18柱（4．6mm×150mm，5μm）色谱柱，检测波长为235nm，乙腈-水（10：90）为流动相，流速为0．3mL·min^-1。结果在0．32—1．58μg内峰面积与其浓度呈良好的线性关系（r=0．9999），方法的精密度RSD为0．8％。平均回收率为99.5％，RSD为1．3％。结论测定方法简便快捷、精密度高、准确性好，可以作为哈蟆油中1-甲基海因的测定方法，以控制其原料的质量。

1-甲基海因对哮喘大鼠模型的平喘作用及其机制

目的:探讨1-甲基海因(1-MH)对哮喘及咳嗽动物模型的干预作用,初步阐明其作用机制。方法:选取50只Wistar大鼠,采用卵清蛋白诱发大鼠哮喘后随机分为模型对照组1-MH 20、40、80mg·kg-1剂量组和阳性对照组(氨茶碱60mg·kg-1),另取10只Wistar大鼠作为空白对照组。收集各组大鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),测定白细胞介素5(IL-5)、嗜酸粒细胞趋化因子(Eotaxin)水平及嗜酸性粒细胞(EOS)计数;选取40只引喘合格豚鼠随机分为模型对照组,1-MH 15、30和60mg·kg-1剂量组及阳性对照组(氨茶碱50mg·kg-1),记录各组豚鼠哮喘发生潜伏期;选取豚鼠10只,取支气管放于Krebs液中,记录并计算0.25、0.50和1.00g·L-11-MH对抗磷酸组胺的解痉百分率;选取引咳合格小鼠50只,随机分成1-MH 25、50和100mg·kg-1剂量组及阳性对照组(可待因50mg·kg-1),记录各组小鼠咳嗽潜伏期及3min内的咳嗽次数;选取引咳合格豚鼠40只,随机分成1-MH 15、30和60mg·kg-1剂量组及阳性对照组(可待因20mg·kg-1),记录各组豚鼠咳嗽潜伏期及5min内的咳嗽次数。结果:与致敏模型对照组比较,1-MH 40和80mg·kg-1剂量组大鼠BALF中IL-5、Eotaxin水平及EOS计数明显降低(P<0.05或P<0.01);与乙酰胆碱诱导哮喘模型对照组比较,1-MH 30和60mg·kg-1剂量组豚鼠哮喘发生潜伏期明显延长(P<0.05或P<0.01);与空白对照组比较,1-MH 0.50和1.00g·L-1剂量组豚鼠离体气管平滑肌的解痉百分率明显升高(P<0.01);与小鼠咳嗽模型对照组比较,1-MH 50和100mg·kg-1剂量组小鼠咳嗽潜伏期延长,咳嗽次数减少(P<0.05或P<0.01);与豚鼠咳嗽模型对照组比较,1-MH 30和60mg·kg-1剂量组豚鼠咳嗽潜伏期延长,咳嗽次数减少(P<0.05或P<0.01)。结论:1-MH具有良好的平喘及镇咳作用,平喘作用可能与其抑制气道炎症和直接舒张支气管平滑肌有关。

1-甲基海因对抑郁大鼠行为学的影响及机制初探

目的研究1-甲基海因的抗抑郁作用,并分析其可能的作用机制。方法采用慢性冰水游泳应激(chronic forcedswim stress)方法建立大鼠抑郁模型。氟西汀(10 mg·kg-1)和1-甲基海因(20,40和80 mg·kg-1)在造模完成后灌胃给药,每天1次,连续14 d。观察大鼠体重变化,并用旷场实验和蔗糖偏好实验检测大鼠行为学变化;用酶联免疫吸附法(ELISA)测定大鼠血清皮质酮的含量;用蛋白免疫印迹法(Western blot)分析大鼠海马中脑源性神经营养因子(BD-NF)蛋白的表达水平。结果与正常组比较,慢性应激大鼠的体重减少(P<0.01),在旷场实验中的运动距离减少(P<0.01),血清中皮质酮含量升高(P<0.01),海马中BDNF的蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较,1-甲基海因40mg·kg-1能改善抑郁大鼠体重的下降(P<0.05),增加旷场实验中的运动距离(P<0.01),降低大鼠血清皮质酮的水平(P<0.05),增加大鼠海马中BDNF的蛋白表达(P<0.01)。结论 1-甲基海因具有明显的抗抑郁作用,其机制可能与调节下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能和提高BDNF的表达有关。

基于气相色谱-质谱法的动物类中药材中1-甲基海因分布研究

目的 气相色谱-质谱法联合测定8种动物类中药材1-甲基海因的分布情况。方法 采用HP-5ms毛细管柱(30 m×0.25mm,0.25μm)。程序升温,初始柱温为60℃,保持1 min,以20℃/min升温至260℃。进样口温度为265℃,离子源温度为230℃。对蛤蚧各个解剖部位进行测定,并同时测定蛤蟆油、乌蛇、海蛇、地龙、全蝎、阿胶和紫河车中1-甲基海因含量。结果 1-甲基海因在0.1~100.0μg/m L浓度范围内线性关系良好(r=0.999 2),平均加样回收率为96.82%,相对标准差(RSD)为0.9%。蛤蚧头、脊椎、骨骼肌、四肢、皮肤和尾部含量分别为0.74、1.21、4.04、1.28、0.84、40.28μg/g;乌蛇和海蛇含量分别为2.84、10.43μg/g;蛤蟆油中含量为4.45μg/g。结论 气相色谱-质谱法能够准确测定动物类中药材中1-甲基海因含量;1-甲基海因为多种中药材共有成分,可能是蛤蚧、乌蛇、海蛇和蛤蟆油的共同药理活性基础物质之一。

1-甲基海因的合成及其晶体结构分析

以甲胺、氯乙酸钠、氰酸钠等为原料,用"一锅法"合成1-甲基海因,合成总收率为62.9%.单晶经X射线衍射方法解析,其晶体属于单斜晶系,P21空间群,其中a=0.558 9(3)nm,b=1.217 6(6)nm,c=0.809 0(4)nm;β=105.330(7)°;V=0.531 0(5)nm3;Z=4,Dc=1.427 mg/m3,μ=0.116 mm-1,F(000)=240.

GC-MS法测定血中1-甲基海因含量及其法医学应用

目的建立全血中1-甲基海因的气相色谱-质谱(GC-MS)分析方法,为1-甲基海因相关法医学鉴定案件提供技术支持。方法取0.5 m L血样,加入500 ng内标盐酸双苯戊二氨酯(SKF_(525A))、0.01 mol/L稀盐酸溶液2 m L,加入碳酸铵0.5 g调节p H值为9,加入乙酸乙酯2 m L,然后离心,取有机溶剂层,吹干后进行GC-MS分析。结果血液中1-甲基海因在0.5~50 ng/m L范围内线性关系良好,线性回归方程为y=0.015 51 x+0.007 26(R^2=0.999 7),最低检出限为0.1 ng/m L,回收率为93.02%~108.12%,日内、日间精密度分别小于6.07%和13.37%。结论本方法测定所得结果准确,重现性好,可用于血样中1-甲基海因含量的测定。

5-羟基-1-甲基海因对百草枯中毒所致肺损伤保护作用的代谢组学研究

目的探讨5-羟基-1-甲基海因(HMH)对百草枯(PQ)中毒所致肺损伤的保护作用及其机制。方法采用随机数字法将30只SPF级小鼠分为生理盐水(NS)组、PQ组和HMH组,每组10只。取各组小鼠肺组织行代谢组学分析;切片并行HE染色,观察肺组织形态学改变;检测超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量;用Western blotting检测肺组织血红素氧合酶1 (HO-1)蛋白表达情况。结果光镜下,PQ组肺组织可见大量炎症细胞浸润,出血明显,肺泡腔透明膜形成;HMH组肺泡结构轻度损坏,少量炎症细胞渗出及出血。与NS组相比,PQ组和HMH组肺组织的MDA含量显著升高,SOD活性显著下降,PQ组HO-1蛋白表达增高;与PQ组相比,HMH组SOD活性及HO-1蛋白表达增高,MDA含量降低。与PQ组比较,HMH组N-乙酰天冬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸含量增加;腺苷5’-磷酸、甲基丙二酸、胞嘧啶核苷、甲基富马酸升高;亚牛磺酸、苯甲酰S-二氧化物、磷酸乙酸含量升高;皮质甾酮、前列腺素G、4-吡哆酸、柠檬酸、黄嘌呤含量降低。结论 HMH能提升PQ中毒损伤肺组织的SOD活性,降低MDA水平,增加HO-1蛋白表达,并能纠正PQ导致的三羧酸循环紊乱,改善脂质过氧化,影响嘌呤、嘧啶和氨基酸的代谢。

青环海蛇中有效物质1-甲基海因的含量测定

目的建立HPLC法测定青环海蛇中有效物质1-甲基海因的含量。方法Dikma inertsil SIL-100A（4．6mm×250mm，5μm）色谱柱，流动相为正己烷-乙醇（82：18，V／V），检测波长为218nm，流速为1．0ml·min^-1，柱温为25℃。结果1－甲基海因质量在0．448—1．568μg之间线性良好，r＝0．9995；平均加样回收率为99．34％，RSD为2．12％。结论该测定方法简便快捷、准确性好、精密度高，可用于青环海蛇中有效物质1－甲基海因的含量测定，为海蛇质量标准的建立提供依据。

HPLC法比较哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因的含量

建立高效液相色谱法测定1-甲基海因含量的方法,比较哈蟆油和哈蟆卵中其含量。色谱柱:Venusil MP-C_(18)(4.6 mm×150 mm,5μm);检测波长:215 nm;流动相:100%水;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃。结果表明,1-甲基海因在35.110 0～0.351 1μg/mL线性关系良好(r=0.999 9);哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因的平均回收率(n=6)分别为100.55%和100.87%。该方法简便、准确、重复性好,可作为哈蟆油和哈蟆卵中1-甲基海因含量的测定方法。

对中国药典用1-甲基海因鉴别哈蟆油方法的商榷

目的检测哈蟆油及林蛙各组织中1-甲基海因(1-methylhydantoin,1-MID)。方法采用GC-MS法测定哈蟆油及林蛙各组织中1-MID。结果哈蟆油及林蛙其他组织均可检出1-MID。结论建立了哈蟆油中1-MID测定的方法;在林蛙的有关组织中均检测到含量不等的1-MID,用1-MID作为哈蟆油真伪鉴别的专属性有待研究。

不同哈蟆油加工品中1-甲基海因含量的比较

利用HPLC法建立了一种测定不同哈蟆油加工品中1-甲基海因含量的方法。采用AlltimaTMC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为纯净水,进样量为10μL,检测波长为215nm。1-甲基海因质量浓度在2.04~102μg/mL范围内线性关系良好,平均回收率为99.76%(RSD为1.45%),精密度试验、重复性试验、稳定性试验均符合要求。该方法简便,准确度高,对哈蟆油不同加工方法的研究具有指导性意义,为其进一步产品研发奠定基础。

1-甲基海因的合成

以丙烯腈工段副产的氢氰酸为原料,经4步反应制备了1-甲基海因,总收率为75.0%。较佳工艺条件是：1）羟基乙腈的制备。以氢氧化钠为催化剂,反应温度为10～15℃,收率达98%。2）甲氨基乙腈的制备。n（甲胺）∶n（羟基乙腈）=1.1∶1,反应温度为15～20℃,收率达96.3%。3）肌氨酸的制备：n（甲氨基乙腈）∶n（氢氧化钠）=1∶1.2,反应温度90℃,收率达96%。4）1-甲基海因的制备：n（肌氨酸）∶n（氰酸钠）∶n（硫酸）=1∶1.5∶0.15,反应温度100℃,收率达83%。

5-羟基-1-甲基海因对百草枯中毒小鼠肾损伤的防护作用研究

目的探讨5-羟基-1-甲基海因(HMH)对百草枯(PQ)中毒所致肾损伤的防护作用及机制。方法采用随机数字表法将15只SPF级健康昆明小鼠分为生理盐水(NS)对照组、PQ中毒模型组和HMH干预组,每组5只。采用一次性灌胃30mg/kgPQ溶液制备PQ中毒模型;NS组灌胃等量NS;HMH组于制模后立即给予100mg/kg的HMH继续灌胃。于HMH灌胃后1d处死各组小鼠并留取心脏血和肾脏组织备检。采用苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察肾组织形态学改变;按照试剂盒说明书步骤检测肾组织丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用蛋白质免疫印迹试验(WesternBlot)检测肾组织血红素氧合酶-1(HO-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)蛋白表达;采用气相色谱质谱联用法(GC-TOF-MS)检测血清代谢产物,用主成分分析法(PCA)观察各组样本之间的整体分布状况,用多维分析法正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)评价模型的准确性,以重要性投影(VIP)值>1来筛选有差异的代谢物。结果光镜观察显示:NS组肾小球结构清晰,肾间质及血管周围无充血、无炎性细胞浸润;PQ组部分肾小球萎缩坏死,肾小球内毛细血管充血,周围炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞肿胀,管腔轻度狭窄,偶尔出现上皮细胞坏死脱落;HMH组肾损伤程度较PQ组明显减轻。与NS组比较,PQ组肾组织MDA含量显著增加(nmol/g:6.70±0.84比2.70±0.43,P<0.01),SOD活性显著降低(kU/L:33.30±4.66比50.20±3.23,P<0.05),肾组织HO-1、IL-1β蛋白表达水平显著增加(HO-1/β-actin:1.11±0.12比0.61±0.13,IL-1β/β-actin:0.93±0.13比0.32±0.06,均P<0.05)。与PQ组比较,HMH组MDA含量显著下降(nmol/g:5.10±0.93比6.70±0.84,P<0.05),SOD活性显著增加(kU/L:61.00±9.02比33.30±4.66,P<0.05),HO-1蛋白表达水平显著下降(HO-1/β-actin:0.77±0.07比1.11±0.12,P<0.05),而IL-1β蛋白表达水平差异无统计学意义(IL-1β/β-actin:0.87±0.13比0.93±0.13,P>0.05)。代谢产物检测结果显示:与NS组比较,PQ组肌酐、甘氨酸、琥珀酸、富马酸、柠檬酸水平显著增加(VIP值分别为1.50、1.58、1.64、1.74、1.95,均P<0.05),而软脂酸、α-生育酚和6-磷酸葡糖酸水平显著下降(VIP值分别为1.10、1.55、1.56,均P<0.05)。与PQ组比较,HMH组肌酐、柠檬酸水平显著下降(VIP值分别为1.50、1.86,均P<0.05),而反式4-羟基-脯氨酸、D-甘油酸、果糖-2,6-二磷酸、6-磷酸葡糖酸、氨基丙二酸水平显著增加(VIP值分别为1.36、1.55、1.63、1.68、1.76,均P<0.05)。结论HMH通过纠正三羧酸循环紊乱、脂质过氧化、能量代谢紊乱,从而防护PQ中毒致肾损伤,其机制与通过Nrf2通路调控HO-1蛋白表达有关。

5-羟基-1-甲基海因对百草枯所致大鼠肾毒性防护作用的实验研究

目的探讨5-羟基-1-甲基海因（HMH）对百草枯所致大鼠肾损伤的保护作用及其可能机制。方法将24只雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组、百草枯组、维生素C组、HMH组4组，每组6只。对照组腹腔注射无菌生理盐水2 mg/kg；百草枯组腹腔注射等体积稀释的百草枯溶液50 mg/kg；维生素C组和HMH组腹腔注射百草枯溶液的同时分别灌胃维生素C或HMH溶液1 mmol/kg。应用Fenton法测定HMH和维生素C清除羟自由基的能力。各组分别于染毒后24 h采血并处死动物取肾组织，测定血清尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）及肾皮质蛋白、丙二醛（MDA）、还原型谷胱甘肽（GSH）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果维生素C和HMH均有很好的清除羟自由基的能力，50%抑制浓度（IC50值）均为4.02 mg/mL。与对照组比较，百草枯组血清BUN、SCr及肾组织MDA含量显著升高，肾组织蛋白、GSH含量及SOD活性显著下降〔BUN（mmol/L）：40.80±2.49比13.67±1.58， SCr（μmol/L）：163.46±8.67比51.80±4.37， MDA（nmol/g）：7.51±0.23比4.52±0.33，蛋白（μmol/L）：0.94±0.14比1.35±0.10， GSH（mg/g）：1.08±0.48比3.30±0.44， SOD（kU/L）：70.74±6.42比112.89±8.72，均P＜0.01〕。与百草枯组比较，维生素C组和HMH组血清BUN、SCr及肾组织MDA显著下降，肾组织GSH含量和SOD活性显著升高〔BUN（mmol/L）：22.64±2.36、18.71±5.23比40.80±2.49， SCr（μmol/L）：97.28±4.81、89.20±6.72比163.46±8.67， MDA（nmol/g）：4.67±0.31、4.21±0.42比7.51±0.23，GSH（mg/g）：1.78±0.10、1.86±0.39比1.08±0.48，SOD（kU/L）：98.69±5.43、103.76±4.45比70.74±6.42，均P＜0.01〕；HMH组较维生素C组可显著降低SCr含量（P＜0.05），而两组在血BUN及肾组织MDA、GSH含量和SOD活性方面差异无统计学意义（均P＞0.05）。结论 HMH能防护百草枯所致的大鼠肾损伤，其机制可能与其抗氧化和清除羟自由基的作用有密切关系。

HPLC法测定脱脂林蛙油胶囊中1-甲基海因的含量

为了建立脱脂林蛙油胶囊的质量标准，试验采用高效液相色谱法（HPLC法）对脱脂林蛙油胶囊中1-甲基海因的含量进行测定。流动相与甲醇-水按照5：95配比，检测波长为210nm。结果表明：1-甲基海因在2．0832—12．4992μg／mL（r=0．9998）范围内线性关系良好，平均回收率为99．20％，相对标准偏差（RSD）=0．64％，n=6。说明此方法的专属性强，可以作为控制脱脂林蛙油胶囊质量的检测方法。

基于代谢组学研究1-甲基海因对百草枯中毒防护机制

目的基于气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)分析1-甲基海(MH)因防护百草枯(PQ)中毒模型,研究其代谢组学特征及其密切相关的代谢产物,探讨其分子机制及特征代谢物的潜在临床价值。方法PQ组为灌胃30mg/kg百草枯建立昆明小鼠中毒模型,PQ+MH组为灌胃30mg/kg百草枯后腹腔注射100mg/kg的MH生理盐水溶液,NS组为灌胃30mg/kg后腹腔注射100mg/kg生理盐水的对照组。实验结束时取脏器和血液,染色、分析,应用GC-MS技术分别对三组小鼠血清样本进行检测,多变量统计学分析,筛选出具有显著意义的差异代谢物。结果1-甲基海因干预后,百草枯中毒小鼠肾组织的炎症情况改善,SOD活性显著升高,MDA含量显著降低,血清中代谢产物硬脂酸、软脂酸、丝氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、2-羟基丁酸,草酸,3-羟基丙酸、牛磺酸、6-磷酸葡糖酸、阿拉伯糖醇、甘油酸的含量增加。结论1-甲基海(MH)具有抗氧化性和减轻百草枯致肾损伤的作用,与对氨基酸代谢、糖代谢、脂肪酸代谢的调节相关。

涉案乌头生物碱与1-甲基海因的LC-MS/MS快速检测

建立生物检材中1-甲基海因和乌头生物碱的快速分析方法,并提示检材新鲜度与1-甲基海因含量的相对关系。取全血样品经乙腈提取,使用Agilent Poroshell 120 SB-C_(18)(2. 1 mm×100 mm,2. 7μm)色谱柱,以0. 1%甲酸溶液-乙腈(30:70,V/V)为流动相等度洗脱,在多反应监测模式下测定全血样品中1-甲基海因和乌头生物碱成分。用于定量分析的离子对分别为1-甲基海因:m/z 115. 1 [M+H]^+→42. 2,乌头碱:m/z 646. 4 [M+H]^+→586. 3,新乌头碱:m/z 632. 3 [M+H]^+→572. 4和次乌头碱:m/z 616. 3 [M+H]^+→556. 3。4种目标物在各自的浓度范围内线性关系良好(R2≥0. 99),3个添加浓度(5,50,250 ng/mL)下,回收率在85. 7%～95. 2%之间,检出限(S/N=3)在0. 05～0. 5 ng/mL范围内,定量限(S/N=10)在0. 2～1 ng/mL范围内。利用建立的检测方法,发现与检材新鲜度有关的1-甲基海因和乌头生物碱的检出量有密切关系,为法医学鉴定结论的科学性服务。

化学发光法测定水中1-溴-3-氯-5,5-二甲基海因

基于在碱性条件下 (p H 12 .0— 12 .5 ) 1-溴 - 3-氯 - 5 ,5 -二甲基海因与鲁米诺 -过氧化氢体系反应产生化学发光的性质 ,建立了一种测定其含量的新方法。 1-溴 - 3-氯 - 5 ,5 -二甲基海因的浓度在 4 .0× 10 -8— 1.0×10 -6mol/ L范围内与化学发光强度呈良好的线性关系。本方法的线性范围宽 ,灵敏度高 ,检出限为 2 .0×10 -8mol/ L。操作简单、方便。应用于游泳池水中 1-溴 - 3-氯 - 5 ,5 -二甲基海因的测定 。

1-溴-3-氯-5,5-二甲基-2,4-咪唑啉啶二酮的合成

用溴化钠代替溴酸钠或溴素提供一个卤原子,在碱性条件下5,5-二甲基海因与氯气发生卤化反应合成1-溴-3-氯-5,5-二甲基海因。工艺最佳反应条件为:pH为9.0,反应温度5～10℃,反应3h,保温1h,BCDMH的收率可达98%以上。