酶法测定1-磷酸葡萄糖的含量

建立反应液中1-磷酸葡萄糖(G-1-P)的测定方法.分别在样品中加入PGluM(EC5.4.2.2)、G6P-DH(ECl.1.1.49)和氧化型辅酶Ⅱ(β-NADP),通过测定还原型辅酶Ⅱ(β-NADPH)吸光值的变化(△A)来确定样品中G-1-P的含量.G-1-P在0～400 mg/L范围内与△A呈线性关系,r2=0.999 8,其平均回收率为100.88%(RSD=0.52%).该法快速、灵敏、准确.

酶法制备1-磷酸葡萄糖合成条件的响应曲面法优化

以葡萄糖为原料,三聚磷酸钠为磷酰化试剂,马铃薯磷酸化酶为催化剂,制备1-磷酸葡萄糖。利用Box-Behnken实验设计原理,采用三因素三水平的响应面分析法,以产物含量为响应值考察温度、物料比(葡萄糖/三聚磷酸钠)、时间3个因素影响。采用氢核磁共振波谱仪对产品进行了分析。结果表明,马铃薯磷酸化酶制备葡萄糖磷酸酯的最佳工艺条件为:温度35℃,葡萄糖与三聚磷酸钠物料比为1.35∶1(mol/mol),时间19 h。

锦鲤N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶α/β亚基(GNPTAB)的生物信息学分析及其组织分布和时序表达

论文旨在研究锦鲤(Cyprinus carpio var. koi)GNPTAB(alpha/beta subunits of N-acetylglucosamine-1-phosphotransferase)基因的分子生物学特征及对维氏气单胞菌感染的应答规律。对锦鲤GNPTAB基因CDS区进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术研究GNPTAB基因的组织分布和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)感染机体后的时序表达规律。结果显示,GNPTAB基因CDS区片段长度为3 747 bp,推测编码1 248个氨基酸,含有4个结构域。实时荧光定量PCR分析显示,GNPTAB基因在健康锦鲤各组织中均有表达,在肝脏表达量最高,其次是肌肉、肠道、脾脏、皮肤、中肾、头肾。维氏气单胞菌人工感染锦鲤6~72 h,GNPTAB基因在肠道组织主要呈现上调表达,在肝脏、头肾、脾脏、皮肤、肌肉组织中主要呈现下调表达。维氏气单胞菌感染锦鲤后,GNPTAB基因在这些组织中出现表达差异,推测GNPTAB参与了机体的病理生理过程或免疫应答反应。

紫外诱变枯草芽孢杆菌选育葡萄糖-1-磷酸高产菌株

对出发菌株进行紫外诱变以获得葡萄糖-1-磷酸产量高且遗传稳定性好的枯草芽孢杆菌菌株。以葡萄糖-1-磷酸的发酵产量为考察指标,采用HPLC-MS检测方法,对出发菌株Bacillus sublitis XH-13进行三轮紫外诱变,并对获得的高产菌株连续传代6次。结果表明,枯草芽孢杆菌突变菌株UV3-8的葡萄糖-1-磷酸产量最高,达到6.85 g/L,是出发菌株产量的1.54倍,且遗传稳定性好。菌株Bacillussubtilis XH-13_UV3-8的营养简单、葡萄糖-1-磷酸产量高且遗传稳定性好,具有产业化应用前景。

响应面法优化Bacillus subtilis XH-13_UV3-8产葡萄糖-1-磷酸的发酵条件

应用响应面法对Bacillus subtilis XH-13_UV3-8生产葡萄糖-1-磷酸的发酵条件进行了优化。首先采用Plackett-Burman设计法对12个相关影响因素的效应进行评价,筛选出了有显著正效应的酵母浸粉浓度和K2HPO4·3H2O浓度和有显著负效应的pH等3个因素;接着用最陡爬坡路径逼近最大响应区域;最后通过Box-Behnken设计法,利用Design-Expert软件进行二次回归分析,得到主要因素的最佳条件为:酵母浸粉0.8%、K2HPO4·3H2O0.7%和pH6.6,在此优化培养条件下,发酵液中葡萄糖-1-磷酸浓度从6.85mg/mL提高到8.56mg/mL。

高产胞外葡萄糖-1-磷酸菌株的筛选及鉴定

采用平板初筛、摇瓶复筛结合TLC和HPLC-MS检测的方法,从有机物丰富的土壤中筛选到一株以麦芽糖为底物直接发酵高产胞外葡萄糖-1-磷酸的菌株;经形态学、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析,鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌。

葡萄糖-1-磷酸对灵芝多糖合成的影响

在以葡萄糖为唯一碳源进行灵芝液态发酵时,通过添加不同浓度的代谢中间产物葡萄糖-1-磷酸,研究其对灵芝胞外多糖产量、单糖组成、合成途径相关酶的影响,从而确定影响灵芝多糖单糖组成的关键酶。结果显示,添加葡萄糖-1-磷酸对灵芝多糖产量和多糖的单糖组成并无明显影响。在检测的3种灵芝多糖合成关键酶中,葡萄糖-1-磷酸的添加抑制磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、磷酸葡萄糖异构酶(PGI)的酶活,对磷酸甘露糖异构酶(PMI)无明显影响。此外,通过相关性分析后发现,发酵过程中半乳糖和甘露糖比例的变化分别与PGM和PGI、PMI具有相关性。本文结果对实现灵芝多糖代谢的灵活调控提供有益的参考。

重组Pyrococcus furiosus葡聚糖磷酸化酶催化淀粉合成葡萄糖-1-磷酸

将Pyrococcus furiosus来源的编码葡聚糖磷酸化酶的glg P基因进行稀有密码子优化,在E.coli中重组表达并催化淀粉合成G-1-P。在反应条件优化基础上,以不同的淀粉为底物,GPase均表现出较强的催化能力。在原料预处理、高浓度底物催化及补料催化研究的基础上,以7.5%玉米淀粉为初始底物,反应16 h后补入2.5%玉米淀粉,继续反应32 h,G-1-P产量达250.34 mmol·L^(-1),底物转化率达65.1%,与相同浓度的可溶性淀粉相比,G-1-P产量及转化率(252.9mmol·L^(-1),65.9%)均相近,表明廉价易得的玉米淀粉可以代替可溶性淀粉为原料生产G-1-P,大幅降低G-1-P生产的原料成本。

纳米磁粉固定化酶催化合成α-D-葡萄糖-1-磷酸(英文)

建立了以麦芽糊精和磷酸盐为底物,在常温下合成α-D-葡萄糖-1-磷酸的生物催化体系.从大肠杆菌K12中克隆表达了麦芽糊精磷酸化酶,并固定化在氨基修饰的磁性纳米颗粒上,以便于酶的回收和重复利用.在优化的反应条件下,于200ml体系中连续使用该固定化酶8批次,催化合成了α-D-葡萄糖-1-磷酸.经过简单的纯化步骤,最终得到440mg产品,分离产率为70.5%.

C端非催化结构域对嗜热α-葡聚糖磷酸化酶TsGP酶学性质的影响

为获得异源表达水平与酶学性质良好的α-葡聚糖磷酸化酶并考察结构域对酶的影响,研究通过数据库挖掘和序列分析,获得了来源于超级嗜热古菌Thermococcus sp.EP1的新型α-葡聚糖磷酸化酶TsGP。利用AlphaFold2预测三维结构确定TsGP的C端为非催化结构域后,构建了C端截短的突变体ΔTsGP。在E.coli BL21(DE3)中对TsGP与ΔTsGP进行异源重组表达,并对其酶学性质进行了表征。结果表明,ΔTsGP在大肠杆菌中的表达水平较TsGP提高了3.76倍。在最适反应温度为70℃时,ΔTsGP的比酶活为23.87 U/mg,较TsGP提高1.3倍。在50~65℃的工业酶催化条件下,ΔTsGP的热稳定性与TsGP相当,且酶活力更高。此外,ΔTsGP与TsGP具有相同的底物特异性,最小底物为麦芽三糖,且随着底物链长的增加,比酶活逐渐提升。以麦芽七糖为底物,ΔTsGP的kcat值为37.09 s^(−1),比TsGP提高了1.21倍,但底物亲和力(K_(m)=3.30 mmol/L)降低了2.77倍。研究通过结构分析与非催化结构域截短策略成功提高了TsGP在大肠杆菌中的表达水平和工业酶催化条件下的比酶活。这为αGP酶蛋白的高效表达与应用提供了借鉴,并为进一步通过工程改造优化其性能奠定了基础。

微生物磷酸葡萄糖变位酶的研究进展

从磷酸葡萄糖变位酶对碳代谢和细菌细胞形态的影响、细菌致病性、在细菌高效产氢中的作用、细菌脂多糖生物合成中的作用和维持酵母细胞内Ca2+平衡的作用等方面,介绍了微生物磷酸葡萄糖变位酶的研究进展。

羽毛针禾(Stipagrostis pennata)葡萄糖-6-磷酸-1-差向异构酶基因SpG6P1E的克隆与表达分析

葡萄糖-6-磷酸-1-差向异构酶(G6P1E)在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。本研究旨在通过克隆和分析沙漠植物羽毛针禾(Stipagrostis pennata)葡萄糖-6-磷酸-1-差向异构酶基因(SpG6P1E),为进一步探究其影响羽毛针禾根部沙套发育的机制及功能奠定基础。利用分子克隆技术从羽毛针禾中克隆获得一个SpG6P1E基因,该基因编码一个含有325个氨基酸的蛋白质,定位于细胞质,为亲水性稳定蛋白。序列及进化分析表明该基因含有一个保守性很高的醛糖异构酶(Aldose_epim)结构域,且与单子叶植物的直系同源基因亲缘性更高。亚细胞定位分析显示该基因定位于细胞质,参与胞质糖代谢过程。qRT-PCR结果显示SpG6P1E基因的表达与羽毛针禾沙套发育过程及可溶性糖含量具有较高的相关性,表明其对于沙套发育的重要作用;SpG6P1E基因的表达显著受到干旱、高温、盐等多种非生物胁迫的诱导,表明其对于胁迫响应的重要作用。蛋白互作网络及注释分析显示SpG6P1E可能通过参与糖合成和糖代谢等一系列过程进而影响羽毛针禾可溶性糖的含量。本研究结果为深入研究SpG6P1E基因的功能及其调控植物组织发育和适应逆境的机制奠定了基础。

应用PCR-RFLP调查武汉汉族人群PGM1基因型

目的PCR RFLP技术调查武汉地区汉族人群PGM 1基因型。方法应用PCR RFLP技术检测PGM 1基因型 ,调查 3 0 0例汉族无关个体。扩增PGM 1基因外显子 4和 8中的靶片段 ,并分别经过Bg1Ⅱ和NlaⅢ限制酶消化。酶切片段经聚丙烯酰胺凝胶电泳分型。结果PGM 1 RFLP技术可分出 9种基因型 ,在汉族人群 ,PGM 1 RFLP系统的个体识别能力为 0 745 0。与传统的PAGE酶型检测比较 ,本法不能区分 1+ 2 -和 1-2 +型 ,不能检测出PGM 1稀有基因 ,但克服了IEF无法分析微量、陈旧材料的缺点 ,对保存 2 5年陈旧血痕及 0 1ng模板DNA均能成功分型。 结论PGM 1

溶酶体代谢酶甘露糖-6-磷酸糖基化修饰关键酶UCE的异源表达及功能鉴定

目的 利用大肠杆菌表达系统对溶酶体代谢酶甘露糖-6-磷酸(M6P)糖基化修饰的关键酶N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸二酯α-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶(UCE)进行异源表达和功能鉴定。方法 通过UCE的氨基酸序列分析,分别截去UCE的信号肽、前体肽、跨膜区、胞浆尾肽等结构域,形成不同形式的截短型UCE。利用促溶标签麦芽糖结合蛋白(MBP)的载体和大肠杆菌表达系统,对不同的截短型UCE进行表达。将表达的可溶性融合蛋白利用Ni离子琼脂糖凝胶进行亲和层析纯化,并利用UDP-Glo试剂盒测定融合蛋白的活性。结果 截短型的UCE-MBP融合蛋白能够被可溶性地融合表达,并且能够利用Ni离子琼脂糖凝胶进行亲和层析纯化。去掉其前体肽和仅保留核心区的UCE融合蛋白能够展现出较高的活性。结论 利用促溶标签蛋白能够实现UCE在大肠杆菌中可溶性地融合表达,从而能够快速制备大量的UCE,该酶可用于对溶酶体代谢酶体外糖基化的生物催化修饰。

间歇式加氢技术合成α-D-葡萄糖-1-磷酸酯

以干燥D-葡萄糖为原料经过乙酰化、端基水解、端基磷酸化、加氢裂解及脱乙酰基4步反应合成了目标产物。产品经FTIR、1HNMR及13C NMR分析确认为α-D-葡萄糖-1-磷酸酯。

大黄素-大黄素甲醚型二蒽酮化合物安全性研究

目的:评价大黄素-大黄素甲醚型二蒽酮化合物的潜在肝毒性风险。方法:采用计算机分子对接构建尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸转移酶1A1 (UGT1A1)与反式-大黄素-大黄素甲醚二蒽酮(trans-EPD)、顺式-大黄素-大黄素甲醚二蒽酮(cis-EPD)的结合模型,考察化合物与酶蛋白的结合位点及结合强弱;体外采用大鼠肝微粒体酶抑制实验评价化合物对UGT1A1的抑制作用;通过细胞增殖与活性检测试剂盒-8 (CCK-8)评价化合物对肝细胞活力的影响;采用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)实验检测肝细胞中UGT1A1 mRNA水平。结果:计算机分子对接实验结果显示,trans-EPD及cis-EPD均与UGT1A1结合于site F区;体外酶抑制实验及细胞毒性实验证明,transEPD和cis-EPD均可显著抑制UGT1A1活性,下调其基因表达,产生肝细胞毒性作用。结论:具有大黄素(10→10′)大黄素甲醚或大黄素(10→10′)大黄素甲醚母核结构的二蒽酮化合物可能是一类具有潜在肝毒性的化合物,其作用靶点为胆红素代谢酶UGT1A1。研究结果为此类成分的临床安全用药提供参考。

原位检测组织非特异碱性磷酸酶活性的二维相关分析校正

在以人成骨肉瘤细胞株(Saos-2)为模型,利用α-D-葡萄糖-1-磷酸(α-G-1-P)为生理底物,原位检测组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP)活力时,红外(IR)光谱峰位选取不准确和谱带严重重叠无法分辨/分离等都将给酶活力的测试结果带来偏差。二维相关分析与IR光谱的结合使用将在一定程度上改进上述问题,将在文中具体阐述。

紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种革兰氏阳性菌,具有种类多、分泌蛋白能力强、安全性好等优点,是一种重要工业酶和工业制剂的菌种,被广泛应用于医药、食品、农业、饲料、造纸和纺织等多种领域。为了进一步提高枯草芽孢杆菌的发酵能力,采用紫外线照射的方法诱导筛选高产菌株。对通过紫外线诱导提高枯草芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶、α-乙酰乳酸脱羧酶(α-acetolactate decarboxylase,简称α-ALDC)、3-羟基丁酮(Acetoin)和葡萄糖-1-磷酸(Glucose-1-phosphate,简称G-1-P)能力的条件进行了比较。

大肠杆菌细胞壁肽聚糖的化学修饰及荧光标记

【目的】发展一种活细菌细胞壁荧光标记方法,为后期研究细菌肽聚糖的生物合成和代谢规律以及其与细菌感染致病的关系提供新的工具。【方法】对细菌肽聚糖的生物合成前体N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸(GlcNAc-1-P)进行化学修饰,设计并合成含有叠氮基的GlcNAc-1-P类似物(化合物5:Ac3GlcNAz-1-P)。将该类似物与细菌共同孵育,使其作为探针进入细菌肽聚糖天然合成途径。之后提取并酶解肽聚糖组分,用红外光谱(FTIR)和液质联用(LC/MS)检测探针是否通过代谢进入细菌肽聚糖结构中。同时用外源荧光素对代谢掺入细菌肽聚糖中的探针进行染色。在激光共聚焦显微镜下观察对活细菌的荧光标记效果。【结果】通过四步有机合成反应,以79%的总收率成功获得了化合物5。将大肠杆菌(Escherichia coli BL21)作为模式菌株与化合物5共孵育后,其肽聚糖组分的LC/MS和FTIR分析结果均显示探针可以被细菌利用并被代谢掺入到肽聚糖结构中。激光共聚焦显微镜观察结果显示,荧光素可以高效标记表面携带有生物正交探针的大肠杆菌。【结论】设计合成了一种新型探针,可用于活细菌成像,为深入研究细菌肽聚糖的生物学功能及其与细菌感染致病的关系提供了一种简便的方法。