桑叶中1-脱氧野尻霉素的提取及含量对比研究

研究了桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的提取条件,并采用高效液相色谱-紫外检测法测定前期研究筛选出的9种运城市优势桑树品种中的1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量。以提取温度、提取功率、提取时间为影响因素,采用单因素试验确定各因素最优水平,并在此基础上进行三因素三水平正交试验优化提取条件,得出最佳提取条件为:提取温度70℃,提取功率350 W,提取时间60 min。在此提取条件下峰分离完好,无拖尾、无连续;1-脱氧野尻霉素在0.1~1.5 mg/mL质量浓度范围内,线性关系良好(R^(2)=0.9989);测得不同品种桑叶中1-脱氧野尻霉素含量有差异,赤红大叶(8-12)中1-脱氧野尻霉素含量最高(1.545 6 mg/g),黄格鲁(8-15)中1-脱氧野尻霉素含量最低(0.112 5 mg/g)。此方法操作简单,适用于桑叶中1-脱氧野尻霉素提取及含量测定。

高糖环境下药桑提取物脱氧野尻霉素对MC3T3-E1细胞的影响

目的研究药桑提取物脱氧野尻霉素(1-Deoxynojirimycin,DNJ)在高糖环境下对MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化的作用。方法取P4代MC3T3-E1细胞,在50 mmol/L的高糖环境下通过细胞毒性检测试剂盒(Cell dountingkit-8,CCK-8)检测不同浓度的DNJ(10 mmol/L、1 mmol/L、100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、100 nmol/L、10 nmol/L、1 nmol/L)干预对MC3T3-E1细胞增殖的影响,筛选出后续实验研究的DNJ浓度。取培养至对数生长期的MC3T3-E1细胞,按不同干预方式分为:空白组(完全培养基)、高糖组(50 mmol/L糖浓度的完全培养基)、实验组[50 mmol/L糖浓度的完全培养基+不同浓度DNJ(100、10、1μmol/L)溶液]。使用流式细胞技术检测细胞的凋亡和活性氧,采用ELISA试剂盒检测细胞上清液中AGEs和IL-1β、IL-6、TNF-α的含量,通过碱性磷酸酶染色及活性检测MC3T3-E1细胞的早期成骨能力的影响,通过茜素红染色和定量检测MC3T3-E1细胞的晚期成骨能力,采用RT-PCR检测IL-1β、IL-6、TNF-α、Bax、Bcl-2、IGF-1、ALP、OCN、OSX、Col-1和Runx2的mRNA表达情况。结果高糖环境下,100、10、1μmol/L的DNJ可以促进MC3T3-E1细胞增殖。与高糖组相比,实验组凋亡率、活性氧含量、细胞上清液中AGEs、IL-1β、IL-6和TNF-α含量降低,差异有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR结果表明,与高糖组相比,实验组Bax、IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达降低,Bcl-2、IGF-1、ALP、OCN、OSX、Col-1和Runx2的mRNA表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在高糖环境下,一定浓度范围内DNJ能够抑制MC3T3-E1细胞的凋亡和炎症因子的产生,促进成骨细胞的分化。

桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)的开发现状与前景展望

1-脱氧野尻霉素(DNJ)作为桑资源中特有的物质,具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等生物活性,有较高的利用价值。为进一步促进DNJ的开发和利用,本文对现阶段DNJ的提取方法、生物活性以及应用领域进行整理,分析和展望了DNJ现阶段及未来的研究状况。发现随着DNJ提取工艺的进步,DNJ的提取效率在逐步提升,并且得益于DNJ所具备的降血糖活性、抗病毒活性、抗肿瘤活性与抗氧化和抗炎活性,使其在动物生产、医药、食品领域有着良好的应用前景。相信随着对DNJ研究与开发的深入,能使DNJ得到更充分的应用,从而推动桑资源的多元化利用。

1-脱氧野尻霉素与7-羟基香豆素耦合物诱导HCC-1937细胞凋亡的作用机制

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是蚕桑资源特有的天然活性物质,具有良好的抗肿瘤活性。但由于DNJ脂溶性差、生物利用度低等缺陷,极大地限制了其开发与应用。7-羟基香豆素(7-hydroxycoumarin,UMB)因其独特的苯并芘结构而具有显著的抗肿瘤效果。将DNJ与UMB通过烷烃链耦合成新的DNJ衍生物4、5和6,以改善其抗肿瘤活性。结果显示,化合物6的log P值为1.09±0.24,具有良好的脂溶性;其对HCC-1937细胞的IC 50值为(45.54±3.26)μmol/L,抑制活性较DNJ提高了115倍,显著改善了DNJ抗肿瘤效果。此外,化合物6显著抑制HCC-1937细胞的增殖和迁移,诱导DNA损伤,阻滞细胞周期于S期,并破坏线粒体膜电位,增加细胞内活性氧和Ca 2+含量,引起未折叠蛋白反应导致细胞凋亡,表明化合物6通过线粒体紊乱、氧化应激和内质网应激多途径诱导HCC-1937细胞凋亡。本研究为治疗乳腺癌提供了新的治疗策略。

植物中1⁃脱氧野尻霉素特异性存在的考证

1⁃脱氧野尻霉素(DNJ)是桑树中最具有特征性、标志性的生物碱,具有调节糖脂代谢、抗菌、抗病毒等药理活性,是一种极具开发价值的天然活性产物。目前DNJ检测方法主要为柱前衍生高效液相色谱⁃荧光检测法,该方法能够检测到所有与荧光剂结合生成的络合物,但对被检测的物质无法进行定性,往往造成假阳性。通过对桑科植物和已报道含有DNJ的非桑科植物进行检测分析,利用柱前衍生高效液相色谱⁃荧光检测法与高效液相色谱⁃质谱(HPLC⁃MS)检测法相结合,挖掘并考证含有DNJ的植物种类,为DNJ的开发利用提供更广泛的原料素材。检测发现,除了桑树,其他常见桑科植物菠萝蜜、全叶无花果、小叶榕、裂叶无花果、构树、大叶榕、橡皮树、柳叶榕中均不含有DNJ;非桑科植物也只有风信子中含有DNJ;常规桑品种强桑1号的桑叶DNJ含量是风信子叶片DNJ含量的212倍。结果表明,对于植物中DNJ的检测,应先通过HPLC⁃MS进行定性研究,然后再通过柱前衍生高效液相色谱⁃荧光检测法进行定量检测,以避免出现假阳性。

桑树中的1-脱氧野尻霉素含量变化规律研究

综合桑品种、桑树生长季节、桑树不同药用部位以及桑叶的不同发育阶段等因素探讨桑树(Morus L.)体内1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojimycin,1-DNJ)的积累规律,期望发掘富含1-DNJ的生物资源。利用反相高效液相色谱法测定了18个代表性桑品种的摘芯芽和2个桑品种全年不同季节、不同发育时期的桑叶以及不同季节桑枝皮中1-DNJ的含量,并测定了与桑树亲缘关系相近的构树(Broussonetia papyrifera L.)等7种植物中的1-DNJ含量。在18个供试桑品种的摘芯芽中,1-DNJ含量以秋雨和沙2×伦教109最高,质量分数均达0.328 0%左右,黄鲁的1-DNJ含量最低。农桑14号和陕桑305两个桑品种冬、春季不同发育时期桑叶中的1-DNJ含量以冬芽最高,质量分数分别达到0.345 3%、0.255 7%,在开叶期和叶片成熟期较高,在缓慢生长期较低;不同季节桑叶中1-DNJ的含量均是嫩芽>嫩叶>成熟叶>老叶,其中嫩芽和嫩叶中1-DNJ含量以晚秋最高,成熟叶中以夏季最高,而老叶中的1-DNJ含量以春季最高;桑枝皮中1-DNJ的含量以中秋和晚秋期较高,夏季最低。测定的7种非桑属植物均不含1-DNJ。结果说明桑树是富含1-DNJ的主要植物资源,其中在桑园管理过程可以大量获得的桑树摘芯芽以及桑树伐条剪下的桑枝(桑皮)中均富含1-DNJ,具有重要的开发利用价值。

用反相高效液相色谱-紫外检测法测定1-脱氧野尻霉素的含量

以0.05 mol/L HC l为溶剂提取蚕粉和桑叶粉中的1-脱氧野尻霉素(DNJ),并用9-芴基氯甲酸甲酯(FMOC)为衍化剂,在pH 8.5的硼酸盐缓冲液中进行衍生化反应,生成具有紫外吸收的DNJ-FMOC络合物,再用反相高效液相色谱-紫外检测法对其分离测定。结果表明,反应产物的色谱图分离效果良好,DNJ-FMOC的峰面积与DNJ浓度呈高度正相关关系,加样回收率平均为100.7%。精密度试验、稳定性试验、重现性试验、回收率试验表明,该方法稳定可靠,可以作为测定家蚕、桑叶及有关药物样品中DNJ含量的有效方法。

1-脱氧野尻霉素的来源及合成研究进展

1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是一种有效的α-糖苷酶抑制剂,具有显著的降血糖作用。野尻霉素最先从链霉菌中发现,而天然DNJ最先是从桑根皮中分离到的。在植物中,已从桑树(MorusL.)、鸭跖草(Commelina communis)、风信子(Hyacinthus orientalis)以及沙参属植物(Adenophora triphyllavar.japonica)中分离鉴定到DNJ,其中桑树中的DNJ含量最高,并且因桑品种、药用部位、季节气候、地理土壤、叶位和发育阶段等因素的不同而存在很大差异。在微生物中,已从多种链霉菌和芽孢杆菌中分离到DNJ,还发现从桑树中分离到的嗜麦芽寡养假单胞杆菌(Stenotrophomonas maltophilia)和藤黄微球菌(Micrococcus luteus)2种内生菌也能够产生DNJ,已对多种微生物产DNJ的发酵条件进行研究。在昆虫中,除家蚕(Bombyxmori)富含DNJ外,野桑蚕(Bombyxmandarina)、桑蟥(Rondotia menciana)、桑尺蠖(Phthonandria atrineata)、桑螟(Diaphani apy-loalis)等取食桑叶的单食性或寡食性昆虫也富含DNJ,昆虫体内的DNJ来源于食物,其中家蚕体内DNJ的含量因蚕品种、发育时期、组织器官以及饲料等因素的不同而异,家蚕随龄期进展存在着对DNJ的吸收富集和排泄的周期性变化。目前已经对链霉菌、芽孢杆菌和鸭跖草体内DNJ的生物合成途径进行了探索,发现不同物种体内DNJ的合成机制不同。另已探明了DNJ的3种主要合成方法,人工合成的一些DNJ衍生物已经应用于临床。

桑树资源中1-脱氧野尻霉素的测定及其生物活性分析

目的测定桑树资源中1-脱氧野尻霉素(DN J)并分析其生物活性。方法以氯甲酸芴甲酯(FM OC-C l)柱前衍生RP-HPLC荧光检测法对DN J进行分析;在酶水平测定样品的α-糖苷酶抑制曲线,在离体水平用反转肠囊实验测定样品的α-糖苷酶抑制活性。结果建立了DN J的定量方法,并应用于桑树资源中DN J的定量;这些中药材与DN J对照品呈现了平行的α-糖苷酶抑制曲线,对淀粉水解和葡萄糖吸收具有较好的抑制作用。结论桑树资源可以作为α-糖苷酶抑制剂治疗糖尿病。

桑叶1-脱氧野尻霉素(DNJ)对α-蔗糖酶的抑制动力学研究

从桑叶中提取的1-脱氧野尻霉素(DNJ)作为糖苷酶抑制剂具有降血糖的功能。为了解明桑叶DNJ对α-蔗糖酶的作用机制,应用酶抑制动力学分析桑叶DNJ(纯度>95%)对α-蔗糖酶的抑制特性。通过建立的α-蔗糖酶酶促反应体系表明,在α-蔗糖酶质量浓度≤500μg/mL、反应时间8min以内时,反应体系呈现良好的线性趋势;抑制活性检测表明,桑叶DNJ对α-蔗糖酶具有明显的抑制作用,其半抑制浓度(IC50)为5.67mg/mL;依据酶抑制动力学曲线特征推断桑叶DNJ对α-蔗糖酶具有明显可逆的非竞争性抑制作用,其抑制常数Ki为6.73mg/mL。

桑叶中总生物碱和1-脱氧野尻霉素的含量考察

目的建立桑叶中总生物碱和1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量的测定方法,并考察不同采摘时间、不同种植基地及药用部位的桑叶药材中总生物碱和DNJ含量。方法采用雷氏盐比色法测定总生物碱含量;应用HPLC-ELSD测定DNJ含量。流动相为乙腈-水(80:20);流速:1.0mL.min-1;柱温30℃;进样量:20μL。漂移管温度55℃;载气(N2)压力:0.15MPa。结果本实验所建立的方法准确、重复性好。不同采摘时间、采摘部位的桑叶中二者含量差异较大,不同种植基地的桑叶中二者含量变化相对较小。结论测定结果表明,桑叶中DNJ和总生物碱的含量与采摘时间、种植基地及药用部位等密切相关,其中采摘季节、部位影响较大。

12个桑树品种桑叶中的1-脱氧野尻霉素含量测定与分析

基于开发我国桑树资源的药用保健功能的目的,采用柱前荧光衍生高效液相色谱法对云南省不同种的12个桑树品种桑叶中的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量进行了检测与分析。结果表明:不同桑树品种桑叶中的1-DNJ含量有差异,其中开远蒙桑桑叶中的1-DNJ的质量比为4.070 mg/kg,其含量最高,极显著高于其他品种;水桑、开远鬼桑、河口长穗桑桑叶中的1-DNJ含量较高,显著高于其余品种;其余8个品种之间的差异不显著。

不同全蚕粉中的1-脱氧野尻霉素含量及其对小鼠血糖浓度的影响

为探讨全蚕粉中1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojimycin,1-DNJ)含量与降血糖效果的关系以及蚕体内1-DNJ的来源,测定了7个家蚕品种或杂交组合以及用5个桑品种和不同叶质桑叶饲养5龄蚕制备的全蚕粉中1-DNJ含量,同时测定了由相应的全蚕粉配制的蚕粉复合物对小鼠食后1.5 h血糖值的影响。结果表明,不同家蚕品种以及用不同桑品种和不同叶质桑叶饲养家蚕制备的全蚕粉复合物的降血糖效果均存在显著差异,凡是降血糖效果显著的全蚕粉,1-DNJ含量都处于较高水平,而1-DNJ含量低的全蚕粉其降血糖效果均较差,但降血糖活性与1-DNJ含量之间并不存在显著正相关关系,说明全蚕粉中还存在其它降血糖活性成分。养蚕用桑中的1-DNJ含量与蚕体内1-DNJ含量存在高度正相关性,而且用不含桑叶粉的人工饲料饲养的家蚕幼虫不含1-DNJ,因此证实了蚕体内的1-DNJ来源于桑叶,家蚕本身不能产生1-DNJ。

黄血蚕中1-脱氧野尻霉素的离子色谱法测定

报道了对家蚕的生理活性物质1-脱氧野尻霉素的分析研究。将家蚕幼虫粉碎并经处理后,用离子色谱法分离出4个生物碱组分,其中1-脱氧野尻霉素的含量0.1890%。超声波法提取1-脱野尻霉素的得率比一般水提法高7倍。

反相高效液相色谱法检测不同品种和叶位桑叶中1-脱氧野尻霉素

建立以芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)为衍化剂的柱前衍生化-反相高效液相紫外线检测法测定桑叶中1-脱氧野尻霉素(DNJ)含量的方法,并对不同品种、不同叶位桑叶中DNJ含量进行检测。结果表明:以0.05mol/LHCl为溶剂提取桑叶粉中的DNJ,用芴甲氧酰氯(FMOC-Cl)为衍生化试剂,在pH8.50硼酸盐缓冲液条件下,衍生化和RP-HPLC检测效果最好。反相高效液相色谱-紫外检测法检测DNJ时,流动相中乙腈:0.1%醋酸为55:45(V/V)时色谱分离效果最好,DNJ-FMOC的峰面积与DNJ浓度呈高度正相关关系,相关系数为0.9852。不同品种的桑叶中DNJ含量不同,本研究的15个样品中青阳青桑的DNJ含量最高,达到0.1486%,皮桑含量最低,为0.04291%。不同叶位桑叶的DNJ含量不同,第1叶位至第5叶位桑叶的DNJ含量逐渐降低,说明桑叶随着发育成熟,DNJ的含量逐渐降低。结果显示该方法快捷、稳定、灵敏、准确度高,适合桑叶中DNJ含量的检测。

桑叶1-脱氧野尻霉素(DNJ)对高脂血症小鼠糖脂代谢的影响

为了开发利用桑树来源多羟基哌啶生物碱1-脱氧野尻霉素(DNJ)的生物活性功能,研究桑叶DNJ对高脂饲料诱导高脂血症模型小鼠糖脂代谢的影响及调控作用机制。将自制的桑叶DNJ冻干粉按照50 mg/(kg·d)的剂量灌胃给予高脂血症模型小鼠90 d后,小鼠餐后血糖、总胆固醇(TG)浓度和胰岛素的活力以及胰岛素抵抗指数均极显著降低(P<0.01),肝脏组织中的葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)活力及载脂蛋白(APO-A1、APO-B100)的含量极显著提高(P<0.01);qRT-PCR检测小鼠肝脏组织中糖脂转运代谢关键蛋白APO-A1、APO-B100、脂蛋白脂酶(LPL)、内质网脂酰辅酶A合成酶Acyl-Co A-S、甘油激酶(Gly-K)、3-磷酸甘油脱氢酶(G3PD)等的编码基因转录水平极显著上调(P<0.01);Western blot检测糖异生关键酶丙酮酸羧化酶(PCB)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)蛋白的表达水平下调。对小鼠肝脏组织的病理切片观察发现,高脂血症模型小鼠的肝细胞索排列紊乱,遍布脂滴,给予桑叶DNJ治疗后,小鼠肝脏细胞的脂滴数量明显减少。研究结果提示,桑叶DNJ可通过调节葡萄糖、甘油三酯代谢关键酶蛋白的表达,促进血糖、血脂的转运代谢,从而降低小鼠因高脂饲料诱导造成的肝脏组织损伤。

不同产地桑叶的1-脱氧野尻霉素含量比较

目的:比较不同产地桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量。方法:采用HPLC法,色谱柱:HiQSiLC18(5μm,250 mm×4.6 mm);流动相:乙腈-0.1%醋酸(55∶45,V/V);流速:1.0 ml/min;柱温25℃;荧光检测器激发波长254nm,发射波长322 nm。结果:不同产地桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量有较大差异,且同一产地不同品种相差也较大。结论:本测定结果可为开发利用桑叶资源提供依据。

1-脱氧野尻霉素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用机制

运用紫外光谱法、荧光光谱法和圆二色光谱法,研究桑叶提取物1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)对α-葡萄糖苷酶的作用。结果发现:DNJ与α-葡萄糖苷酶反应的半抑制浓度为0.297μg/mL,作用类型为竞争型抑制;其与α-葡萄糖苷酶主要通过静电吸引力相互作用形成基态复合物,并使α-葡萄糖苷酶的内源荧光猝灭;DNJ与α-葡萄糖苷酶相互作用形成复合物的过程是熵驱动的吸热反应,静电吸引力是两者结合反应的主要驱动力。不同温度(273、298、310 K)条件下荧光猝灭常数(K_(sv))分别为1.48×10~4、1.29×10~4、1.12×10~4 L/mol。DNJ使α-葡萄糖苷酶的构象发生变化,且使其二级结构重新排列;诱导酶活性口袋关闭,不利于底物结合到活性位点,推测这可能是DNJ抑制α-葡萄糖苷酶活性从而降低血糖水平的机理。

柱前衍生化高效液相色谱-荧光检测法测定桑叶中的1-脱氧野尻霉素

采用柱前衍生化高效液相色谱-荧光检测法测定了桑叶中的1-脱氧野尻霉素(DNJ)。用0.05mol/LHCl提取桑叶中的DNJ,采用6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯(AQC)试剂在pH8.5硼酸盐缓冲液下对DNJ进行衍生化,以0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH5.0)-乙腈(体积比为85∶15)为流动相,利用C18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm)分离,在激发波长为250nm、发射波长为395nm条件下进行荧光检测,DNJ的AQC衍生物与衍生化试剂的水解产物分离良好。方法的线性范围为0.5～25mg/L,检出限为0.02mg/L(S/N=3)。实验测得桑叶中DNJ含量为0.12%;回收率为96.1%～98.6%。