高效阴离子交换色谱-脉冲安培法测定蔬菜及食品中的1-蔗果三糖和蔗果四糖

目的应用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器联用（HPAEC-PAD）技术，建立蔬菜、食品中低聚果糖（蔗果三糖和蔗果四糖）检测方法。方法以NaOH和乙酸钠为淋洗液梯度淋洗，在CarboPac PAl色谱柱上阴离子交换分离了蔗果三糖和蔗果四糖，用脉冲安培检测器（金电极）进行了检测。结果二者的线性范围分别为1．22～15．20μg／g和1．64～18．30μg／g，检出限分别为0．085μg／g和0．089μg／g。对浓度为6．08和7．32μg／g的蔗果三糖和蔗果四糖混合标准连续进样，其相对标准偏差（RSD）分别为2.80％和1．28％（n=6）。应用本方法分析了菊苣、朝鲜蓟和通力爽口服液等蔬菜和食品中蔗果三糖和蔗果四糖的含量。蔗果三糖和蔗果四糖含量最高的蔬菜组织为菊苣根，分别为6．61g／100g干重和6．51g／100g干重。低聚果糖粉中蔗果三糖和蔗果四糖含量最高，分别为34．13g／100g和32．12g／100g。样品加标回收率蔗果三糖和蔗果四糖分别为93．97％和97．14％。结论该方法简单、方便、灵敏度高，适于蔬菜及食品中蔗果三糖和蔗果四糖的测定。

大蒜蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征

【目的】研究大蒜(Allium sativum L.)中蔗糖﹕蔗糖1-果糖基转移酶(1-SST)的酶学特征,为大蒜保鲜、加工和品质改良提供依据。【方法】采用饱和度10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的硫酸铵分级沉淀1-SST,以确定其所在的硫酸铵部位。分别取1-SST活力最高的硫酸铵部分与底物蔗糖反应,研究其在不同的温度、p H、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖的能力,即采用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD),测定1-SST反应前后的1-蔗果三糖的含量,进而计算出1-SST活力大小并总结出其在不同的温度、p H、离子强度、底物质量浓度等条件下合成高果聚糖反应的规律;采用的色谱柱为Prevail Carbohydrate ES柱(250 mm×4.6 mm,5μm),色谱柱柱温箱温度为40℃,流动相最大限压20 MP,流动相为乙腈和水,其流速为1.0 m L·min-1,ELSD撞击器关闭状态,漂移管温度90℃,载气流量2.5 L·min-1(空气)。其梯度洗脱方式为:0 min,75%乙腈﹕25%水;15 min,65%乙腈﹕35%水;30 min,50%乙腈﹕50%水;35 min,75%乙腈﹕25%水;40 min,75%乙腈﹕25%水。【结果】在上述测定条件下,果糖、葡萄糖、蔗糖、1-蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖6种糖完全分离,出峰时间仅为20 min,测定方法可靠、灵敏度高,满足了测定1-SST活性的要求。以50%(w/w)蔗糖为底物时,仅产生1-蔗果三糖,无其它高果聚糖的产生,证实了在所试条件下,大蒜中1-SST反应具有专一性。大蒜1-SST主要存在于30%—40%硫酸铵饱和度部分,其中0—30%,40%—70%有轻微活力,未发现70%—100%硫酸铵组分有1-SST的活力。取30%—40%的硫酸铵饱和度部分作为样品研究1-SST酶学特征发现其最适反应温度为35℃,当温度到达40℃以上时,酶的活力下降的很快,说明1-SST具有热不稳定性,因此在研究大蒜1-SST时,要尽量避免高温,以免影响后续研究;其最适反应p H为5.0,与大麦(Hordeum vulgare)、菊苣(Cichorium intybus L.)、菊芋(Helianthus tuberosus Colombia)、黑麦草(Lolium rigidum)、龙舌兰(Agave americana L.)的1-SST最适p H大致相同,显示不同植物1-SST活力中心部位的结构可能基本一致;在蔗糖浓度为100—600 mg·m L-1内,酶活力随着底物质量浓度的增加而提高,而当底物浓度超过500 mg·m L-1时,酶活力增加的幅度减少而趋于平缓,这完全符合米氏方程(Michaelis-menten)的酶动力学性质;对于Na+、Cl-来说,离子强度越低,1-SST活力越强,1-SST在35℃下的米氏常数Km为104mmol·L-1。【结论】大蒜1-SST随温度、p H、离子强度、底物质量浓度等变化,不仅影响大蒜贮藏过程中的果聚糖代谢,也影响大蒜加工产品,尤其是大蒜提取物中糖的种类和含量。

大蒜果聚糖∶果聚糖1-果糖基转移酶的酶学特性

大蒜中主要干物质为多糖,其中主要糖类为果聚糖,具有多种保健作用。本文研究了大蒜中果聚糖∶果聚糖1-果糖基转移酶(Fructan∶fructan 1-fructosyltransferase,1-FFT)的酶学特性,为阐明大蒜在采后贮藏、保鲜及深加工过程中果聚糖含量的变化提供依据。结果表明:当以1-蔗果三糖为底物时,1-FFT仅催化生成蔗果四糖,且无其它结构的四糖生成;大蒜1-FFT主要存在于40%~50%硫酸铵部分;其最适p H为6.0,在p H 5.5~6.5条件下1 h内保持稳定;最适温度为25℃,在15~25℃条件下1 h内可保持稳定;低浓度Mn^(2+)、Mg^(2+)、Fe^(3+)促进1-FFT活力,Cu^(2+)、Zn^(2+)、Ag^+抑制1-FFT活力;1-FFT活力随底物浓度升高而增大,其米氏常数Km=0.6977 mol/L,最大反应速率Vmax=116.23μg/h。大蒜1-FFT活力受p H、温度、不同金属离子及底物浓度影响,调节以上因素有助于调控大蒜果聚糖代谢、保持大蒜品质及延长大蒜贮藏期。

蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的表面展示及酶学性质分析(英文)

【目的】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶催化1分子蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上,形成1-蔗果三糖和葡萄糖。在低聚果糖中,1-蔗果三糖益生素活性最高。本研究将该酶展示在酵母菌细胞表面上,并用于1-蔗果三糖的制备。【方法】将来自莴苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因克隆到用于酵母细胞表面展示的表达载体上,并在解脂亚罗酵母菌中进行异源表达,表达的酶展示在该细胞表面上,然后以蔗糖为底物,研究表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的性质。【结果】免疫荧光实验结果表明蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶已展示在酵母菌的细胞表面上,高效液相色谱结果表明酵母表面展示的该酶具有转移酶的催化活性。该酶的最适作用温度、最适作用p H分别为45°C和7.5;该酶的催化活性受Zn2+和Cu2+的抑制,受Ca2+激活;该酶重复使用7次后,酶活下降50%。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶和3%蔗糖混合后在40°C条件下孵育30 min后,所产1-蔗果三糖含量最高为20.8 mmol/L。【结论】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶在解脂亚罗酵母菌中得到成功表达,并展示在其细胞表面上,生化研究表明该重组蛋白具有果糖基转移酶活性,且催化蔗果三糖的生成。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶作为一种全细胞催化剂能够用于1-蔗果三糖的制备。

不同炮制方法的巴戟天寡糖对骨质疏松模型雄性小鼠氧化应激和股骨组织形态的影响

目的 探讨巴戟天寡糖对环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)诱导骨质疏松雄性小鼠氧化应激指标和股骨组织形态的影响,并探析炮制工艺对巴戟天寡糖成分及效用的影响。方法 对巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖中成分进行提取分离并验证。将雄性昆明小鼠随机分为对照组、模型组、维生素D(5μg/kg)组及巴戟天寡糖低、高剂量(50、200 mg/kg)组和酒巴戟天寡糖低、高剂量(50、200 mg/kg)组。除对照组外,其余小鼠连续15 d ig CTX(4.5 mg/kg)制备骨质疏松模型,造模结束后,给予相应药物干预4周,测定各组小鼠血清中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase,CAT)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;采用Micro-CT对股骨远端骨微结构进行分析;采用三点弯曲法测定骨生物力学参数;制片测量骨组织形态计量学参数。结果 巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖的6种寡糖成分的含量不同,巴戟天寡糖中D-果糖、蔗糖、1-蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖的含量较酒巴戟天寡糖更多,而酒巴戟天寡糖中D(+)-无水葡萄糖的含量更多。与模型组相比,巴戟天寡糖低剂量组小鼠股骨的骨密度显著增加(P<0.01);骨生物力学参数改善(P<0.05、0.01);血清MDA水平降低(P<0.05);松质骨的骨小梁面积比(percentage of trabecular bone area,Tb.Ar)、荧光标记周长比(percentage of fluorescent label perimeter,L.Pm)、骨矿化沉积率(mineral apposition rate,MAR)及骨形成率(bone formation rate to bone volume,BFR/BV)显著升高(P<0.05、0.01),骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)和破骨细胞数目(number of osteoclast,OC.N)显著降低(P<0.01);皮质骨的MAR显著降低(P<0.05),BFR/BV显著升高(P<0.01)。巴戟天寡糖高剂量组小鼠骨密度显著增加(P<0.01);血清中CAT活性显著升高(P<0.01);松质骨组织中Tb.Ar显著升高(P<0.05),Tb.Sp显著降低(P<0.05)。酒巴戟天寡糖低剂量组小鼠骨密度显著增加(P<0.01);骨生物力学参数改善(P<0.05);血清GSH-Px活性升高(P<0.01);松质骨的Tb.Ar、L.Pm、MAR及BFR/BV显著升高(P<0.05、0.01),Tb.Sp和OC.N显著降低(P<0.05、0.01);皮质骨的MAR显著降低(P<0.05),BFR/BV显著升高(P<0.05)。酒巴戟天寡糖高剂量组小鼠血清中CAT活性显著升高(P<0.01),对于骨结构改变则无明显影响作用。结论不同炮制工艺会影响巴戟天寡糖的成分含量。巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖均能不同程度地改善氧化应激指标,但低剂量的巴戟天寡糖及酒巴戟天寡糖对于改善CTX引起的骨质疏松的作用更为显著。