姜酮通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用

目的:探讨姜酮对氧糖剥夺/复糖复氧(OGD/R)后小鼠海马神经元HT22细胞的保护作用,阐明其相关作用机制。方法:培养HT22细胞,设置不同OGD/R时间梯度,建立OGD/R细胞损伤模型。HT22细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+1μmol·L^(-1)姜酮组、OGD/R+10μmol·L^(-1)姜酮、OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组和OGD/R+0.2%二甲亚枫(DMSO)组,CCK-8法检测各组细胞活性并计算各组细胞存活率,确定姜酮最适药物浓度。细胞分为对照组、OGD/R组、OGD/R+姜酮组和OGD/R+姜酮+核因子E2相关因子2(Nrf2)抑制剂(ML385)组,OGD/R+姜酮组细胞经姜酮给药处理4 h后予以OGD 8 h和复糖复氧8 h处理,OGD/R+姜酮+ML385组细胞在姜酮给药前予以10μmol·L^(-1)ML385预处理6 h,CCK-8法检测各组细胞活性,Western blotting法检测各组细胞中Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达水平,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组细胞培养上清中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平。结果:与对照组比较,HT22细胞经OGD 8 h和复糖复糖8 h处理后细胞存活率低于50%,以OGD 8 h和复糖复糖8 h建立HT22细胞OGD/R模型。与OGD/R组比较,OGD/R+不同剂量姜酮组细胞存活率均不同程度升高,其中OGD/R+100μmol·L^(-1)姜酮组细胞存活率升高最明显(P<0.01),故选用100μmol·L^(-1)姜酮用于后续实验。与对照组比较,OGD/R组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.01);与OGD/R组比较,OGD/R+姜酮组细胞活性明显升高(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P<0.05或P<0.01),Bax蛋白表达水平明显降低(P<0.05),细胞培养上清中SOD活性明显升高(P<0.01),MDA水平明显降低(P<0.01);与OGD/R+姜酮组比较,OGD/R+姜酮+ML385组细胞活性明显降低(P<0.01),细胞中Nrf2、HO-1和Bcl-2蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.01),细胞培养上清中SOD活性明显降低(P<0.01),MDA水平明显升高(P<0.05)。结论:姜酮可通过激活Nrf2/HO-1信号通路减轻OGD/R后氧化应激损伤对HT22细胞凋亡的抑制作用。

慢性失眠障碍患者血清NSE、IL⁃1β及5⁃HT水平变化及与认知功能和睡眠的关系

目的探究慢性失眠障碍患者血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)、白细胞介素⁃1β(IL⁃1β)及5⁃羟色胺(5⁃HT)水平变化及与认知功能和睡眠的关系。方法分析2021年8月至2023年8月期间在中国人民解放军海军青岛特勤疗养中心就诊的90例慢性失眠障碍患者临床资料,根据其入院时睡眠质量情况分为严重组(n=39)、中度组(n=30)和轻度组(n=21),比较三组患者入院时血清NSE、IL⁃1β、5⁃HT水平。按慢性失眠障碍患者入院时的认知功能[蒙特利尔认知评估量表(MoCA)]分为失眠合并认知功能障碍组(n=41)和单纯失眠组(n=49),比较两亚组患者入院时血清NSE、IL⁃1β、5⁃HT水平和MoCA评分的关系,经Pearson相关系数分析慢性失眠障碍患者入院时血清NSE、IL⁃1β、5⁃HT水平与MoCA评分的相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析入院时血清NSE、IL⁃1β、5⁃HT水平对失眠合并认知功能障碍患者的诊断效能。结果严重组的NSE、IL⁃1β>中度组>轻度组,差异有统计学意义(F=76.815,34.153;P<0.05);严重组的5⁃HT<中度组<轻度组,差异有统计学意义(F=130.092;P<0.05)。失眠合并认知功能障碍组的NSE、IL⁃1β显著高于单纯失眠组,差异有统计学意义(t=9.397,5.274;P<0.05);失眠合并认知功能障碍组的5⁃HT显著低于单纯失眠组,差异有统计学意义(t=9.703;P<0.05)。Pearson相关系数分析显示,失眠合并认知功能障碍组入院时血清NSE、IL⁃1β水平和MoCA评分呈显著负相关(P<0.05);5⁃HT水平和MoCA评分呈显著正相关(P<0.05)。ROC分析,血清NSE、IL⁃1β、5⁃HT水平三者联合检测ACU值0.966,优于单一检测(P<0.05)。结论慢性失眠障碍患者的认知功能和睡眠与NSE、IL⁃1β的升高及5⁃HT的降低有关。

Rho A蛋白通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制

目的:探讨Rho A蛋白通路在DLC-1(frequently deleted in liver cancer-1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制。方法:构建pcDNA3.1-DLC1质粒载体,脂质体法转染HT29细胞,筛选稳定细胞系;pull-down方法分析Rho A蛋白活性;实时定量PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、p21的表达变化;流式细胞仪检测细胞周期分布。结果:野生型人结肠癌HT29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系。与野生型及空载组HT29细胞相比,转染组细胞RhoA蛋白活性下降;Cyclin D1表达下调,p21表达上调;G1期及凋亡细胞数增加,而G2期细胞数下降。结论:转染DLC-1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下调,进而可能通过对Cyclin D1、p21表达的调控使细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,同时分裂前期细胞数减少,细胞增殖受抑。

新型酪氨酸激酶抑制剂BSSD-1对斑马鱼血管生成及大肠癌HT29裸鼠肿瘤的抑制作用

目的探讨化合物BSSD-1对斑马鱼新生血管的影响以及对大肠癌HT29裸鼠肿瘤的抑制作用。方法采用24hpf(hours post fertilization)健康TG(VEGFR2:GFP)系血管荧光转基因斑马鱼作为实验动物模型,加入不同剂量BSSD-1与胚胎共同孵育24 h,在荧光显微镜下观察背部节间血管(intersegmental vessels,ISV)生成情况,并计数评价抑制程度;进而建立人大肠癌HT29细胞裸小鼠模型,观察BSSD-1不同剂量作用下对裸鼠肿瘤的抑制作用,根据瘤体积及瘤重,计算相对肿瘤增殖率和肿瘤生长抑制率。结果化合物BSSD-1在0.25～25.0 mg·L-1范围抑制斑马鱼背部节间血管生成具有剂量相关性,12.5 mg·L-1抑制率可达98.8%;裸鼠肿瘤抑制试验中,大、中、小剂量组肿瘤生长抑制率试验结果分别为31.1%、40.0%和40.0%,统计学处理3组差异均有显著性。结论 BSSD-1可以抑制荷瘤裸鼠移植瘤的生长,该作用与抑制肿瘤新生血管生成有关。

HTS-1钛硅分子筛催化环己酮氨肟化工业试验

通过工业试验,考察了钛硅分子筛HTS-1新剂和再生剂在环己酮氨肟化制备环己酮肟工艺中的工业试验性能,工业运行结果显示:环己酮转化率>99.6%,环己酮肟选择性>99.5%,催化剂单程寿命大于600h。同时介绍了亚微米级HTS-1催化过程中的分离和粘壁问题及其工程解决措施,应用陶瓷膜微滤技术解决了催化剂和反应液的分离和循环使用问题,应用波纹管技术克服了催化剂粘壁现象,达到正常换热的效果,并通过优化使系统满足生产要求。

丙戊酸对HL-60/HT细胞P27^(Kip1)、P170表达水平及耐药性的影响

目的观察丙戊酸对白血病细胞P27Kip1、P170表达水平和耐药性的影响,探讨其可能的作用机制。方法递增压力选择培养法建立白血病耐药细胞株HL-60/HT,MTT法检测丙戊酸作用前后细胞的增殖情况及对Ara-C耐药性的改变,流式细胞术测定HL-60细胞、HL-60/HT细胞中P27Kip1、P170的表达和细胞周期。结果成功诱导培养建立耐药HL-60/HT细胞,其对HT、VCR、DNR、Ara-C的耐药倍数分别为9.30、5.20、4.91、3.65倍,耐药性能稳定。HL-60/HT细胞P27Kip1表达水平明显低于正常人单个核细胞及HL-60细胞(P<0.05),P170表达水平则明显高于正常人单个核细胞及HL-60细胞(P<0.05)。丙戊酸+Ara-C联合用药对HL-60、HL-60/HT细胞的生长抑制率明显高于单独用药的丙戊酸组和Ara-C组,q值分别为1.37和1.51,说明合用具有协同作用。丙戊酸作用于HL-60、HL-60/HT细胞后,细胞中P27Kip1表达水平、G1期细胞比加药前增加(P<0.05);P170表达水平在加药前后无明显变化(P>0.05)。结论耐药白血病HL-60/HT细胞中P27Kip1的表达低于敏感细胞HL-60,丙戊酸能抑制HL-60/HT细胞增殖,并降低其对Ara-C的耐药性。作用机制可能与改变P27Kip1的表达、增加G1期细胞含量有关,与P170作用无关。

人参皂苷Rg_1对H_2O_2诱导的HT22细胞凋亡及胞内Ca^(2+)变化的影响

目的研究人参皂苷Rg_1对H_2O_2诱导的HT22细胞凋亡及胞内Ca^(2+)浓度变化的影响。方法以0、6.25、12.5、25、50、100μg/L人参皂苷Rg_1预处理细胞24 h,采用Ca^(2+)荧光染料探针Fluo-3/AM负载细胞1 h后,50 mmol/L H_2O_2刺激细胞,多功能酶标仪测定荧光强度,激光共聚焦显微镜实时监测[Ca^(2+)]i变化,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡。结果 H_2O_2可诱导细胞内Ca^(2+)浓度增加(P<0.01),并增加细胞凋亡率(P<0.01)。不同浓度人参皂苷Rg_1可呈剂量依赖性的抑制H_2O_2诱导的HT22[Ca^(2+)]i增加(P<0.01),抑制细胞凋亡(P<0.01),以50μg/L的作用为最强(P<0.01)。结论人参皂苷Rg_1可通过降低H_2O_2诱导的HT22细胞内Ca^(2+)水平的升高,抑制氧化应激引起的细胞凋亡。

Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ_(31-35)诱导的HT22海马神经细胞per1基因异常表达

目的:探讨Exendin-4对Aβ_(31-35)所致的HT22神经细胞per1基因异常表达的影响及可能作用机制。方法:本研究采用海马神经细胞HT22作为实验对象。以1%血清饥饿1 h来诱导细胞同步化(CT0)。MTT实验检测细胞存活率;倒置显微镜下观察细胞形态变化;Real-time PCR检测各CT时间per1基因的表达变化;选择per1表达差异最显著的CT时间点,采用流式细胞术检测细胞内钙离子浓度的变化情况。结果:(1)Exendin-4可以明显提高Aβ_(31-35)所致的HT22细胞存活率的下降;(2)镜下观察可见,经Exendin-4预处理后部分改善了Aβ_(31-35)对细胞的损伤作用,细胞形态有所恢复;(3)Aβ_(31-35)使per1基因在CT16时各处理组的相对表达量明显不同;与对照组相比,Aβ_(31-35)使per1基因表达量明显升高;经Exendin-4预处理后,per1基因的表达得到一定程度的恢复,差异具有统计学意义;(4)在CT16时各处理组细胞荧光强度值明显不同,与对照组相比,Aβ_(31-35)使细胞荧光强度明显增强;经Exendin-4预处理后,细胞荧光强度值明显降低,差异具有统计学意义,此结果与加入尼莫地平的结果类似。加入尼莫地平预处理后,检测各个CT时间per1基因表达变化,与Exendin-4预处理组得到的结果类似。结论:Exendin-4通过拮抗钙超载改善Aβ_(31-35)诱导的HT22海马神经细胞per1基因的异常表达。

RhoGAP结构域在DLC-1基因抑制人结肠癌HT29细胞增殖、侵袭中的作用

目的:探讨Rho蛋白GTP酶活化蛋白(Rho GTPase activation protein,RhoGAP)结构域在肝癌缺失基因1(frequentlydeleted in liver,DLC-1)抑制人结肠癌HT29细胞的增殖、侵袭中的作用。方法:脂质体转染DLC-1基因及RhoGAP结构域缺失的ΔDLC-1亚克隆至大肠癌HT29细胞株;应用MTT、平板克隆实验检测细胞增殖的改变;Transwell实验观察细胞侵袭迁移能力的改变;流式细胞术检测细胞周期。结果:转染成功后,全长DLC-1基因转染组(pcDNA3.1-DLC1-HT29)与野生型及空载组相比,细胞增殖能力下降,侵袭能力减弱,细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,而ΔDLC-1亚克隆转染组(pcDNA3.1-ΔDLC1-HT29)对细胞增殖、侵袭及细胞周期均无明显影响。结论:DLC-1基因可能是通过其内在的RhoGAP结构域抑制人结肠癌细胞HT29的增殖和侵袭。

RNA干扰高迁移率族蛋白1对Aβ25-35刺激HT22细胞中晚期糖基化终末产物受体/Toll样受体4信号通路相关蛋白表达的影响

目的研究RNA干扰高迁移率族蛋白1(HMGB1)对β淀粉样蛋白片段25-35(Aβ25-35)刺激HT22细胞HMGB1、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、Tol样受体4(TLR4)、NF-κB、白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)等蛋白表达的影响。方法 Aβ25-350,2.5,5,10,20和40μmol·L-1作用HT22细胞24 h后,MTT法检测细胞存活,计算半数抑制浓度(IC50)。将对数生长期的HT22细胞分为5组:正常细胞对照组、Aβ25-3540μmol·L-1组、小干扰RNA(siRNA)50μmol·L-1组、siRNA或scramble siRNA+Aβ25-35组(HT22细胞转染si RNA或scramble si RNA 50μmol·L-1作用24 h后,再加入终浓度为40μmol·L-1人工合成的Aβ25-35处理24 h),显微镜观察细胞形态变化,免疫荧光检测HMGB1在细胞中位置的改变,Western印迹法检测细胞内HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达,ELISA法检测细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平。结果Aβ25-35作用HT22细胞24 h,IC50为41.17μmol·L-1。后续采用Aβ25-3540μmol·L-1进行实验。Aβ25-3540μmol·L-1作用24 h后,细胞大量死亡,聚集成团,突起减少,细胞间隙增大,且HMGB1从核内转移至核外。细胞内的HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65表达均显著升高(P<0.05),细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平显著升高(P<0.05);经siRNA 50μmol·L-1处理24 h,可显著降低细胞内HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达(P<0.05)及细胞上清液中IL-1β和TNF-α的水平(P<0.05)。结论 RNA干扰HMGB1可减少Aβ25-35刺激HT22细胞HMGB1,RAGE,TLR4和NF-κB P65的表达。

HTS-1分子筛表面酸催化的探针反应研究

以1,2-环氧环己烷水解为主要探针反应研究了钛硅分子筛HTS-1的表面酸催化性能.结果表明,HTS-1表面酸中心具有较高的催化活性,它的扩散性能和溶剂极性对反应活性的影响很大.还采用吸附吡啶的红外光谱和紫外光谱对HTS-1催化剂表面酸性进行了定性和定量分析.这些结果不仅拓展了HTS-1在精细有机合成中的应用,而且为有效提高HTS-1的催化氧化性能提供了依据.

Exendin-4改善Aβ31-35所致小鼠海马HT22神经细胞Per2节律基因/蛋白异常表达

目的探讨Exendin-4对β淀粉样蛋白31-35(Aβ31-35)所致HT22细胞Per2节律基因/蛋白表达的影响及机制。方法 HT22细胞分为Aβ31-35处理组(0,2.5,5.0,10.0μmol/L),Exendin-4单独处理组,Exendin-4预处理组,Exendin-4+Exendin(9-39)预处理组,Exendin-4+Exendin(9-39)处理组,Exendin(9-39)单独处理组,以完全培养基培养的细胞为对照组。光镜下观察HT22细胞形态,MTT法检测细胞存活率,实时荧光定量PCR检测Per2基因的表达,免疫荧光染色观察GLP-1R及PER2蛋白表达。结果 5,10μmol/L Aβ31-35处理后,细胞存活率较对照组显著降低(P<0.05)。Exendin-4预处理后,5μmol/L Aβ31-35引起的细胞形态结构的改变明显改善,细胞存活率显著提高(P<0.05)。Exendin-4预处理后,Per2基因/蛋白表达在CT(circadian time)16时较Aβ31-35处理显著提高(P<0.05);Exendin-4+Exendin(9-39)处理后,GLP-1R表达在CT16时较Exendin-4处理显著降低(P<0.05)。Exendin-4+Exendin(9-39)预处理后,CT16时PER2蛋白荧光强度较Exendin-4预处理显著降低(P<0.05)。结论Exendin-4可能通过上调GLP-1R,改善Aβ31-35所致HT22细胞Per2节律基因/蛋白异常表达。

人参皂苷Rg3对HT-29细胞株MMP-1表达和迁移能力的影响

目的:研究人参皂苷Rg3对结肠癌细胞株HT-29基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达和细胞迁移能力的影响。方法:体外培养HT-29细胞,分为人参皂苷Rg3高剂量组(100μg/mL)、中剂量组(50μg/mL)、低剂量组(25μg/mL)和空白对照组,培养HT-29细胞24、48、72h,RT-PCR法测MMP-1 mRNA表达。利用划痕实验观察Rg3对HT-29细胞迁移能力的影响。结果:24h高剂量组与对照组相比,有显著的统计学差异(P<0.01);48h低、中、高剂量组与对照组相比均有显著的统计学差异(P<0.05、P<0.01、P<0.01);72h低、中、高剂量组与对照组相比均有显著的统计学差异(P<0.01、P<0.01、P<0.01)。划痕实验中空白对照组过河时间为(47.33±2.49)h,低、中、高剂量组过河时间分别为(55.33±2.49)h(P<0.01)、(64.00±1.63)h(P<0.01)和(73.33±1.89)h(P<0.01)。结论:人参皂苷Rg3能抑制HT-29细胞MMP-1的表达和抑制HT-29细胞的迁移能力,并且随着药物浓度的增加及时间的延长,抑制作用增强。

分化抑制因子1对结肠癌HT-29细胞增殖的影响

目的检测分化抑制因子1(Id1)对结肠癌HT-29细胞VEGF表达的影响,探讨其在结肠癌增殖中的作用。方法 HT-29转染Id1表达质粒,RT-PCR方法和Western印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白的表达,MTT法检测各组细胞增殖情况;合成Id-1干扰序列转染HT-29细胞后,RT-PCR及Western印迹检测HT-29细胞VEGF mRNA和蛋白的表达情况,采用MTT法检测各组细胞增殖情况。结果 Id1表达质粒空白组、对照组(空载体组)、过表达组VEGF/GAPDH mRNA分别为:0.002 99±0.000 687、0.003 49±0.001 34、0.031 3±0.006 05(P<0.01);VEGF/GAPDH蛋白分别为:0.132±0.035 1、0.131±0.053 0、0.245±0.032 6(P<0.01),MTT实验显示相对对照组,过表达组增殖明显快(P<0.01)。Id-1干扰空白组、对照组(空载体组)、抑表达组VEGF/GAPDH mRNA分别为:0.006 16±0.000 829、0.006 26±0.000 447、0.002 3±0.000 308(P<0.01);VEGF/GAPDH蛋白分别为:0.450±0.039 3、0.464±0.023 1、0.231±0.027 3(P<0.01)。MTT实验显示相对对照组,抑表达组增殖明显减慢(P<0.01)。Id1过表达能显著上调VEGF mRNA和蛋白表达,提高细胞的生长,Id1抑制后能显著下调VEGF mRNA和蛋白表达,减缓细胞的生长。结论在结肠癌HT-29细胞中Id1为VEGF的上游基因,Id1通过Id1↑→VEGF↑途径来影响结肠癌细胞增殖,在肿瘤血管生成中发挥重要作用。Id1有望成为结肠癌治疗的一个新靶点。

RNA干扰MMP-9表达对人纤维肉瘤细胞系HT1080侵袭转移的影响

目的:探讨MMP-9高表达对人纤维肉瘤细胞HT1080侵袭和转移能力的影响,及对相关机制进行初步研究。方法:将能与MMP-9结合的双链RNA转染到HT1080细胞中。结果:人纤维肉瘤细胞HT1080细胞系中的MMP-9表达减少,可导致细胞迁移抑制、增加细胞粘附和减少肿瘤细胞迁移此外,MMP-9敲除后会造成可溶性细胞间粘附分子-1(ICAM-1)的水平下降,从而导致粘附缺陷与肿瘤转移。结论:MMP-9在人纤维肉瘤细胞HT1080中具有关键作用,通过改变ICAM-1从膜结合形式变为可溶性形式。

沉默MDR1基因表达逆转白血病耐药HT9细胞对大蒜素的耐药性

目的:利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体沉默耐药细胞HT9中MDR1基因表达,从而逆转人早幼粒白血病细胞株HT9对大蒜素的耐药性。方法:根据MDR1基因序列设计shRNA片段,构建靶向MDR1基因的pSilencer3.1-shMDR1表达载体,稳定转染HT9细胞,real-time PCR检测细胞中MDR1 mRNA的表达,Western blotting检测HT9细胞中P-糖蛋白(MDR1基因编码)的表达,MTT法检测细胞存活率,琼脂糖凝胶电泳检测经大蒜素处理后HT9细胞的凋亡,电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞术检测细胞周期。结果:成功构建靶向MDR1的表达载体pSilencer3.1-shMDR1,稳定转染HT9细胞形成HT9-shMDR1细胞系,HT9-shMDR1细胞中MDR1 mRNA表达显著降低[(0.027±0.002)vs(0.110±0.005),P<0.01],P-糖蛋白表达也明显降低[(0.856±0.014)vs(1.454±0.027),P<0.05]。大蒜素对HT9-shMDR1细胞的IC50较对未转染组HT9细胞明显降低[(26.66±0.59)vs(52.75±0.64)μg/ml,P<0.01],HT9-shMDR1细胞对大蒜素耐药的相对逆转率为(49.45±1.86)%。与未转染组HT9细胞相比,经大蒜素处理后HT9-shMDR1细胞凋亡的DNA片段更为明显,电镜下可见细胞凋亡特有的半月体形成。大蒜素处理不影响未转染组HT9细胞和对照质粒转染后HT9细胞(HT9-neo细胞)的细胞周期,但大蒜素处理使HT9-shMDR1细胞的S期细胞比例减少[(31.40±2.13)%vs(53.80±1.87)%,P<0.01],G2/M期细胞比例增多[(35.62±2.06)%vs(9.37±2.09)%,P<0.01]。结论:靶向MDR1的干扰表达载体pSilenc-er3.1-shMDR1能够抑制MDR1基因的表达,从而逆转HT9细胞对大蒜素的耐药性。

玉米大斑病Ht1A基因回交转育和生产利用研究

以Ht1A为抗源,不同大斑病(Helminthosporium turcicum pass.)抗性玉米自交系为轮回亲本,用回交方法转育成Ht1近等位基因同型系,以中感自交系配制成不同基因型的杂交组合,并从病斑数、病斑面积和产孢量三个方面研究单基因抗性在生产上的利用可能性。结果表明,中感自交系转入Ht1A基因后,其杂交组合的病斑数目并未减少,而病斑面积及其单位面积产孢量均表现显著减少,证实Ht1A单基因抗性对控制病菌孢量和延缓大斑病害流行有一定实用价值。

质粒介导的RNAi沉默mdr1基因增强白血病耐药细胞HT9对姜黄素的敏感性

通过pSilencer 2.1质粒介导的RNAi技术沉默急性早幼粒白血病耐药HT9细胞的耐药基因mdr1表达,可提高耐药细胞对姜黄素的敏感性。通过设计合成靶向mdr1基因的shRNA干扰片段,定向克隆到pSilencer 2.1-U6neo质粒中,成功构建沉默mdr1基因特异表达的shRNA表达载体,电转染HT9细胞后筛选阳性克隆扩大培养。采用实时荧光定量PCR、Western blot检测细胞mdr1基因表达情况,流式细胞术检测P-糖蛋白外排泵功能,MTT法和流式细胞技术检测细胞对药物敏感性和细胞周期分布。结果显示,构建的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1转染HT9细胞后,HT9/pU6/shRNA细胞mdr1 mRNA表达降低了78.84%(P<0.01),P-糖蛋白的表达量降低了48.27%(P<0.05),细胞内Rho123相对荧光强度由10.8%±0.58%升高至73.56%±1.37%;转染细胞对姜黄素敏感性明显增强,IC50由(24.10±0.83)μmol/L降至(5.10±0.14)μmol/L;耐药相对逆转率为84.74%±1.86%,与HT9细胞相比,经姜黄素处理的稳定转染细胞HT9/pU6/shRNA细胞周期阻滞在S、G2/M期。说明质粒介导的shRNA表达载体pU6/shRNA/mdr1能够稳定、持久地抑制mdr1基因表达,能有效增强HT9细胞对姜黄素的敏感性。

基于Nrf2/HO-1信号通路的夜关门提取物对谷氨酸诱导小鼠海马细胞HT22损伤的保护作用及机制研究

目的:基于核因子2(Nrf2)/血红素加氧酶1(HO-1)信号通路研究夜关门提取物对谷氨酸诱导小鼠海马细胞HT22损伤的保护作用及机制。方法:采用谷氨酸(5 mmol/L)建立HT22细胞损伤模型后,以水溶性维生素E为阳性对照(50μmol/L),采用MTT法检测0(空白对照)、25、50、100μg/mL夜关门的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯提取物预处理12 h后对谷氨酸诱导损伤细胞增殖的影响。以水溶性维生素E为阳性对照(50μmol/L),采用2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐探针(DCFH-DA)法检测0(空白对照)、25、50、100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物预处理12 h后对谷氨酸诱导损伤细胞中活性氧(ROS)水平的影响;以HO-1激动剂钴-原卟啉为阳性对照,采用Western blotting法检测0(空白对照)、25、50、100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物处理24 h后对细胞中HO-1蛋白表达的影响;分别采用Western blotting法(药物分别处理0.5、1、1.5 h)和免疫荧光染色法(药物处理1 h)检测100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物处理后对细胞核内外Nrf2蛋白表达的影响。采用小干扰RNA(si-RNA)转染技术进行HO-1基因沉默后,考察100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物对谷氨酸诱导损伤细胞的存活率以及细胞中ROS水平的影响。结果:与空白对照比较,50、100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物均可显著升高细胞的存活率(P<0.05),并降低细胞中ROS水平(P<0.05);25、50、100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物均可显著升高细胞中HO-1蛋白表达水平(P<0.05),100μg/mL夜关门二氯甲烷提取物可显著降低细胞质中Nrf2蛋白水平并升高细胞核中Nrf2蛋白水平(P<0.05)。HO-1基因沉默后,夜关门二氯甲烷提取物对谷氨酸诱导损伤细胞的促增殖以及降低ROS水平的作用被逆转(P<0.05)。结论:夜关门二氯甲烷提取物可通过激活Nrf2信号通路,诱导HO-1蛋白的表达,从而发挥对谷氨酸诱导损伤HT22细胞的保护作用。

pcDNA3.1/DLC-1重组质粒的构建及其在HT-29细胞中的表达

目的构建和表达DLC-1(deleted in liver cancer)基因重组质粒。方法用PCR法得到DLC-1基因片段,此基因片段带有XbaⅠ和BamHⅠ两个酶切位点,然后将此片段和真核表达载体pcDNA3.1连接,转化大肠杆菌DH5a,利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质粒转染到结肠癌HT-29细胞中,再用RT-PCR法检测重组质粒的表达。结果重组质粒经XbaⅠ和BamHⅠ双酶切和测序与DLC-1基因序列一致;利用脂质体介导将pcDNA3.1/DLC-1重组质粒导入HT-29细胞,获得了DLC-1基因的表达。结论成功构建pcDNA3.1/DLC-1重组质粒并在HT-29细胞内表达。