干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及对膀胱癌细胞体外增殖影响

目的:初步研究干细胞相关基因Sox2在膀胱癌的表达及其对膀胱癌细胞体外增殖能力的影响。方法:利用免疫组织化学和免疫荧光法检测Sox2在膀胱癌组织及膀胱癌细胞株T24的表达;将构建成功的pcDNA3.1-SOX2-EGFP质粒转染膀胱癌细胞,采用半定量RT-PCR和Western blot检测Sox2的表达,进一步通过MTT实验初步探讨Sox2对膀胱癌细胞T24体外增殖能力的影响。结果:膀胱癌Sox2高表达率为68.6%;构建的pcDNA3.1-SOX2-EGFP转染膀胱癌细胞T24后能够成功表达;MTT实验显示,Sox2可促进膀胱癌细胞株T24体外增殖(P<0.05)。结论:Sox2在膀胱癌组织及细胞均可检测到表达,并能促进膀胱癌细胞株T24的体外增殖。

HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因真核重组载体的构建和鉴定

目的：构建并鉴定包含人乙型肝炎病毒（HBV）HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因的真核重组载体。方法：采用PCR法扩增HBcAg基因，并通过基因突变在79～80位氨基酸处生成一个NheⅠ酶切位点，然后将这段基因连接到真核表达载体pIRES2-EGFP启动子下游的EcoRⅠ和BamHⅠ之间。同时PCR扩增PreS1第1～65氨基酸基因，并在其两端分别引入NheⅠ酶切位点，通过酶切、连接，将这段基因插入到HBcAg基因的NheⅠ酶切位点上。将构建的重组载体pIREScS1转化大肠杆菌DH5α，分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒。结果：酶切鉴定示，插入片段大小均与预计相符。测序结果与已知序列结果一致。结论：成功构建了HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因的真核重组载体。

HepG2细胞电转染条件的优化

目的优化HepG2细胞电转染条件,进一步提高HepG2细胞的转染效率。方法采用电穿孔方法将pcDNA3.1-EGFP导入HepG2细胞中,在500μL电转染体系中,在不同电场强度、细胞数目、脉冲频率、脉冲时间、电转质粒数目、电转缓冲液、培养基血清浓度条件下,分别将pcDNA3.1-EGFP质粒电转染HepG2细胞,检测不同条件下细胞存活率和转染率。结果电转前4℃孵育电转体系混合液10 min,方波电转条件在1个电脉冲、电压270V、细胞数为2×106个、质粒20μg、脉冲时间20 ms、电转缓冲液为优化缓冲液、电转后置于37℃、含15%FBS的DMEM高糖培养基中培养48 h,可获得高转染率(60.68±1.87)%。结论优化电穿孔法的电转染条件能够有效提高HepG2细胞的电转染效率。本研究为外源基因电转染HepG2细胞提供了可靠的试验参数。

脂质体法与电穿孔法转染两种细胞效率的比较

目的对比脂质体与电穿孔法对HepG2、SGC7901/ADM两种细胞的转染效率。方法以HepG2、SGC7901/ADM细胞为研究对象,采用脂质体法和电穿孔法分别转染pcDNA3.1-EGFP质粒,流式细胞仪计算细胞存活率,借助绿色荧光标志蛋白eGFP测算转染效率。结果利用脂质体转染eGFP质粒至HepG2细胞所获得的阳性转染率为(20.8±2.1)%,而电穿孔法转染效率增高至(49.6±2.5)%,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。利用脂质体转染eGFP质粒至SGC7901/ADM细胞所获得的阳性转染率为(25.4±1.3)%,而电穿孔法转染效率增高至(52.6±2.1)%,二者比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。结论使用电穿孔法能明显提高大片段载体的转染效率。