ENO1蛋白及其相关活性位点缺失突变蛋白在昆虫杆状病毒表达系统中的表达与鉴定

目的:利用昆虫杆状病毒表达系统(昆虫BEVS)表达糖酵解酶α-烯醇化酶(ENO1)及其3种酶活性位点缺失突变的ENO1蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,为后续宫颈癌的代谢治疗研究奠定基础。方法:利用分子克隆技术将优化后ENO1序列插入pFastBacTM1载体,获得含有目的基因的重组质粒pFastBac-ENO1。分别缺失ENO1发挥糖酵解酶功能的3个活性位点,进行优化后将其插入pFastBacTM1载体,获得3个活性位点缺失的重组质粒pFastBac-M1、pFastBac-M2和pFastBac-M3。通过转座、转染后获得重组杆状病毒rBV-ENO1、rBV-M1、rBV-M2和rBV-M3,利用WB法对目的蛋白的表达及特异性进行检测。结果:成功扩增重组杆粒rBacmid-ENO1、rBacmid-M1、rBacmid-M2和rBacmid-M3,获得大小约2000 bp的基因片段,与预期大小相符。昆虫BEVS可表达ENO1蛋白及其3个酶活位点缺失的重组蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,其分子量约为52000,与预期相符。WB法鉴定这些蛋白能与特异性标签His-tag发生反应。结论:通过昆虫BEVS成功表达目的蛋白ENO1及其酶活性位点缺失蛋白ENO1-M1、ENO1-M2和ENO1-M3,这些蛋白具有反应原性,为后续测定这些蛋白与ENO1单抗亲和力创造了条件。

2015–2022年漓江流域12天时间分辨率地表水体面积数据集

喀斯特地貌在广西地区分布广泛,具有汛期降水强度大、水文过程迅速且时空异质性高等特点。水是重要的生态基础和自然资源,及时、准确地获取地表水体的时空变化特征,对于水资源的保护与管理、旱涝灾害的快速评估以及实现各个经济产业的可持续发展等具有现实意义。本数据集以广西桂林漓江流域为研究区域,针对当前地表水体监测频次低、水体提取方法受限于样本信息以及在复杂地形区域内提取精度较低等问题,结合Sentinel-1雷达和Sentinel-2光学等多源遥感数据,基于雷达和光学传感器成像原理的不同,提出了一种基于经验阈值进行矢量分类的方法,剔除了绝大部分地物阴影的干扰,构建了2015–2022年漓江流域时间分辨率为12天、空间分辨率为10米的地表水体面积数据集,共包括196期地表水体矢量数据。通过对数据集的空间分布和定量精度验证,结果表明:本数据集对河流、湖泊和水库的入、出水口以及复杂地形区域内小型水体等的提取精度较高,总体精度达到92.73%,Kappa系数为0.85。本数据集可用于支撑漓江流域水资源保护和生态环境的可持续管理,能够为应急管理、灾害防治、水利开发和经济发展等领域的决策提供可靠数据。

大鼠VDAC1腺病毒过表达载体构建及功能鉴定

目的构建电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)腺病毒过表达载体,并观察其在H9C2细胞中的表达情况,为探究VDAC1在心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用机制奠定基础。方法构建ADV6-NC腺病毒及ADV6-VDAC1腺病毒,取第6代H9c2心肌样细胞用于转染。转染细胞分为3组:空白对照组、阴性对照组(转染ADV6-NC腺病毒)和实验组(转染ADV6-VDAC1腺病毒)。通过qPCR和蛋白免疫印迹实验检测各组细胞VDAC1的表达情况。结果成功构建ADV6-NC及ADV6-VDAC1,实验组的VDAC1表达量明显高于空白对照组和阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论利用腺病毒载体可使H9c2细胞在体外持续高效表达VDAC1。

水牛SFRP 1基因序列分析、真核表达载体构建及组织表达分析

【目的】获取水牛分泌型卷曲相关蛋白1(SFRP1)基因CDS区序列,并预测其编码蛋白的结构功能,构建SFRP 1基因真核表达载体,检测SFRP 1基因在水牛不同组织中的表达情况,为探索SFRP 1基因在水牛生长发育中的作用奠定基础。【方法】以水牛卵巢组织cDNA为模板,通过RT-PCR对SFRP 1基因CDS区序列进行扩增并测序,利用生物信息学在线分析软件对水牛SFRP 1基因与不同物种进行比对和系统进化树构建,并预测SFRP1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构等。将获得的目的基因连接至pCMV-HAhyPBase-mcheery载体并转染至水牛颗粒细胞,检测转染后荧光和基因表达情况。通过实时荧光定量PCR检测水牛不同组织中SFRP 1基因表达情况。【结果】水牛SFRP 1基因CDS区长927 bp,共编码308个氨基酸。多重序列比对结果显示,水牛SFRP 1基因氨基酸序列与黄牛、牦牛、山羊、虎鲸、黑猩猩、北极狐、猫、人、小鼠的相似性分别为100%、100%、99.65%、98.58%、98.23%、98.23%、98.58%、98.23%、96.45%,存在CRD_FZ、NTR_like和DUF3367结构域。水牛SFRP 1基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、山羊、牦牛、野牛、马鹿、野骆驼、猪、人的相似性分别为97.3%、95.9%、95.8%、94.5%、94.2%、93.7%、80.4%、78.5%和77.3%。系统进化树结果显示,水牛与黄牛、牦牛、野牛聚为一支。生物信息学分析结果显示,SFRP1蛋白呈碱性,为不稳定蛋白;第1—15位氨基酸处存在信号肽,为分泌型蛋白,存在跨膜结构,主要定位于细胞外;存在21个磷酸化位点和8个O-糖基化修饰位点。二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲构成;水牛、黄牛、人的SFRP1蛋白三级结构高度相似。成功构建pCMV-mcheery-SFRP1真核表达载体并转染水牛颗粒细胞,转染72 h后pCMV-mcheery-SFRP1重组质粒组细胞内SFRP 1基因表达量极显著高于对照组(P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,SFRP 1基因在水牛不同组织中均有表达,且在脾脏中表达量最高,极显著高于其他组织(P<0.01)。【结论】SFRP 1基因在不同物种以及遗传进化过程中具有高保守性,在水牛不同组织中广泛表达。研究结果为今后探究SFRP 1基因在水牛生长发育中的功能及分子机制奠定基础。

过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

背景:溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5,SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用,但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。目的:构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体,以建立稳定转染的RAW264.7细胞株,为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。方法:根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经Age I/Nhe I酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒,对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果;pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染,获得慢病毒原液进行包装和滴度测定;在此基础上,通过体外培养RAW264.7细胞,确定嘌呤霉素工作质量浓度;不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养,根据荧光强度确定转染效率;用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞,实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。结果与结论:(1)测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功;(2)过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×10~9 TU/mL,敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×10~9 TU/mL;(3)确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3μg/mL;(4)过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50;(5)过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调,而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明,成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。

双特异性磷酸酶-1对小胶质细胞极化及颞叶癫痫发作的影响

目的探讨双特异性磷酸酶-1(DUSP1)对小胶质细胞极化及颞叶癫痫(EP)发作的影响。方法采用慢病毒转染技术构建DUSP1正常表达组(DUSP1^(normal)组)、DUSP1高表达组(DUSP1^(over)组)、DUSP1低表达组(DUSP1^(low)组)小鼠,每组12只,将这些小鼠又分为DUSP1^(normal)+对照(Con)组、DUSP1^(normal)+EP组、DUSP1^(over)+Con组、DUSP1^(over)+EP组、DUSP1^(low)+Con组和DUSP1^(low)+EP组,每组6只。取DUSP1^(normal)+EP组、DUSP1^(over)+EP组及DUSP1^(low)+EP组小鼠分别腹腔注射氯化锂溶液(125 mg/kg)、硫酸阿托品溶液(1 mg/mL)及盐酸匹罗卡品溶液(50 mg/kg),构建颞叶EP模型。评估EP小鼠注射后2 h内EP发作等级,记录达到Ⅳ级的时间为潜伏期。将EP小鼠处死,取完整脑组织用于免疫荧光检测,取颞叶组织用于炎症细胞因子、DUSP1及小胶质细胞调控蛋白检测。结果与DUSP1^(normal)组比较,DUSP1^(over)组DUSP1/β-actin及DUSP1 mRNA表达水平均升高,DUSP1^(low)组DUSP1/β-actin及DUSP1 mRNA表达水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1^(normal)+EP组比较,DUSP1^(over)+EP组小鼠EP发作达Ⅳ级潜伏期明显延长,DUSP1^(low)+EP组小鼠EP发作达Ⅳ级潜伏期明显缩短,差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1^(normal)+Con组比较,DUSP1^(normal)+EP组小鼠颞叶组织中M1型小胶质细胞极化标志物CD16、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA水平均升高,炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均升高,IL-10水平降低,DUSP1诱导小胶质细胞极化相关蛋白p-胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2、p-c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p-p38蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与DUSP1^(normal)+EP组比较,DUSP1^(over)+EP组小鼠颞叶组织中M1型小胶质细胞极化标志物CD16、TNF-α、IL-1β和iNOS mRNA水平均降低,M2型小胶质细胞极化标志物CD206、转化生长因子-β、精氨酸酶1与几丁质酶样蛋白mRNA水平均升高,炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均降低,IL-10水平升高,DUSP1诱导小胶质细胞极化相关蛋白p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白表达水平均降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与DUSP1^(normal)+EP组比较,DUSP1^(low)+EP组小鼠颞叶组织中M1型小胶质细胞极化标志物TNF-α和iNOS mRNA水平均升高,炎症细胞因子TNF-α、IL-6水平均升高,IL-10水平降低,DUSP1诱导小胶质细胞极化相关蛋白p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白表达水平均升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论氯化锂溶液-盐酸匹罗卡品溶液点燃EP小鼠颞叶组织中DUSP1蛋白表达水平降低,高表达DUSP1基因能够延长小鼠EP发作的潜伏期,其机制可能涉及抑制p-ERK1/2、p-JNK和p-p38蛋白表达来调节小胶质细胞向M2型极化。

重组牛疱疹病毒1型转移载体的构建与初步应用

为构建一种能用于牛疱疹病毒1型(BHV-1)重组的转移载体,在真核表达载体pVAX1 CMV(cytomegalovirus)启动子的反向位点插入另一个CMV启动子,构建具有双向启动功能的表达载体prPP,在正、反向CMV启动子下游预置多克隆酶切位点;将绿色荧光蛋白标记基因置于反向启动子下,构建BHV-1重组载体prPgP;以BHV-1囊膜糖蛋白基因gE作为重组位点,将gE上下游同源臂插入prPgP载体中,牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E 2基因置于正向CMV启动子下,构建p△gErPgP-E2载体,用重组质粒转染已感染BHV-1的牛肾细胞(MDBK),产生的重组病毒经筛选、纯化、鉴定,命名为rBHV-1-△gE/E2,所含GFP和E 2基因正常表达。结果表明,重组载体prPgP能方便地用于BHV-1的重组,为相关研究及其疫苗研制提供了便捷。

靶向PD-1的shRNA慢病毒载体的构建

目的:设计以PD-1基因为靶点的短发夹状RNA(shRNA),构建重组慢病毒载体,鉴定此RNA干扰系列对PD-1基因表达的影响,从设计序列中筛选高(>90%)干扰效率的靶点序列(PD694/791)。方法:设计合成3种PD-1的shRNA干扰序列,与LV3载体连接,进行阳性鉴定,通过免疫印迹法(western)和阳性细胞数量检测筛选高干扰效率靶序列。结果:基于转染目的细胞的PD-1蛋白western检测结果,计算三种shRNA慢病毒载体的干扰效率分别为:PD791干扰效率为78%、PD 238干扰效率为8%、PD 694干扰效率88%。结论:成功构建靶向PD-1的shRNA慢病毒载体,其中干涉片段PD694和PD791对PD-1的干涉抑制效果显著,可以有效抑制原代T细胞PD-1表达,为研究开发PD-1抑制剂治疗肿瘤奠定基础。

LCMT1过表达对M2型巨噬细胞极化的影响

目的:通过慢病毒载体构建亮氨酸羟基甲基转移酶1(LCMT1)过表达THP-1细胞株,探讨LCMT1对THP-1细胞和THP-1源性巨噬细胞M2型极化的调控作用。方法:利用慢病毒技术,构建LCMT1过表达载体。设置blank组、OE-control组和OE-LCMT1组。荧光显微镜观察各组细胞的绿色荧光,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测各组细胞增殖情况,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测LCMT1 mRNA和蛋白表达水平以及PP2Ac甲基化相关蛋白表达水平。将THP-1细胞经100 nmol/L佛波酯(PMA)处理48 h后诱导分化为M0型巨噬细胞;M0型巨噬细胞经20 ng/mL白细胞介素4(IL-4)刺激48 h,诱导分化为M2型巨噬细胞。实时荧光定量PCR检测M2型巨噬细胞极化标志物c型甘露糖受体1(MRC-1)、CC趋化因子配体22(CCL22)、树突状细胞特异性细胞间黏附分子结合非整合素(CD209)的mRNA表达。结果:与blank组相比,OE-control和OE-LCMT1组表达绿色荧光,OE-control组的增殖曲线下降(P<0.001),LCMT1和PP2Ac甲基化相关蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05);与OE-control组相比,OE-LCMT1组增殖曲线下降(P<0.05),LCMT1和PP2Ac甲基化蛋白表达升高(P<0.05),PPME-1和PP2Ac去甲基化蛋白表达降低(P<0.01),总PP2Ac蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。与Blank M0组相比,Blank M2组的M2极化标志物MRC-1、CD209、CCL22 mRNA水平升高(P<0.05);与OE-control M2组比较,OE-LCMT1 M2组的M2极化标志物MRC-1、CD209、CCL22 mRNA水平降低(P<0.05)。结论:成功构建了LCMT1过表达的THP-1细胞株,LCMT1过表达可抑制THP-1细胞的增殖;维持总PP2Ac蛋白水平,增强PP2Ac甲基化并伴随PPME-1和PP2Ac去甲基化水平降低;下调M2型巨噬细胞极化标志物的表达,抑制M2型巨噬细胞极化。

血红素加氧酶1基因在小鼠肾足细胞中的表达及抗炎作用

目的构建血红素加氧酶1基因(HO-1)真核双表达载体pCDNA3.1-ho-1:t2a:egfp,并在小鼠肾足细胞MPC5中过表达,研究HO-1在脂代谢紊乱模型下的抗炎作用。方法取生长良好的人胚胎肾细胞HEK293t,提取总RNA反转录得到cDNA文库,扩增得到HO-1基因目的片段。将目的片段和载体进行双酶切,超滤管回收后T4-ligase连接,得到真核表达质粒命名为pCDNA3.1-ho-1:t2a:egfp。将载体进行菌液PCR、双酶切和测序鉴定后,转染小鼠肾足细胞MPC5,通过荧光显微镜和Western blot检测HO-1以及炎性因子表达情况。结果以HEK293t为来源扩增得到的目的片段凝胶电泳位置正确;筛选得到的载体菌液PCR、双酶切凝胶电泳以及测序结果正确;转染细胞后,荧光显微镜和Western blot结果显示质粒转染成功,并且减少了炎性因子IL-18、IL-1β表达。结论成功构建pCDNA3.1-ho-1:t2a:egfp双表达质粒,为糖尿病脂代谢紊乱细胞模型后续相关实验奠定基础。

犬β防御素-1真核表达载体的构建及其在HEK293T细胞中的表达

哺乳动物的β-防御素是一类具有广谱抗微生物活性的阳离子小肽。为了克隆和分析犬β防御素-1基因,并建立一套在HEK293T细胞中高效表达犬β防御素-1的方法,本研究采用RT-PCR方法从犬睾丸组织中扩增出犬β防御素-1(cBD-1)的cDNA基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建了犬β防御素-1基因的真核表达载体pcDNA3.1A-cBD-1,经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬β防御素-1基因序列与已发表序列(GenBank编号:NM-001024641)的同源性为99.7%。表达犬β防御素-1经Western-blot检测,证明构建的犬β防御素-1基因表达载体能够在真核细胞中表达,表达产物能够分泌到细胞外。为进一步研究犬β防御素的功能奠定了基础。

利用质粒介导的miRNA-1-2抑制H9C2中Hand2蛋白的表达

目的构建人miRNA-1-2的真核表达载体,并检测其对大鼠成肌细胞H9C2中Hand2蛋白表达的抑制作用。方法用PCR法体外合成miRNA-1-2前体序列的DNA模板,并定向插入到发夹RNA(hairpin RNA)表达载体pSilencer-4.1-neo上。用脂质体法将构建正确的重组质粒pSilencer-4.1/miRNA-1-2瞬时转染H9C2细胞,检测miRNA-1-2前体转录本(pre-miRNA-1-2)和miRNA-1靶基因Hand2(heart and neural crest derivatives expressed transcript 2)的表达。结果DNA测序表明重组质粒pSilencer-4.1/miRNA-1-2构建正确。pSilencer-4.1/miRNA-1-2转染的H9C2细胞中,pre-miRNA-1-2被有效表达,Hand2 mRNA表达无变化,Hand2蛋白表达被抑制。结论成功构建了miRNA-1-2的真核表达载体,由表达载体介导的miRNA-1能有效抑制Hand2蛋白的表达。

HIV-1包膜蛋白ENV慢病毒载体的构建及表达

目的:构建表达HIV-1包膜蛋白ENV的慢病毒载体,感染人胚肾细胞HEK293T,观察env基因在HEK293T中的表达。方法:通过点突变获得HIV-1 env完整基因,将env基因亚克隆至慢病毒穿梭载体pLVX-IRES-ZsGreen1的EcoRⅠ、XhoⅠ位点,构建重组质粒pLV-env,采用脂质体转染法转染HEK293T,经RT-PCR、Western blot检测目的基因表达,同时利用激光共聚焦技术对env基因的表达进行了定位。结果:成功获得了HIV-1 env基因,构建了重组慢病毒质粒pLV-env,RT-PCR、Western blot检测均表明外源基因能够表达,并具有抗原性,同时env基因表达后可以分泌到细胞膜表面膜上。结论:成功构建了含有HIV-1包膜蛋白env基因的重组慢病毒质粒,并验证了其表达,为下一步慢病毒的包装以及细胞模型和动物模型的构建奠定了基础。

人细胞间黏附分子1基因慢病毒干扰载体感染MCF-7细胞下调靶基因表达

目的构建人细胞间黏附分子1(ICAM-1)慢病毒干扰载体,包装病毒后,感染人乳腺癌细胞MCF-7并检测干扰效果。方法针对人ICAM-1基因设计并合成3条靶向短发夹RNA(shRNA)干扰序列(ICAM-1 shRNA1、ICAM-1 shRNA2和ICAM-1 shRNA3)以及一个阴性对照序列(NS),将其克隆入载体p LKO.1-SP6-PGK-GFP中,测序正确后利用3个质粒病毒包装系统(干扰质粒载体-ps PAX2-p MD2.G)转染HEK293T细胞并包装慢病毒。收获病毒上清并测定病毒滴度。将所获病毒感染MCF-7细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测干扰效率。结果菌落PCR结果显示目的片段成功插入p LKO.1-SP6-PGK-GFP载体中,DNA测序证实无误。将所制备之慢病毒感染MCF-7细胞,qRT-PCR和Western blot结果证实ICAM-1 shRNA3组ICAM-1 mRNA和蛋白水平有明显下降。结论成功构建了人ICAM-1基因shRNA慢病毒干扰载体,包装慢病毒后,感染MCF-7细胞可引起ICAM-1表达下调。

Gateway技术构建小鼠血管生成素-1慢病毒表达载体及其病毒包装

目的构建携带小鼠血管生成素-1(Ang-1)基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装。方法利用Gateway技术构建携带DsRed荧光蛋白的Ang-1慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,与辅助质粒pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4及pLV/helper-SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine 2000复合物,并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装,产生相应慢病毒颗粒,通过荧光表达情况来测定病毒滴度和感染效率。结果通过PCR、基因测序证实,Ang-1慢病毒表达载体PLV.Ex3d.P/puro-CMV>Ang-1>IRES/DsRed-Express2构建成功。经转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒,经测定病毒滴度为5×108TU/ml。结论成功构建Ang-1慢病毒表达载体,并包装出具高效感染力的慢病毒颗粒,为进一步研究Ang-1基因功能及基因治疗提供实验基础。

基质金属蛋白酶组织抑制剂1基因重组腺病毒载体的构建

目的为探讨基因治疗逆转或延缓椎间盘退变的可行性,构建及制备人基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1)cDNA重组腺病毒载体。方法以含TIMP1 cDNA序列的质粒为模板,通过PCR方法扩增TIMP1cDNA片段,将TIMP1 cDNA全长定向克隆到Ad5MaxTM腺病毒系统的穿梭质粒pDC316上,构建pDC316-TIMP1穿梭质粒;使用Ad5MaxTM腺病毒包装系统,脂质体介导的穿梭质粒及骨架质粒pBHGlox-E1,3Cre共转染HEK293细胞,同源重组构建含TIMP1 cDNA的重组腺病毒Ad5-TIMP1,通过PCR方法鉴定重组腺病毒Ad5-TIMP1的正确性。通过阴离子柱层析方法纯化重组腺病毒Ad5-TIMP1并测定重组腺病毒感染滴度。结果经PCR及酶切方法证实pDC316-TIMP1穿梭质粒中存在630 bp大小左右的插入片段,与目的基因TIMP1的cDNA大小一致;经PCR鉴定证实TIMP1 cDNA重组腺病毒载体Ad5-TIMP1构建成功,病毒感染性滴度为1×1010IU/mL。结论成功构建TIMP1 cDNA重组腺病毒载体,为应用基因治疗方法逆转或延缓椎间盘退变的研究奠定实验基础。

髓系触发受体-1基因RNAi慢病毒载体的构建及功能初步检测

目的:构建髓系触发受体-1(TREM-1)基因RNAi慢病毒载体,探讨TREM-1在脆弱类杆菌所致炎症反应中的作用。方法:根据小鼠TREM-1 mRNA序列选择4个靶序列并设计合成4对双链DNAoligo,其两端含酶切位点黏端,同时合成1对阴性对照双链DNA oligo;将以上5对双链DNA oligo退火后连入pGCSIL-GFP载体,经PCR及测序鉴定后,将以上质粒分别与包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Raw264.7细胞后,运用real-time PCR和ELISA检测TREM-1 mR-NA和蛋白表达水平。实时定量PCR和ELISA观察干扰TREM-1后脆弱杆菌内毒素引发的Raw264.7细胞内毒素血症模型中TREM-1的表达变化。结果:PCR和测序证实目的双链DNA oligo片段已被准确克隆到pGCSIL-GFP载体;各质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生了高滴度的慢病毒颗粒;各组慢病毒感染Raw264.7细胞后均可以显著抑制TREM-1的表达,以pGCSIL-GFP/Lenti-1组效果最明显。在脆弱杆菌内毒素引发的体外细胞内毒素血症模型中TREM-1表达明显增高,实时定量PCR表明慢病毒干扰载体能显著抑制模型中TREM-1的表达。结论:成功构建了小鼠TREM-1基因RNAi慢病毒载体,所构建的慢病毒载体能够抑制脆弱类杆菌内毒素所诱导的TREM-1的表达。

硫氧还蛋白1对胃癌细胞系BCG823生长的影响

目的探讨硫氧还蛋白1(thioredoxin-1,Trx1)对胃癌细胞系细胞周期及增殖速度的影响。方法对BCG823、AGS、MNK45、NUGC3、PHM82五种胃癌细胞系的质粒转染效率进行测定,选择出转染效率高的细胞系;并用实时PCR(RT-PCR)测定胃癌细胞系中Trx1的表达水平,选择出表达较低的细胞系。将所构建的Trx1真核重组表达载体pcDNA3.1myc-His-Trx1转染入上述实验筛选出的胃癌细胞系,使细胞中Trx1过表达,用流式细胞仪检测过表达Trx1的胃癌细胞进入S期的比例。结果 BCG823、AGS两种细胞系的转染效率高,满足实验需要。BCG823的Trx1表达较AGS低[BCG823细胞系的ΔCT(Trx-GAPDH)=1.43,AGS细胞系的ΔCT(Trx-GAPDH)=1.10,ΔCT值与表达量成反比],选择BCG823作为实验对象。转染pcDNA3.1myc-His-Trx1的细胞Trx1表达升高(与内参蛋白的比值为0.45±0.02和0.26±0.03,n=3,t=9.127,P=0.000),进入S期的细胞比例升高(转染带有Trx1质粒的细胞进入S期的比例为28.54%,而转染了空载体者进入S期的比例为22.24%,χ2=104.759,P=0.000)。结论 Trx1表达水平上调可以促进胃癌细胞进入S期。

DKK1在食管癌组织中的表达及其生物学功能

目的:探讨Dikkopf-1(DKK1)对食管癌细胞周期、侵袭能力的影响.方法:采用免疫组织化学的方法检测DKK1在食管癌组织中的表达,并通过免疫荧光对DKK1在细胞中的分布进行定位分析;应用Westernblot检测食管癌组织及其配对的正常食管组织和4株食管癌细胞系中DKK1蛋白表达水平.通过构建过表达DKK1的真核表达载体,将其转染到食管癌EC9706细胞中,观察细胞周期和侵袭能力的改变.结果:免疫组织化学检测食管癌组织中DKK1阳性表达率为83.34%,免疫荧光结果显示DKK1主要呈细颗粒状散在分布于细胞质中.Westernblot检测表明DKK1在食管癌组织中的表达明显高于配对的正常食管组织;在4株食管癌细胞系中均有不同程度的表达.在食管癌细胞系EC9706中过表达DKK1,S期细胞所占比例明显升高(57.25%vs45.87%,P<0.05),在Boyden小室中穿透基底膜的细胞数目也明显增加(252±6.71vs99.18±3.02;252±6.71vs112.33±3.21,均P<0.01).结论:DKK1在食管癌组织中呈高表达,并且在4个食管癌细胞系中均有表达,在EC9706细胞中过表达DKK1后能够促进细胞由G0/G1期向S期转变,同时能够增加细胞的侵袭能力.

FHD-1矢量质子磁力仪与温度相关性分析

通过矢量质子磁力仪FHD-1各分量北京时21点数据、日均值数据和室内记录的温度值作相关性分析,探讨温度对线圈和产出的数据是否有影响。