HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株的筛选及鉴定

背景乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)体外感染模型是开展HBV生命周期、致病机理、药物筛选等研究的基础.随着临床抗HBV治疗进入“功能性治愈”“完全治愈”新时代的趋势,对能稳定模拟共价闭合环状DNA分子(covalently closed circular DNA,cccDNA)转录机制,乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)致病机理的细胞模型的需求日益迫切.HBV1.3倍(1.3-fold HBV)全基因组包含了全部HBV生物信息,能依赖自身启动子启动转录过程,支持cccDNA形成和完整病毒复制,最接近于HBV体内感染状态下的生命周期.慢病毒转染是一种以慢病毒为载体,将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术,可形成稳定转染.目的采用慢病毒转染技术构建HBV 1.3倍基因组HepG2稳转细胞模型,筛选并鉴定出能稳定、高效表达HBV生物标志物的优势单克隆株.方法构建含1.3-fold HBV基因组信息的慢病毒质粒并包装慢病毒;以最佳感染复数(MOI)值将1.3-fold HBV慢病毒液侵染靶细胞HepG2,以抗生素杀稻瘟菌素(blasticidin,BSD)最佳筛选剂量筛选出稳定整合1.3-fold HBV基因的HepG2细胞系(1.3-fold HBV-HepG2),继而采用PCR法鉴定该细胞模型中的HBV DNA序列.将1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞进行培养并挑选出9株候选阳性单克隆,通过测序各单克隆细胞的侧翼序列,以确定9株候选阳性单克隆相应的基因组在HepG2细胞基因组中的插入位置,再根据各候选单克隆株表达HBsAg、HBeAg的水平,筛选出最优势单克隆株.将该优势单克隆株与HepG2.2.15细胞株分别持续培养20代,比较这两种细胞株表达HBsAg、HBeAg、HBx、cccDNA、HBV DNA等标志物的水平及稳定性.结果(1)将慢病毒pLenti-BSD-1.3-fold HBV以MOI=30的参数侵染HepG2细胞,72 h后加入BSD抗生素(终浓度1μg/mL)进行筛选,连续培养15-20 d后,获得1.3-fold HBV-HepG2稳转细胞系,PCR鉴定出HBV DNA序列;(2)在挑选出的9株候选阳性单克隆中,编号A14的细胞株(命名为HepGA14)的HBsAg、HBeAg表达水平最高,分别为24.28 IU/mL、39.62 NCU/mL,其插入HepG2基因组位置为1:166461695-166461715,确定为优势单克隆株;(3)与HepG2.2.15细胞株比较,HepGA14优势单克隆株1-20代能稳定、高表达HBsAg、HBeAg、HBx、HBV DNA、cccDNA,差异均具有统计学意义(P<0.05).结论成功构建并筛选出1.3-fold HBV基因组HepG2稳转细胞模型优势单克隆株HepGA14,这为后续开展HBV-宿主关系、发病机制及药物筛选等奠定良好的基础.

1.3倍乙型肝炎病毒全基因真核表达载体的构建及其在Bewo细胞中的表达

目的构建1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,并观察其在Bewo细胞中的表达。方法以质粒pMD18T-HBV上的HBV DNA序列为模板,构建1.3倍HBV全基因序列,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),用酶切、PCR及测序鉴定,并把该载体转染Bewo细胞,以Western免疫印迹、微粒子酶免疫分析法(MEIA)和荧光定量PCR法分别检测胞内和上清中HBsAg、HBeAg蛋白的表达及HBV DNA水平。结果通过酶切、PCR及测序鉴定,成功构建1.3倍HBV全基因表达载体,该载体可以在Bewo细胞系中表达和分泌HBsAg与HBeAg,并可检测到高水平的HBV DNA。结论成功构建了1.3倍HBV全基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBV1.3,为研究胞内HBV宫内感染奠定了基础。