10/11易位家族蛋白2和羟甲基化修饰在动脉粥样硬化中的作用及其机制

动脉粥样硬化(As)是心脑血管疾病的重要病理基础。近年来,许多研究表明表观遗传机制在As的调控中也起着重要作用。被称为DNA第6种碱基的5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)是染色体10/11易位家族蛋白(TET)介导DNA去甲基化产生的一种重要表观遗传修饰,参与多种生物学过程。最近研究表明,TET2及其介导的羟甲基化修饰不仅参与血管平滑肌细胞表型转化调控,还与内皮功能、炎症免疫反应等As的关键因素密切相关。在As斑块中也检测到TET2和5hmC明显缺失,缺失水平与损伤程度呈正相关。TET2和羟甲基化修饰可能在As的病理过程中发挥重要保护作用。本文将介绍TET2的结构及其功能、5hmC的研究概况及检测技术突破,重点阐述TET2及其介导的羟甲基化修饰在As中的作用及其机制,为As的有效防治提供新思路和新靶点。

胰腺导管腺癌中真核翻译起始因子5A2和基质金属蛋白酶-10、-11的表达

目的检测胰腺导管腺癌组织中真核翻译起始因子(EIF) 5A2、基质金属蛋白酶(MMP)-10和MMP-11表达,关注其相关性。方法 53例经病理医师确诊的胰腺导管腺癌为观察组,15例肿瘤周围正常胰腺组织为对照组。应用免疫组化法检测两组中EIF5A2、MMP-10和MMP-11蛋白的表达。结果两组EIF5A2、MMP-10和MMP-11表达差异有统计学意义(P<0. 05),观察组EIF5A2、MMP-10和MMP-11表达与Ki67指数和脉管累犯有关,EIF5A2表达与神经累犯密切相关,MMP-10和MMP-11表达与淋巴结转移相关(P<0. 05)。三者均与性别、年龄、分化程度及炎细胞浸润无关(P>0. 05)。观察组EIF5A2和MMP-10、EIF5A2和MMP-11表达呈正相关。结论胰腺导管腺癌中EIF5A2、MMP-10、MMP-11三者高表达可以促进肿瘤的形成和进展,EIF5A2与MMP-10、MMP-11可能具有正向协同作用。

S100A11,一种多生物学功能的Ca^(2+)结合蛋白

S100蛋白在饱和硫酸铵溶液中可100%溶解,该家族包括25个成员,为EF手型Ca2＋结合蛋白,分子量约10-12kD,仅存在于脊椎动物中,以二聚体或多聚体的形式存在。S100家族成员的序列同源性在16%-98%之间,大部分编码基因位于染色体1q21,但S100B、S100G、S100P和S100Z的基因编码区分别位于21、X、4和5号染色体[1]。S100蛋白的结构差异不大,但表达位置、水平及生物学作用却大不相同。

Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌1例及文献分析

目的:探讨Xp11.2易位/结合免疫球蛋白重链恒定区μ基因增强子的转录因子3(transcriptionfactor binding to IGHM enhancer 3,TFE3)基因融合相关性肾癌的临床病理特点。方法:报道1例Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌,并进行临床资料分析、病理组织形态及免疫组织化学观察。并复习相关文献报道。结果:患者男,16岁,因右腰痛及无痛性全程血尿4 d,肿瘤大小约3.0 cm×2.5 cm×2.0 cm,切面灰褐色、质软;光镜下可见肿瘤主要由细胞间分界清楚的肿瘤细胞排列呈纤细乳头状。肿瘤细胞胞浆丰富、透亮,呈嗜酸性红染,核染色质呈泡状,核仁明显。核分裂少见。可见沙砾体状钙化。免疫组织化学结果显示:肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)、TFE3阳性;细胞角蛋白(cytokeratin,CK)、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen,EMA)及波形蛋白(vimentin)灶状阳性;白细胞分化抗原34(cluster of differentiation 34,CD34)、黑素瘤标记物抗体-45(melanoma marker antibody,HMB-45)及结蛋白(desmin)均为阴性。结论:Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌少见,好发于儿童及青年人,临床常见肉眼血尿,免疫组织化学、荧光原位杂交及核型分析有助于诊断及鉴别诊断。治疗采用根治性肾脏全切术,预后不明确。

非小细胞肺癌组织SOCS2、SLC7A11表达变化及其与三维适形放疗效果的关系

目的观察非小细胞肺癌(NSCLC)组织细胞因子信号转导抑制因子2(SOCS2)、胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(SLC7A11)的表达变化,并探讨其与患者临床特征及三维适形放疗效果的关系。方法选取拟行三维适形放疗的NSCLC患者90例(留取穿刺活检获取的部分癌组织),同期因肺错构瘤行手术治疗的患者40例(留取术中获取的正常肺组织)。采用免疫组化法检测NSCLC组织及正常肺组织SOCS2、SLC7A11阳性表达情况,并分析NSCLC组织中两者的相关性,比较不同临床特征的NSCLC患者癌组织SOCS2、SLC7A11阳性表达率。评价NSCLC患者三维适形放疗的疗效,多因素Logistic回归分析癌组织SOCS2、SLC7A11表达对疗效的影响。结果NSCLC组织SOCS2阳性表达率为24.44%、SLC7A11阳性表达率为77.78%,正常肺组织分别为95.00%、10.00%,两组比较P均<0.05。NSCLC组织SOCS2、SLC7A11阳性表达率呈负相关关系(r=-0.669,P<0.05)。TNM分期ⅢA期、高中分化、无淋巴结转移的NSCLC患者癌组织SOCS2阳性表达率分别高于TNM分期ⅢB期、低分化、淋巴结转移者,而SLC7A11阳性表达率分别低于TNM分期ⅢB期、低分化、淋巴结转移者(P均<0.05)。90例NSCLC患者三维适形放疗有效60例、无效30例。三维适形放疗有效的NSCLC患者癌组织SOCS2、SLC7A11阳性表达率分别为31.67%、70.00%,无效者分别为10.00%、93.33%,两者比较P均<0.05。癌组织SLC7A11阳性是影响NSCLC患者三维适形放疗疗效的独立危险因素、癌组织SOCS2阳性是其独立保护因素(P均<0.05)。结论NSCLC组织SOCS2表达降低而SLC7A11表达升高,两者共同参与了NSCLC的发生发展并且可以影响患者的三维适形放疗疗效。

PRR11、HMGA2、ANXA10对结直肠癌TME术后早期复发的预测效能探讨

背景近年来我国结直肠癌(colorectal cancer,CRC)发病率在恶性肿瘤中占第3位,死亡率占第5位.临床多采用全直肠系膜切除治疗,结直肠癌患者5年生存率具有明显改观,但每年仍有部分患者发生肿瘤复发与转移,其具体原因尚未完全明确.目的探讨富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11,PRR11)、高迁移率族蛋白A2(high mobility group AT-hook 2,HMGA2)、膜联蛋白A10(annexinA10,ANXA10)对CRC全直肠系膜切除(total mesorectal excision,TME)术后早期复发的预测效能.方法选取2016-03/2020-03我院收治的231例CRC患者进行前瞻性研究,均行TME治疗,根据术后1年复发情况分为复发组、未复发组.比较两组基线资料、PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA,并比较不同PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA水平者复发率,采用多因素Logistic回归方程分析术后复发的相关影响因素,采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)曲线及曲线下面积(area under the curve,AUC)分析各指标预测术后复发的效能.结果复发组N分期、手术切缘、淋巴结清扫数目、PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA与未复发组比较,差异有统计学意义(P<0.05);PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA:N0<N1<N2,ANXA10 mRNA:N0>N1>N2,两两比较差异有统计学意义(P<0.05);不同PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA水平者复发率比较,差异有统计学意义(P<0.05);PRR11 mRNA、HMGA2 mRNA、ANXA10 mRNA与术后复发相关(P<0.05);各指标联合预测复发的AUC高于单一预测(P<0.05).结论CRC患者PRR11、HMGA2、ANXA10表达与TME术后早期复发明显密切相关,对预后生存情况具有一定指导意义,可作为分子标志物协助临床治疗.

醛酮还原酶家族1成员B10过表达的宫颈癌细胞株Hela增殖、周期、侵袭和迁移观察

目的观察醛酮还原酶家族1成员B10(AKR1B10)过表达的宫颈癌细胞增殖、周期侵袭和迁移情况。方法将Hela细胞分为观察组和对照组,观察组用慢病毒系统转染AKR1B10过表达质粒,对照组转染空质粒。采用Western blotting法检测两组细胞AKR1B10、p53、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、波形蛋白(Vimentin)蛋白;采用MTT法、克隆形成实验观察两组细胞增殖情况,结果分别用OD570、形成细胞克隆数量表示;采用流式细胞术检测两组细胞周期分布;采用划痕实验观察两组细胞迁移情况,结果以划痕愈合百分比表示;采用Transwell小室实验观察两组细胞侵袭情况,结果以穿膜细胞数表示。结果观察组细胞AKR1B10蛋白相对表达量高于对照组(P<0.05)。MTT法测得继续培养24、48、72 h观察组细胞OD570均低于对照组(P均<0.05),克隆形成实验观察组克隆数量少于对照组(P<0.05)。与对照组相比,观察组G0~G1期细胞比例上升(P<0.05),G2~M期和S期细胞比例下降(P均<0.05)。观察组划痕愈合百分比低于对照组(P<0.05)。观察组穿膜细胞数低于对照组(P<0.05)。观察组p53蛋白相对表达量高于对照组(P<0.05),MMP-2和Vimentin蛋白相对表达量均低于对照组(P均<0.05)。结论 AKR1B10过表达可抑制宫颈癌Hela细胞增殖、侵袭和迁移,阻滞细胞周期于G0~G1期,p53、MMP-2和Vimentin途径可能在其中发挥作用。

淫羊藿苷调节Nrf2/SLC7A11/GPX4信号通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响

目的:探讨淫羊藿苷调节核转录E2相关因子2(Nrf2)/溶质载体蛋白7家族成员11(SLC7A11)/谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)通路对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的影响。方法:将小胶质细胞(BV2)分为对照组(5.5 mmol·L^(-1)葡萄糖)、高糖组(35 mmol·L^(-1)葡萄糖)、淫羊藿苷低(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+0.37μmol·L^(-1)淫羊藿苷)、高(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+1.48μmol·L^(-1)淫羊藿苷)剂量组、抑制剂组(35 mmol·L^(-1)葡萄糖+1.48μmol·L^(-1)淫羊藿苷+1μmol·L^(-1)的Nrf2抑制剂ML385)。采用CCK-8法检测细胞增殖,进行细胞形态学观察,用超氧化物阴离子荧光探针(DHE)、氟硼二吡咯(BODIPYTM)检测细胞内活性氧(ROS)、脂质过氧化(LPO)水平,特异性荧光探针检测细胞内活性铁含量,Western Blot检测细胞Nrf2、SLC7A11、GPX4、血红素加氧酶1(HO-1)、环氧合酶2(COX2)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)蛋白的表达。结果:与对照组比较,高糖组的BV2细胞形态不规则,出现细胞碎片,细胞光密度(OD450)值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达明显降低(P<0.05),ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达显著升高(P<0.05);与高糖组比较,低、高剂量淫羊藿苷组的BV2细胞损伤减少,细胞OD450值、Nrf2、SLC7A11、GPX4、HO-1表达升高(P<0.05),ROS和LPO水平、活性铁含量、COX2、ACSL4表达降低(P<0.05);与高剂量淫羊藿苷组比较,抑制剂组减弱了淫羊藿苷对高糖诱导的小胶质细胞铁死亡的抑制作用。结论:淫羊藿苷通过激活Nrf2/SLC7A11/GPX4通路从而抑制高糖诱导的小胶质细胞铁死亡。

成纤维细胞生长因子2通过抑制TET2/UQCRH表达拮抗血管平滑肌细胞凋亡和促进其增殖

[目的]探讨10-11转位蛋白2(TET2)/泛醌细胞色素C还原酶铰链蛋白(UQCRH)轴在成纤维细胞生长因子2(FGF-2)抑制血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡中的作用。[方法]正常培养的VSMC分为对照组、FGF-2组、FGF-2+成纤维细胞生长因子受体(FGFR)泛抑制剂LY2874455组。TET2基因过表达(OETET2)或UQCRH基因过表达(OEUQCRH)的VSMC分为对照组、FGF-2组、OETET2+FGF-2组或OEUQCRH+FGF-2组。采用Hoechst33342和PI染色检测细胞凋亡,CCK-8实验检测细胞增殖,Western blot检测凋亡相关蛋白pro-Caspase-3、cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2及TET2、UQCRH表达水平。运用NCBI、methprimer网站预测分析UQCRH基因启动子CpG岛位点。[结果]FGF-2可抑制VSMC凋亡、促进其增殖,下调促凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3、Bax和TET2、UQCRH表达,上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达(与对照组相比,P<0.05),但不影响pro-Caspase-3表达(与对照组相比,P>0.05),LY2874455可对抗FGF-2的作用(与FGF-2组相比,P<0.05)。TET2或UQCRH过表达可逆转FGF-2对VSMC抗凋亡、促增殖的作用,促进促凋亡相关蛋白表达上调,抗凋亡蛋白表达下调(与FGF-2组相比,P<0.05)。UQCRH基因启动子区域存在3个CpG岛。过表达TET2能上调FGF-2处理的VSMC中UQCRH表达(与FGF-2组相比,P<0.05)。[结论]FGF-2通过抑制TET2和UQCRH表达,减少VSMC凋亡,促进其增殖。

溃疡性结肠炎组织中TET2的表达水平与患者预后的关系

目的探究溃疡性结肠炎(UC)组织中DNA甲基胞嘧啶双加氧酶10-11易位2(TET2)的表达水平与患者预后的关系。方法选择2018年10月至2019年10月在遂宁市中心医院就诊的102例UC患者作为研究对象。采用蛋白质印迹法检测UC组织中TET2的表达水平,并分析其与UC患者预后的关系。结果102例UC患者中有41例(40.20%)预后不良。根据预后情况将患者分为预后良好组(n=61)和预后不良组(n=41)。预后良好组TET2的表达水平低于预后不良组,差异有统计学意义(P<0.05)。多因素logistic回归分析结果显示,改良Mayo评分、IL-1β、TET2和初次治疗应用糖皮质激素均是UC患者预后的独立危险因素(P均<0.05)。模型B(由改良Mayo评分、IL-1β、TET2和初次治疗应用糖皮质激素组成)评估UC患者预后的效能高于模型A(由改良Mayo评分、IL-1β和初次治疗应用糖皮质激素组成),差异有统计学意义(P<0.05)。当阈值概率>10%时,模型B评估UC患者预后的净收益高于模型A。结论UC组织中TET2的表达水平与患者预后有关。基于TET2构建的模型对于评估UC患者的预后情况具有一定价值。

Xp11.2易位相关性肾细胞癌的临床特点

目的总结Xp11.2易位相关性肾细胞癌的临床特点,探讨Xp11.2易位相关性肾细胞癌的诊断治疗思路。方法收集山东大学齐鲁医院泌尿外科2011～2012年3例Xp11.2易位相关性肾细胞癌患者的临床及随访资料,对术后标本处理后进行分析总结,并结合文献资料复习。结果 3例患者中,2例因无痛性肉眼血尿检查发现,1例因健康查体发现。3例患者CT扫描结果示肾脏肿块平均4 cm×5 cm,肿块内均可见点状钙化,增强扫描后呈不均匀强化。免疫组织化学和RT-PCR均证实为Xp11.2易位相关性肾细胞癌。结论 Xp11.2易位相关性肾细胞癌的有效治疗方案仍在研究探索中。

microRNA-210-3p通过调控TET2的表达抑制大鼠炎性疼痛

目的探讨microRNA-210-3p(miR-210-3p)与10-11易位蛋白2(ten-eleven translocation 2,TET2)在完全弗氏佐剂(complete freund's adjuvant,CFA)诱导的大鼠炎性疼痛模型中的作用及其相互调控机制。方法通过生物信息学方法和双荧光素酶实验,分析并确定大鼠miR-210-3p中可以靶向调节的基因。实验中的质粒和miR-210-3p共转染组合分为pmirGLO+mimics NC组、pmirGLO+mimics-miR-210-3p组、TET2-WT-pmirGLO+mimics-NC组、TET2-WT-pmirGLO+mimics-miR-210-3p组、TET2-MT-pmirGLO+mimics-NC组和TET2-MT-pmirGLO+mimics-miR-210-3p组;60只大鼠按随机数字表法分为正常对照(normal control,CON)组(n=20)、CFA组(n=20)、CFA+腺相关病毒载体阴性对照(adeno-associated virus negative control,AAV NC)组(n=10)、CFA+AAV miR-210-3p抑制剂(adeno-associated virus miR-210-3p inhibitor,AAVi)组(n=10)。通过在大鼠左后足底部皮下注入CFA的方式建立大鼠炎性疼痛模型;通过尾静脉注入miR-210-3p inhibitor的AAV建立干预模型;观察并测量大鼠行为学;采用RT-qPCR法检测miR-210-3p的表达量;采用Western blotting法和免疫荧光染色法检测L4~L6腰膨大节段脊髓中TET2蛋白的表达水平及荧光强度的变化;采用免疫荧光染色法观察TET2蛋白在大鼠脊髓中的细胞表达定位。结果生物信息学方法发现,TET2基因3'UTR区域存在与miR-210-3p的结合位点;双荧光素酶报告基因实验证实了miR-210-3p与TET2基因之间存在结合位点,呈负向调控关系;注射CFA显著减小了大鼠的机械缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)和热缩足潜伏期(paw thermal withdrawal latency,PTWL)(P<0.05);CFA组大鼠脊髓腰膨大中miR-210-3p的表达水平明显上调,伴随着TET2的表达水平降低(P<0.05);免疫荧光结果显示,TET2蛋白主要和神经元细胞存在共定位:CFA组大鼠脊髓内TET2蛋白表达水平降低(P<0.05);经过AAVi干预后,CFA+AAVi组大鼠在各个时间的PWMT和PTWL较CFA+AAV NC组大鼠升高(P<0.05);CFA+AAVi组大鼠脊髓组织中TET2蛋白表达较CFA+AAV NC组升高(P<0.05)。结论miR-210-3p可以抑制TET2蛋白表达,通过抑制miR-210-3p在炎性疼痛大鼠中的表达可以有效减轻炎性疼痛。

自拟健脾益气方药的抗抑郁作用及其机制研究

目的 探讨自拟健脾益气方药(SMP-SSRQ)的抗抑郁作用及其机制。方法 建立慢性不可预知性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁小鼠模型,随机分为正常组、模型组、SMP-SSRQ低、中、高剂量组(8、16、32 mg·kg^(-1)),每组12只。正常对照组与模型组动物给予同体积的生理盐水,SMP-SSRQ各剂量组分别给予相应剂量的药物。均采用灌胃给药,每天2次,连续给药2周。通过旷场、糖水消耗、强迫游泳和悬尾等实验检测动物的不同行为学指标;采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测各组小鼠大脑前额叶皮质和海马组织中免疫球蛋白超家族11(Igsf11)、蛋白质二硫键异构酶2(Pdia2)、生育酚结合蛋白(Sec14l2)mRNA及蛋白水平的表达变化。结果 与模型组比较,SMP-SSRQ各治疗组均可增加抑郁小鼠的水平移动格数、直立次数以及糖水偏好指数(P<0.05),降低强迫游泳和悬尾不动时间,明显改善抑郁症状;低、高剂量的SMPSSRQ能明显降低抑郁小鼠大脑皮层前额叶与海马组织中Igsf11、Pdia2、Sec14l2 mRNA及蛋白的表达水平,与模型组比较差异有显著性(P<0.05)。结论 SMP-SSRQ可有效改善小鼠的抑郁行为,机制可能与其下调小鼠皮层和海马组织中的Igsf11、Pdia2、Sec14l2的mRNA及其蛋白水平有关。

右美托咪定通过抑制铁死亡发挥对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

目的:脑卒中是危害人类生命健康的重大疾病之一,其中缺血性脑卒中的发病率占脑卒中的70%以上。缺血性脑卒中引起的脑缺血再灌注(ischemia reperfusion,IR)损伤的发生机制极为复杂。右美托咪定作为临床上常用的麻醉辅助用药,其在对抗脑IR损伤中的作用近年来被广泛研究,但具体作用机制尚未阐明。因此,本研究基于铁死亡探讨右美托咪定对抗小鼠脑IR损伤的作用及机制。方法:采用改良线栓法制备小鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。将雄性ICR小鼠随机分成:假手术(sham)组、IR组、IR+D1组(给予IR和25μg/kg的右美托咪定)、IR+D2组(给予IR和50μg/kg的右美托咪定)、IR+D3组(给予IR和100μg/kg的右美托咪定)、IR+D2+ML385组(给予IR、50μg/kg的右美托咪定和30 mg/kg的ML385)。采用Longa五分法进行小鼠神经行为学评分;2,3,5-三苯基四唑氮(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法检测小鼠脑梗死体积;蛋白质印迹法检测小鼠脑组织中核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TFR1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)及胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)蛋白质的表达水平。使用透射电镜观察线粒体形态。检测小鼠脑组织中MDA、GSH和Fe^(2+)的含量。结果:与sham组相比,IR组小鼠神经行为学评分、脑梗死体积、MDA和Fe^(2+)含量明显增加,TFR1蛋白质表达水平明显升高,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白质表达水平显著降低(均P<0.05),脑组织神经细胞中的线粒体皱缩,嵴减少,膜密度增加;使用右美托咪定预处理后,相较于IR组,小鼠神经学行为评分、MDA和Fe^(2+)含量、TFR1蛋白质表达水平显著降低,脑梗死体积明显缩小,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白质表达水平显著升高(均P<0.05),线粒体受损情况显著改善;而在用右美托咪定预处理的基础上使用ML385后,与IR+D2组相比,小鼠的神经行为学评分、脑梗死体积、MDA和Fe^(2+)含量明显增加,TFR1蛋白质表达水平明显升高,GSH含量、SLC7A11和GPX4蛋白质表达水平显著降低(均P<0.05),线粒体再次出现明显受损。结论:右美托咪定对脑IR损伤小鼠的保护作用与抑制铁死亡有关,其对铁死亡的抑制作用可能是通过调控Nrf2的表达实现的。

ADLI大鼠肝组织DNA羟甲基化变化及其机制

目的探讨抗结核药物性肝损伤(ADLI)形成过程中DNA羟甲基化变化及其机制。方法选择SD大鼠96只,随机分为异烟肼组、对照组各48只。异烟肼组给予异烟肼55 mg/(kg·d)灌胃,对照组给予等体积蒸馏水灌胃。两组分别于灌胃3、7、10、14、21、28天各随机取8只,麻醉后心脏取血,检测血浆ALT、AST;处死后留取肝组织,HE染色,观察肝组织病理变化;采用RT-PCR法检测肝组织谷胱甘肽S-转移酶P1(GSTP1)基因C、甲基胞嘧啶(5m C)、氧化成羟甲基胞嘧啶(5hm C)含量;采用ELISA法检测肝组织10-11易位蛋白1(TET1)蛋白表达,RT-PCR法检测TET1 mRNA表达。结果随着给药时间延长,异烟肼组肝损伤程度逐渐加重;其GSTP1基因C含量随着肝损伤程度加重呈下降趋势,而5m C含量先上升,至灌胃14天略有回落,随后继续上升;5hm C含量呈现下降趋势,至灌胃21天降至最低,灌胃28天时略有回升;而TET1蛋白水平及其mRNA表达与5hm C含量变化基本一致。结论 DNA羟甲基化可能参与了ADLI的发生。

大鼠脊髓神经元细胞核中TET3与OGT相互作用的分析与鉴定

目的分析与鉴定大鼠脊髓神经元细胞核中10-11易位蛋白3(TET3)与氧连氮-乙酰葡萄糖胺转移酶(OGT)的相互作用。方法原代培养大鼠脊髓神经元并提取总RNA,采用RT-PCR法获得TET3和OGT基因片段。采用DNA重组技术在TET3、OGT蛋白编码序列的羧基端融合Flag和HA标签蛋白,构建pcDNA3.0-TET3-Flag-HA和pcDNA3.0-OGT-Flag-HA重组融合蛋白质粒,经双酶切验证后分别转染大鼠脊髓神经元。48 h后提取神经元核蛋白,采用Western blot法验证融合蛋白TET3-Flag-HA和OGT-Flag-HA;采用串联亲和纯化法富集与TET3或OGT结合的蛋白复合物,经电泳分离和质谱分析筛选出与TET3或OGT相互作用的候选蛋白,并采用免疫共沉淀进行验证。结果证实重组融合蛋白质粒pcDNA3.0-TET3-Flag-HA和pcDNA3.0-OGT-Flag-HA构建成功,融合蛋白TET3-Flag-HA和OGT-Flag-HA在大鼠脊髓神经元细胞核中表达。在大鼠脊髓神经元细胞核中,与TET3相互作用蛋白是OGT,与OGT相互作用蛋白包括TET3和视网膜母细胞瘤结合蛋白5。结论TET3与OGT在大鼠脊髓神经元细胞核中形成复合体,可能参与调控相关功能蛋白的转录表达。

过表达miR-17—92基因簇对前列腺癌细胞生物学特性的影响及机制

目的探讨过表达miR-17-92基因簇对前列腺癌细胞生物学特性的影响及潜在机制。方法采用过表达miR-17-92基因的质粒转染包装细胞，并构建过表达miR-17-92基因簇的前列腺癌DU145-17-92细胞。采用xCelligence系统实时动态监测DU145-control和DU145-17-92细胞的生长能力，采用Ki-67抗原检测技术和原位末端转移酶标记技术（TUNEL）分别检测DU145-control和DU145-17-92细胞中细胞增殖和凋亡情况，采用流式细胞术分析DU145-control和DU145-17-92细胞的细胞周期，采用Western blot检测DU145-control和DU145-17-92细胞中凋亡相关蛋白和增殖相关蛋白的表达。结果xCelligence系统监测显示，从接种24 h后，DU145-17-92细胞的生长速度显著高于DU145-control细胞（P〈0.01）。细胞培养24、48、72 h后，DU145-control组的Ki-67阳性细胞率分别为（56.57±1.68）%、（85.48±0.26）%和（90.85±2.08）%，DU145-17-92组的Ki-67阳性细胞率分别为（73.64±0.68）%、（93.43±1.23）%和（97.36±0.86）%，两组仅在培养24 h时差异有统计学意义（P〈0.01）。细胞培养24、48、72 h后，DU145-control组的细胞凋亡率分别为（6.76±0.09）%、（14.51±0.86）%和（20.73±1.64）%，DU145-17-92组的细胞凋亡率分别为（1.86±0.15）%、（7.90±0.40）%和（4.92±0.48）%，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。Western blot检测显示，DU145-control和DU145-17-92细胞中，Bcl-2家族促凋亡蛋白（BIM）的表达水平分别为0.83±0.00和0.16±0.00, 人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）蛋白的表达水平分别为0.91±0.00和0.13±0.00，差异均有统计学意义（均P〈0.01）。过表达miR-17-92基因簇促进了蛋白激酶B（Akt）中丝氨酸473位点（p-Akt-473）的磷酸化，但对308位点（p-Akt-308）的磷酸化无明显影响。DU145-control和DU145-17-92细胞中磷酸化细胞外信号调节激酶（p-ERK）蛋白的表达水平分别为0.21±0.01和0.72±0.01，差异有统计学意义（P〈0.01）。结论过表达miR-17-92基因簇能显著影响DU145细胞的生长、增殖、凋亡和细胞周期等生物学特性，这与凋亡调控相关蛋白BIM和抑癌蛋白PTEN表达的下调有关，Akt和ERK信号通路的活化及凋亡相关蛋白表达水平的失调也起着重要的作用。

大鼠脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤时TET3诱导DNA去甲基化在甲烷上调Nrf2表达中的作用

目的评价大鼠脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤时10-11易位蛋白3(TET3)诱导DNA去甲基化在甲烷上调核转录因子E2相关因子2(Nrf2)表达中的作用。方法原代培养大鼠脊髓神经元,以1×10^5个/ml密度接种于6孔板,采用随机数字表法分为5组(n=48):正常对照组(C组)、氧糖缺失-复氧复糖组(OGD/R组)、甲烷组(M组)、甲烷+TET3-siRNA组(M+siTET3组)和甲烷+阴性siRNA组(M+siCon组)。采用无糖-无血清Earle平衡盐液,在5%CO2-95%N2缺氧培养箱中孵育2 h ,然后正常培养的方法制备氧糖缺失-复氧复糖损伤模型。M组于复氧复糖时在培养液中加入200 μl甲烷饱和生理盐水(甲烷终浓度1.8 mmol/L);M+siTET3组和M+siCon组于复氧复糖前24 h时分别加入100 pmol/L TET3-siRNA和100 pmol/L阴性siRNA进行转染。复氧复糖12 h时,测定神经元存活率、LDH漏出率、神经元凋亡率,采用实时荧光定量PCR法检测TET3和Nrf2的mRNA表达,采用Western blot法测定核蛋白Nrf2和TET3表达水平;采用ELISA法测定神经元SOD、过氧化氢酶(CAT)和MDA含量。提取神经元DNA,采用ELISA法确定DNA甲基化率、羟甲基化率,采用实时荧光甲基化特异性PCR法检测Nrf2基因启动子CpG岛甲基化水平。结果与C组比较,OGD/R组神经元存活率降低,LDH释放率和凋亡率升高(P<0.01);与OGD/R组比较,M组神经元存活率升高,LDH释放率和凋亡率降低,TET3及其mRNA、Nrf2及其mRNA表达上调,DNA羟甲基化率、SOD和CAT含量升高,DNA及Nrf2启动子甲基化率、MDA含量降低(P<0.05或0.01);与M组比较,M+siTET3组神经元存活率降低,LDH释放率和凋亡率升高,TET3及其mRNA、Nrf2及其mRNA表达下调,DNA羟甲基化率、SOD和CAT含量降低,DNA及Nrf2启动子甲基化率、MDA含量升高(P<0.05或0.01),M+siCon组上述指标比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论大鼠脊髓神经元氧糖缺失-复氧复糖损伤时甲烷上调Nrf2表达的机制与激活TET3,促进Nrf2启动子区DNA去甲基化有关。

青蒿琥酯联合硼替佐米对急性髓系白血病细胞体外凋亡、自噬的影响及其作用机制

目的探讨青蒿琥酯联合硼替佐米对急性髓系白血病(AML)细胞株MV4-11细胞增殖、凋亡及自噬的影响及其作用机制。方法 MTT法检测青蒿琥酯、硼替佐米单用及两药联合对MV4-11细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞内Bcl-2家族蛋白(Bcl-2、Mcl-1、Bim、Bax)、cleaved-Caspase-3及自噬相关蛋白LC3B的表达。结果青蒿琥酯呈浓度和时间依赖性抑制MV4-11细胞增殖,作用48 h的IC50为1.44 μg/ml。硼替佐米呈浓度依赖性抑制MV4-11细胞增殖,作用48 h的IC50为8.97 nmol/L。青蒿琥酯(0.75、1.0 μg/ml)与硼替佐米(6、8 nmol/L)联合作用48 h,对MV4-11细胞的增殖抑制率均高于单药组(P值均<0.05),两药相互作用的协同指数(CI)均<1。1.5 μg/ml青蒿琥酯作用MV4-11细胞48 h的凋亡率为(15.27±2.18)%,8 nmol/L硼替佐米作用MV4-11细胞48 h的凋亡率为(19.85±3.23)%,两药联合作用后凋亡率增高至(81.67±5.96)%,显著高于单药组(P值均<0.05)。两药联合作用MV4-11细胞24 h后细胞内cleaved-Caspase-3、促凋亡蛋白Bim及自噬相关蛋白LC3B表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。结论青蒿琥酯联合硼替佐米具有协同抑制MV4-11细胞增殖和诱导凋亡及促进自噬的效应,作用机制可能与Bcl-2家族蛋白表达的改变有关。